DNS-szintézis difoszfát szubsztrátokból DNS-polimerázok segítségével

Eredmények és vita

Azzal kezdtük, hogy teszteltük a Taq (Thermus aquaticusból), a nagy hűségű Vent (exo-, Thermococcus litoralisból), Pfu (exo+, Pyrococcus furiosusból), Deep Vent (exo+, Pyrococcus sp. GB-D) és Q5 (exo+) DNS-polimerázok hagyományos polimeráz láncreakciókban (PCR) dezoxiribonukleozid-monofoszfát (dGMP), dNDP-k és dNTP-k mint szubsztrátokkal (1. ábra A és B). A dNDP-k bármelyikének dNTP-vel való helyettesítése támogatta a robusztus DNS-szintézist, és további kísérletek két, három vagy mind a négy dNDP-vel a dNTP-k helyett a PCR-t támogatták. Annak biztosítására, hogy a termékek nem szennyező dNTP-kből származnak, és hogy a reakciókat nem fokozzák a kereskedelmi pufferekben vagy enzimkészletekben jelen lévő stabilizátorok, házilag készített pufferekkel és enzimekkel teszteltük a tisztított dNDP-kből történő DNS-szintézist. Bakteriális replikatív enzimeket is bevontunk, például a termofil Bacillus stearothermophilus (Bst) és a mezofil Bacillus subtilis (Bsu, nagy töredék) bakteriális replikatív DNS-polimerázait. Ezek, valamint a Thermococcus kodakensis (KOD), Thermococcus sp. 9°N (9°N) és Thermococcus gorganarius (Tgo) archaikus polimerázok mindössze 100 µM tisztított dNDP-vel 60 °C-on robusztus primerhosszabbítást mutattak (kivéve a Bsu-t, amelyet minden esetben 37 °C-on teszteltünk) (1C. ábra). A primer-hosszabbítási reakciók mindezen enzimek esetében hatékonyak voltak, különösen a Deep Vent, a KOD és a 9°N esetében. A dA és dC beépülése előtt a naszcens oligonukleotidba szünetet figyeltünk meg (1. ábra C és D), ami arra utal, hogy a dADP és dCDP KM-értékei elég magasak ahhoz, hogy 100 µM szubsztrátkoncentráció mellett lelassítsák a primer hosszabbítást.

A reakció mechanisztikájának megismerése érdekében először a Taq enzim segítségével vizsgáltuk annak hatékonyságát. A hosszabbítás hőmérsékletének 50 °C-ról 72 °C-ra történő változtatása nem eredményezett megfigyelhető különbséget a teljes hosszúságú termék mennyiségében. A kinetikai elemzések egyszerűsítése érdekében minden PCR-reakciót kétlépéses hőmérsékletciklikus protokollal végeztünk, amelyben a primert az első lépésben 72 °C-on lágyítottuk és hosszabbítottuk, a második lépésben pedig 95 °C-on olvasztottuk a duplexet (S1A ábra). A dNDP felhasználási sebességének a kanonikus dNTP-kkel való összehasonlítása érdekében a hosszabbítási időt 15 és 120 s között változtattuk. 15 s hosszabbítási idő esetén a dNTP-reakció körülbelül négyszer annyi terméket termelt, mint a dNDP-ket tartalmazó, 2 perces hosszabbítási idejű reakció (S1B ábra). Ezek az adatok arra utaltak, hogy a beépülés sebessége a difoszfátok esetében lassabb, mint a hagyományos trifoszfátok esetében, ami a dNDP-k alacsonyabb alapállapotú energiáját figyelembe véve várható volt. A következő kérdésünk az volt, hogy vajon egyetlen vagy mind a négy dNDP felelős-e a lassabb beépülési sebességért. A termékképződés pontos méréséhez kvantitatív PCR-t (qPCR) alkalmaztunk. Minden egyes difoszfátot egymástól függetlenül vizsgáltunk úgy, hogy a másik három dNTP 0,2 mM-jával kombináltuk egy hosszú DNS-templát amplifikálásához. Ezeket a reakciókat egy kontrollreakcióhoz normalizáltuk, amely mind a négy dNTP-ből 0,2 mM-ot tartalmazott (S1C ábra). Az 1-es érték azt jelzi, hogy a difoszfát ugyanolyan hatékonyan épül be, mint a trifoszfát analógja. Ezek az eredmények arra utalnak, hogy a dADP épül be legkevésbé hatékonyan (1 mM dADP a 0,2 mM dATP ∼60%-át adta), ezt követi a dezoxitimidindifoszfát (dTDP) és a dezoxicitidin-difoszfát (dCDP). Másrészt a dGDP koncentrációjának csak kétszeres növelése szükséges a dGTP kontrollreakcióval megegyező PCR-hatékonyság eléréséhez.

A DNS-polimerizáció közvetlen elemzéséhez egy 32P-jelölt primerrel és egy hosszú (706 nt) templommal végzett primerhosszabbítási reakciót végeztünk. A difoszfát koncentrációját 0,1 és 1,0 mM között változtattuk, és 0,2 mM másik három dNTP-vel kombináltuk, hasonlóan a fent leírt qPCR-reakciókhoz. A várakozásoknak megfelelően a dADP növekvő koncentrációja csökkentette a teljes hosszúságú termék előállításához szükséges időt (1E ábra). A templát-DNS hossza mentén történő szünetelés kizárólag dADP esetében volt megfigyelhető, ami arra utal, hogy a polimeráz megakad a dADP szubsztrátok beépítése során (1E ábra). Másrészt a dTDP-reakcióban a szünetelés hiánya arra utalt, hogy a dTDP hatékonyabban hasznosult, mint a dADP (S2A ábra), amint azt a qPCR-elemzés is sugallta (S1A ábra). A termékképződés elemzése azt mutatta, hogy a félmaximális sebesség eléréséhez szükséges dADP koncentráció ∼420 µM (S2B ábra), ami több mint egy nagyságrenddel meghaladja a korábban mért dNTP-k KM értékét (16 és 24 µM) (5, 6). A dADP telítődő koncentrációjának közelében a teljes hosszúságú DNS körülbelül 30 s alatt szintetizálódik, és mivel a 706 nt-os szekvencia 182 adenozint tartalmaz, a dADP felhasználásának átlagos sebessége legalább ∼6 s-1 . Ez körülbelül egy nagyságrenddel lassabb, mint a Taq-polimeráz dNTP-k hasznosításának átlagos sebessége (kcat = 47 s-1), és 1,5-szerese a Pfu kcat-jának (7).

A dNDP-kből és dNTP-kből álló hosszú templátokon történő DNS-szintézis kinetikájának további összehasonlításához egy 7 249 nt hosszúságú M13mp18 plazmid templátot (ssDNS) használtunk (8). A Bsu (37 °C-on), a Bst és a Taq (60 °C-on) polimerázok robusztus DNS-szintézist mutattak dNDP-kből (S2C ábra). A DNS-szintézis sebességét a SYTO9 interkalátor fluoreszcenciájával mértük, amelyet valós idejű termocikleren figyeltünk meg változó dNDP- és dNTP-koncentrációk mellett (S2D ábra) (9). Ezen sebességek ábrázolása a nukleotidkoncentráció függvényében a dNDP-k esetében ∼0,4 mM látszólagos KM-et mutatott, és a szintézis maximális sebessége körülbelül 17-szer alacsonyabb a dNDP-k esetében, mint a dNTP-k esetében (S2E ábra). Ezek az eredmények közvetlen összehasonlításban, azonos körülmények között azt mutatják, hogy a dNDP-kből történő DNS-szintézis sebessége valamivel több mint egy nagyságrenddel alacsonyabb, mint a dNTP-kből, és hogy a Vmax/KM így a dNDP-k esetében körülbelül 400-szor alacsonyabb, mint a dNTP-k esetében.

A kanonikus trifoszfát szubsztrátokkal végzett polimerizációs reakció egy nukleotiddal növeli a naszcens DNS-szál hosszát, felszabadítva egy PPi-t (3). A fordított reakció, a pirofoszforolízis során a primer egy nukleotiddal rövidül, és egy dNTP szabadul fel. Analóg módon, amikor dNDP-ket használunk szubsztrátként, a polimerázok foszfátokat szabadítanak fel, és a fordított reakció a DNS foszforolízise (2A ábra). Annak megerősítésére, hogy a polimerázok közvetlenül dNDP-ket használnak, és nem egy eddig ismeretlen enzimatikus aktivitást (vagy kopurifikált nukleotidifoszfát-kinázt), amely két dNDP-t dNTP-vé és dNMP-vé alakít, tisztított dNDP-ket használtunk, és elemeztük egy primer-hosszabbítási reakció termékeit. A foszfát termelődését egy fluoreszcens szenzorral mértük, amely a bakteriális foszfátkötő fehérjéből származik, és nagy foszfátspecificitást mutat (10). Azt találtuk, hogy tisztított dNDP-k és Taq DNS-polimeráz jelenlétében foszfát képződik (2B. ábra), de a polimeráz nélküli kísérletekben nem. A dNTP-ket tartalmazó kontrollkísérletekben is megfigyeltük a foszfát termelődését, de annak sebessége lassabb volt és független az enzimtől, ami arra utal, hogy az észlelt foszfát a dNTP dNDP-re és foszfátra történő lebomlásából származik, és nem a DNS-szintézishez kapcsolódik. Ezek az eredmények megerősítették, hogy a Taq közvetlenül dNDP-ket használ fel szubsztrátként, és a DNS-szintézis melléktermékeként foszfátot szabadít fel. Amikor megmértük a fent leírt 7 249 nt M13 ssDNS-en a primer hosszabbítások során keletkező foszfát mennyiségét, azt találtuk, hogy 1,6 nM templát felhasználásával ∼1-11 µM foszfát keletkezett a dNDP lebontásából származó háttér foszfáttermelésen felül (S3A ábra). Ez a foszfátkoncentráció ∼2-6000 molekulának felel meg DNS-enként, vagy a dNDP-vel másolt templát kb. 0,1-0,9-ének. A széles tartomány a kiindulási anyagban lévő viszonylag nagy foszfát-háttérből és a primer-hosszabbítási reakcióban a jelből kivont háttérreakcióból adódik.

Azért, hogy ellenőrizzük, hogy a reakciók nem termelnek dNTP-ket dNDP-kből, a Taq-polimerázt 250 µM dCDP-vel és dTDP-vel inkubáltuk, és a reakciókat ioncserélő kromatográfiával felbontottuk (S3B ábra). Ez az elemzés az enzimtartalmú reakcióban az enzimmentes reakcióhoz képest nem mutatott ki mono- vagy trifoszforilált nukleotidoknak megfelelő új molekuláris fajokat, ami az enzimkészítmény foszforil-transzferáz aktivitásának hiányára utal, és tovább támogatja a dNDP-k közvetlen felhasználását a DNS-szintézisben.

A fent leírtak szerint a dNDP szubsztrátokkal végzett reakciók szervetlen foszfátot (Pi) szabadítanak fel, és a fordított reakció így a DNS foszforolízise (2A ábra). E fordított reakció hatékonyságának tesztelésére vizsgáltuk egy templát szálhoz lágyított 5′ 32P-jelölt primer foszforolízisét az enzimmel és 10 mM Pi-vel inkubálva. A 2C. ábrán látható a terminális 3′ nukleotid eltávolítása a primer szálról a Taq DNS-polimeráz által Pi és PPi jelenlétében, ami azt mutatja, hogy a Taq DNS-polimeráz képes a DNS-polimerizáció fordított reakciójára mind dNTP-kből, mind dNDP-kből. A termofil Bst, Deep Vent, KOD (S4A ábra), 9°N, Tgo és a mezofil Bsu polimerázok elemzése szintén kimutatta a DNS foszforolízisét (S4B ábra), bár kisebb mértékben. Az Escherichia coli DNS-polimeráz I Klenow-fragmentumával, amely nem fogad el dNDP-ket szubsztrátként, egy kontrollreakciót is vizsgáltunk (S4C ábra), és azt mutatta, hogy a PPi jelenléte a primer rövidülését eredményezi, de a Pi nem.

A fordított reakció további elemzéséhez 32P-foszfáttal belsőleg jelölt dsDNS-t készítettünk úgy, hogy α-32P-dATP-vel primerhosszabbítási reakciót végeztünk, majd PAGE tisztítást végeztünk. A reverz reakció termékeit anioncserélő (polietilén-imin) TLC-vel elemeztük. A várakozásoknak megfelelően a belsőleg jelölt DNS Taq-polimerázzal és pirofoszfáttal történő inkubálása dATP-vel komigált termékeket eredményezett. A foszfát jelenlétében végzett reakciók gyorsabban vándorló fajokat eredményeztek, amelyek a dADP-nek feleltek meg, a foszfát vagy pirofoszfát nélküli reakciók pedig nem eredményeztek vándorló fajokat, ami azt jelzi, hogy a Taq-polimeráz jelenlétében a DNS önmagában érintetlen maradt (2D ábra), és megerősíti, hogy a fordított reakció a DNS foszforolízise.

Végül a reverz reakció szubsztrátfüggő kinetikájának elemzése ∼10 ± 5 mM (n = 9) és 57 ± 5 µM (n = 5) KM-et mutatott ki a foszfát, illetve a pirofoszfát esetében, bár a magnézium-foszfát alacsony oldhatósága 10 mM felett nem tette lehetővé a pontos méréseket (2E. ábra). Az aktív centrumokban pirofoszfátot vagy foszfonoforminsavat tartalmazó DNS-polimerázok kristályszerkezetei Coulombos kölcsönhatást mutatnak a fehérjével (11⇓-13). A két szubsztrát KM-értékeinek 200-szoros aránya 72 °C-on ∼15 kJ/mol (3,6 kcal/mol), amely kötési energia nagyjából megegyezik a további foszfát és a fehérjén lévő kompenzáló kation közötti ionos kölcsönhatással, és alátámasztja azt a modellt, amelyben a foszfát/pirofoszfát főként töltés-töltés kölcsönhatáson keresztül ismerhető fel. A fordított reakció maximális sebességének becslése hasonló tendenciát követett: a Vmax ezeknél a körülményeknél 0,0010 ± 0,0005 s-1 és 0,205 ± 0,005 s-1 volt a foszfát és a pirofoszfát esetében, ami ismét egy körülbelül 200-szoros arányt mutat a két aktivitás között. Összességében a két szubsztrát telítődő koncentrációja alatt a foszfát reakció körülbelül 4 × 104-szer kevésbé hatékony, ami arra utal, hogy a DNS foszforolízise nem jelent jelentős veszélyt a genom stabilitására.

Az alacsony energiájú szubsztrátokból (dNDP-k és Pi) történő DNS-szintézis további megismeréséhez megmértük az aktiválási energiákat az előre- és hátrameneti reakciók Arrhenius-elemzésével. Mivel a megfelelő dNTP-k felismeréséhez és beépítéséhez kapcsolódó konformációs változások egymolekulás mérései gyorsabb fehérjemozgást mutattak ki, mint a megfigyelt reakciókinetika (14), a Taq-polimerázban az előremenő reakció sebességkorlátozó lépése valószínűleg a kémiai lépéshez vagy egy prekatalitikus aktív-hely átrendeződéshez kapcsolódik, amely a szubsztrát foszfátokkal való kölcsönhatástól függ. Megfigyeltük, hogy mind az előre-, mind a hátrameneti reakció Vmax értéke alacsonyabb dNDP és foszfát esetén, mint dNTP és pirofoszfát esetén, ami arra utal, hogy a sebességkorlátozó lépés érzékeny a szubsztrátok foszforilációs állapotára. Azonban mind a prekatalitikus átrendeződést (mint például az aktív hely maradékainak összehangolása és a katalitikus Mg2+ ion megkötése), mind a kémiai lépést befolyásolhatja a szubsztrát foszforilációja; ezért bármelyik lépés lehet sebességkorlátozó a dNDP-k jelenlétében, feltéve, hogy nem vezetnek be egy új, lassú konformációs lépést a mechanizmusba. A Pol β-ben e két lépésnek korábban hasonló sebességi állandókat javasoltak (15), és a nagy energiájú szubsztrátokat (dNTP-ket és pirofoszfátot) használó előremenő és fordított reakciók számított aktiválási energiái mindössze 15 kJ/mollal térnek el (4). A termofil Taq és Klentaq1 enzimek esetében az előremenő reakció aktiválási energiája széles skálán mozog, 90 és 125 kJ/mol között, a kísérleti körülményektől és valószínűleg a reagáló nukleotidok azonosságától függően (8, 16), míg a pirofoszforolízis aktiválási energiáját tudomásunk szerint kísérletileg még nem határozták meg.

Elemeztük a primer-hosszabbítási reakció során 50 µM dA-ra, dC-re, illetve dA-ra halmozódó dCDP, dADP és dTDP egynukleotid beépülési sebességét. Az Arrhenius-analízis az ln(kobs) lineáris függését mutatta az 1/T értéktől a 60 °C alatti kísérletekben, és 85 ± 14, 108 ± 11 és 112 ± 15 kJ/mol aktiválási energiát mutatott a három nukleotid esetében (3. ábra A és B; n = 6 minden nukleotid esetében). A 0,4 mM foszfáttal végzett, egy molekula dADP-t eredményező fordított reakció Arrhenius-analízise nagy aktiválási energiát mutatott ki, 138 ± 10 kJ/mol (n = 5), ami összhangban van a Taq által végzett DNS-foszforolízis megfigyelt lassú sebességével (3. ábra A és B), és jelentős növekedést jelent a pirofoszforolízis számított aktiválási energiájához képest (92 kJ/mol a Pol β-ben) (4). A dADP esetében az előremenő és a fordított reakciók aktiválási energiája tehát ∼30 kJ/mollal különbözik, ami erős előnyt jelent a DNS-szintézis számára. Ez az előretolt reakcióra való elfogultság azt eredményezi, hogy a dNTP-alapú DNS-szintézissel és a szervetlen pirofoszfatázok által végzett pirofoszfát-hidrolízissel ellentétben a foszfátterméknek egy downstream metabolikus útvonalon történő szekvenálására kisebb szükség van. Továbbá, ha a Taq-polimeráz prekatalitikus konformációs változásait nem befolyásolják az alacsony energiájú szubsztrátok, és a kémiai lépés sebességkorlátozó, a dNDP-k és foszfátok hasznosítása új kísérleti betekintést nyújthat a DNS-szintézis enzimatikus katalízisébe.

Vizsgálatunk azt mutatja, hogy a Taq és számos más, a DNS-polimerázok A és B családjába tartozó enzim, beleértve a termofil és mezofil baktériumok replikatív enzimeit is, képes a kanonikus trifoszfát szubsztrátokat a difoszfát analógokkal helyettesíteni. A nukleotidszubsztrátban lévő γ-foszfát feláldozhatóságának korai bizonyítékai a HIV-1 reverz transzkriptáz és a bakteriofág RB69 DNS-polimeráz gp43 vizsgálataiból származnak. Azok a HIV-1 RT-változatok, amelyek megszüntetik a beérkező dNTP γ-foszfátja és a polimeráz közötti elektrosztatikus kölcsönhatást, az aktivitás megőrzését eredményezték, bár sokkal lassabb ütemben (17⇓-19), és a bakteriofág RB69 DNS-polimeráz gp43 hasonló aktivitást mutatott (20). Mindkét vírusenzim dNDP-ket fogad el szubsztrátként, de a KM (vagy KD) 500 és 17-szer magasabb, a sebességállandó pedig 100 és 400-szor alacsonyabb, mint a HIV-1 RT és az RB69 gp43 dNTP-k esetében (20, 21). Tanulmányunk bizonyítja, hogy a sejtes replikatív polimerázok rendelkeznek ezzel az aktivitással, leírja a szubsztrát-affinitásokat és az aktiválási energiákat mind az előre-, mind a hátrameneti reakciókhoz, és arra utal, hogy a DNS-szintézis dNDP-kből meglehetősen hatékony, különösen a termosztatibilis enzimek esetében.

Eredményeink arra utalnak, hogy a DNS-replikáció dNDP-ket szubsztrátként használva megvalósítható. A termofilekben a genom replikáció kevésbé lehet érzékeny a sejt energiatöltésére, mint a mezofilekben, mivel a termosztabil polimerázok képesek elfogadni a difoszforilált és a trifoszforilált szubsztrátokat is. A DNS-replikációt így kevésbé befolyásolja az intracelluláris ATP/ADP arány, és az a viszonylag nagy hatékonyság, amellyel a DNS magas hőmérsékleten szintetizálódik, arra utal, hogy a termofilok képesek lehetnek teljesen lemondani a trifoszforilált szubsztrátokról. Továbbá paleobiológiai bizonyítékok arra utalnak, hogy bioszféránk utolsó közös őse termofil volt (22⇓-24), és tanulmányunk arra utal, hogy a diszfoszforilált szubsztrátok elegendőek lehettek a korai organizmusok genomreplikációjához, enyhítve a nagy energiájú trifoszforilált metabolikus intermedierek anyagcseréjének szükségességét. Ebben az esetben a difoszfátokat a nagy energiájú metabolitok evolúciójának köztes termékeinek lehetne tekinteni, és a korai genomok ősi építőkövei, például ribonukleotidok vagy egyszerűbb nukleinsavak lehetnek.

A DNS-polimeráz számos biotechnológiában játszik kiemelkedő szerepet. Az itt bemutatott difoszfát szubsztrátok használata lehetővé teszi a drága analógok, például izotóposan jelölt vagy kémiailag módosított nukleotidok beépítését, kiküszöbölve a kihívást jelentő trifoszfát szintézisek szükségességét. A DNS-polimerázok e tulajdonsága a nagy áteresztőképességű DNS-szekvenálásban használt nukleotidok kimutatására is módot adhat. Két elterjedt módszerrel detektálják a primer meghosszabbításához kapcsolódó PPi kilépő csoportot, vagy másodlagos kemilumineszcens teszttel, vagy a helyi pH változásának megfigyelésével (25, 26). A dNDP szubsztrát használata Pi-t eredményez, így további lehetőséget kínál a beépített nukleotidok megkülönböztetésére. A DNS-polimeráz képességeinek ez a kibővült megbecsülése azt is sugallja, hogy más trifoszfátfüggő enzimek vizsgálata felfedheti az alacsonyabb energiájú, könnyebben hozzáférhető difoszfát szubsztrátokkal mint evolúciós köztitermékekkel szembeni toleranciát.