- Observation of fertilized embryos to cleavage embryos
- 1. ábra.
- 2. ábra.
- 3. ábra.
- 2.1. Az embrióhasadás morfokinetikája time-lapse képalkotás alapján
- 2.2. Hogyan lehet az embrió osztódási mintázatát és vonalvezetését in vivo tanulmányozni? A hasadó embrió génexpressziója és az embrió életképességének noninvazív értékelése táptalajelemzéssel
Observation of fertilized embryos to cleavage embryos
Mióta 1912-ben leírták az első nyúl embriótenyésztést és egér zigótát lehetett in vitro tenyészteni, hogy blasztociszta stádiumú embriókat képezzenek , az embrió minősége fontos tényezővé vált a terhesség szempontjából az in vitro embrió méhbe történő beültetése után, mivel az embrió minősége szoros összefüggést mutat az átültetett embrió méhbe történő beágyazódásával. Az első “kémcsöves” baba, Louise Brown 1978 júliusában történt születése óta, amelyért 2010-ben Robert Edwardsnak ítélték oda az élettani vagy orvosi Nobel-díjat az in vitro megtermékenyítés (IVF) és az embrióátültetés (ET) kifejlesztéséért a nem páciens petevezetékkel rendelkező nők meddőségének kezelésére, az in vitro embrióelőállítást (IVP) széles körben alkalmazzák az emberi meddőség kezelésében és az állatpopulációk szaporításában és bővítésében. Az asszisztált reprodukciós technológia sikere azonban elsősorban a nagy beültetési potenciállal rendelkező, életképes embriók előállításától függ. Ami még fontosabb, a legjobb embrió kiválasztása az átültetéshez a legnagyobb kihívássá vált az IVF-ben. A korai embriótenyésztésben az embrió minőségének értékelése elsősorban az átültetett embrió morfológiai kritériumain alapult. Így az embrió morfológiájának sorozatos megfigyelése az embriológusok általános technikája az embriók értékelésére, és a beültetés és a terhesség kulcsfontosságú előrejelzőjének tekintik . Hosszú távon az embriológusok az embriók minőségének és morfológiájának értékelését úgy végezték, hogy az embriókat kivették az inkubátorból és mikroszkóp alá helyezték. A morfológiai megfigyelés mellett a kutatók egy sor vizsgálatot végeztek a sejtmag változásáról, a génaktivációról és -expresszióról, a citoplazmatikus fehérjeexpresszióról, a blasztoméra differenciálódásról stb. Ezek a vizsgálatok azonban gyakran az embriók pusztulásával járnak. Például a korai tanulmányunkban, amely a spermiumok petesejtbe való belépését vagy az oocita aktiválását követő mikrospindula-változást figyelte meg, a megtermékenyített zigótákat vagy aktivált petesejteket a tárgylemezen kellett rögzíteni, és immuncitokémiai fluoreszceinnel és lézeres konfokális mikroszkópiával festeni . Kutatásaink egyértelműen kimutatták a mikrotubulusok és a kromatin változását a szarvasmarha petesejt aktiválása és az introcitoplazmatikus spermiuminjekció (ICSI; 1. ábra) után. A spermium az oocitába vagy a kalciumionofór és az etanol aktiválhatja az oocitát és a második poláris test extrudálását okozhatja. A második poláris test idejének megfigyelése érdekében az aktiválást követően az oociták különböző stádiumait festettük meg. Az eredmény azt mutatta, hogy az aktiválást követő 5 óra elteltével a második poláris test teljesen extrudálódhat (2. ábra).
1. ábra.
Lézerpásztázó konfokális mikroszkópia az orsó és a kromatin változásáról az aktiválás és az intracitoplazmatikus spermiuminjekció (ICSI) utáni különböző időpontokban szarvasmarhában. A nagybetűk (balra) az aktiválás utáni változást, a kisbetűk (jobbra) pedig az ICSI utáni változást jelzik. Az A/a 0,5 óra, a B/b 2 óra, a C/c 3 óra, a D/d pedig 7 óra az aktiválás vagy az ICSI után. A prenucleus az aktivált petesejtben és a prenucleus az ICSI petesejtben vörös színnel jelent meg.
2. ábra.
Lézerpásztázó konfokális mikroszkópia az orsó és a kromatin változásáról az aktiválás utáni különböző időpontokban szarvasmarhában. Az aktiválás után 0,5 órával az orsó kromoszómái osztódni kezdenek, és az orsóosztódás befejezéséhez körülbelül 3 órára van szükség, és a második poláris test körülbelül 5 óra múlva extrudálódhat. A piros és a zöld együtt jelzi az orsót, a piros pont pedig az első poláris testet.
A génexpresszió vizsgálatához gyakran szükséges az mRNS vagy a fehérje izolálása az embriókból ; ezért az embriókat lízingelni kellett, és egyetlen embrió sem maradt volna életben. A sejtdifferenciálódás tanulmányozására morális és blasztociszta stádiumú embriókon a fluoreszcein mikroszkópos módszerrel történő kettős festést alkalmazták a belső sejttömeg (ICM) és a trofo-ektoderma (TE) megkülönböztetésére. A két különböző sejt számát a különböző színek alapján lehet megszámolni (az ICM kék és a TE rózsaszínű, 3. ábra).
3. ábra.
A különböző sejtek megkülönböztetése szarvasmarha-blasztociszta embriókban kettős festéssel. A felső ábra egy blasztociszta embriót mutat, megjelölt belső sejttömeggel (ICM) és körülötte trophectoderm sejtekkel (TE). Az alsó ábra kétszeresen festett szarvasmarha blasztociszta embriót mutat, kékkel az ICM és rózsaszínnel a TE sejtek. A felső kép weboldali keresésből származik, és a szerző nagyra értékeli Prof. Fuliang Du szívességét a publikálatlan alsó képért.
Ezek a kutatási módszerek végül minden embriót károsítanak, és lehetetlen ezeket a módszereket a klinikai gyakorlatban alkalmazni. Így a jelenlegi embrióminőség-értékelés elsősorban az átültetett embriók morfológiai kritériumain alapul, amely három fő paramétert foglal magában, mint a blasztoméra szabályossága, töredezettség és a citoplazma szemcsézettsége . Az embrió minőségének értékeléséhez figyelembe vehető az embriósejtek száma a különböző tenyésztési napokon és a multinuklearitás is . Számos jelentés dokumentálta a hasadási stádiumban lévő embriók morfológiai jellemzői és a terhesség sikere közötti összefüggést. Így jelenleg ez az alapvető módszer az embriók minőségének értékelésére a humán IVF és az állati in vitro embriótermesztés során. Bár azonban ez könnyen kivitelezhető, gyakran kiveszik az embriókat az inkubátorból, ami aggodalomra ad okot a tenyésztési körülmények biztonságával és stabilitásával kapcsolatban. Emellett az embriófejlődés néhány kulcsfontosságú pontja kimaradhat a megfigyelés során. A hasadó embriók értékelése a tenyésztés során és az embrióátültetés előtt fontos klinikai gyakorlat. Jelenleg az in vitro megtermékenyített embriók fő értékelése a mikroszkópos vizuális megfigyelés. Az utóbbi években különböző time-lapse mikroszkópos inkubátorokat használnak a humán IVF klinikán az embrió növekedésének és fejlődésének minden lépésének megfigyelésére. Bár a preimplantációs embriódiagnosztikai és -szűrési (PGD/PGS) technológiákat alkalmazzák a humán embriószelekciós gyakorlatban a terhességi arány javítása érdekében, ezek a technikák invazívak az embriókra nézve. Egy másik, nem invazív módszer megtalálása a jó embrió kiválasztására nagyon hasznos lenne a humán ART gyakorlatban. Sallam és munkatársai áttekintették az embriószelekció nem invazív módszereit, és a jelenleg rendelkezésre álló legjobb bizonyítékok fényében értékelték ezeket a módszereket, hogy kiderítsék, megérett-e bármelyikük arra, hogy felváltja vagy kiegészítse a morfológiai értékelés időtálló módszerét. Az embriók morfokinetikai markereinek becsléséhez tehát nagyobb teljesítményű eszközökre van szükségünk.
2.1. Az embrióhasadás morfokinetikája time-lapse képalkotás alapján
A kutatók évtizedek óta próbálják követni a többsejtű szervezetek fejlődését a megtermékenyített petesejtből a kifejlett egyedekké. Míg a tudósok ennek a folyamatnak az egyes lépéseit vizsgálták, nem létezett olyan módszer, amellyel a teljes fejlődési folyamatot élőben modellezhették volna. Jelenleg a két Nature Methodspaperben ismertetett fénylemezes mikroszkópia fejlődése lehetővé tette a kutatók számára, hogy a korai fejlődést nagy részletességgel vizualizálják. A legújabb fénylemez-mikroszkópok egy lézerfényt használnak a minta egy vékony metszetének megvilágítására, és a teljes síkot egyetlen pillanatfelvétellel rögzítik. Ez lehetővé teszi, hogy sokkal kevesebb fényt használjanak, mint a konfokális vagy kétfotonos mikroszkópok. Nagyon gyors, de nagyon kíméletes, hogy egyszerre több kritikus módon is rendkívül jól teljesítsen . A teljes embriók, például a Drosophila, a zebrahalak és az egerek fejlődésének leképezéséhez ez az új többnézetes képalkotási technika fantasztikus.
A time-lapse képalkotás egy másik nem invazív, feltörekvő technológia, amely lehetővé teszi az embriók fejlődésének 24 órás nyomon követését, lehetőséget kínálva a morfológiai információk nagyobb mennyiségű és minőségű megszerzésére a tenyésztési körülmények megzavarása nélkül . Az time-lapse mikroszkóp nagyon hasznos az embrió fejlődésének megfigyelésére. Az elmúlt évtizedben számos humán IVF klinika vagy központ elkezdte használni a time-lapse képalkotást az embrió növekedésének és osztódásának nyomon követésére az in vitro tenyésztés során, és végül a jó minőségű embrió kiválasztására az átültetéshez a rögzített adatok és képek alapján. Ez a technika a jelentések szerint képes javítani az átültetett embrió beágyazódását és a terhességet . Az embrió hasadásának time-lapse felvétele alapján meghatározható a normális embrióhasadási sebesség. Így e könyv második fejezetében az embrió hasadásának időzítését a morfokinetikai markerek alapján az time-lapse monitor segítségével vázoltuk fel. Ennek az embrióhasadás időzítésének vázlata alapján az embriológusok világosan tudhatják, hogy egy embriónak a különböző időpontokban melyik stádiumban kell lennie. Így egy optimális minőségű embriót vagy egy nagy beültetési potenciállal rendelkező embriót lehet kiválasztani a transzferhez a magasabb terhességi arány elérése érdekében. A time-lapse rendszerben folyamatosan és gyakran rögzítő rendszer használatával néhány morfokinetikai marker feltárható. Például az embriósejtek gyors osztódása egy adott időpontban gyakran alacsonyabb beágyazódási arányt eredményez. Normális esetben a zigótából 2-3 sejtre történő osztódás kb. 10-11 órát vesz igénybe, de Rubio és munkatársai azt találták, hogy egyes embrióknak csak kb. 5 órát vesz igénybe az osztódás befejezése, és ezeknek az embrióknak sokkal alacsonyabb a beültetési aránya, mint a normál osztódású embrióknak (1,2% vs. 20%). Az embrió egyenlőtlen osztódása is, amelyet úgy határoznak meg, hogy egy blasztomer három leányblasztomerre szakad, vagy a sejtciklus 5 óránál rövidebb intervalluma gyakran jelentősen alacsonyabb beültetési potenciált eredményez . Így ezeket a pontosabb morfokinetikai markereket használhatjuk az embriók minőségének megkülönböztetésére.
A harmadik fejezet tovább vizsgálja és ellenőrzi, hogy a hagyományos morfológiai értékelés helyett a time-lapse képalkotó technológia hasznos-e a “csúcsminőségű” embriók kiválasztásában az ART eredményének javítása érdekében történő transzferhez. Érdekes módon az embrió neme, az embrió fragmentációja, a kezelési protokollok, a különböző táptalajok és az embrió morfokinetikája közötti lehetséges összefüggéseket értékelték néhány új, time-lapse képalkotó berendezéssel kapcsolatos kutatás alapján. Továbbá az ART-ciklusokban time-lapse képalkotással tervezett különböző algoritmusok és prediktív modellek is megvitatásra kerülnek. Például az állati és emberi embriók fejlődési sebességére vonatkozó számos kutatás a közönséges morfológiai megfigyeléssel azt mutatta, hogy a hím embriók gyorsabban nőnek, mint a női embriók . A jelenlegi time-lapse képalkotó megfigyelés azonban részletesebb és pontosabb információt nyújthat a hím és női embriók különbségéről a korai osztódások során. Bár a női embriók késői hasadási (t8), morula (tM) és blasztociszta stádiumú morfokinetikai paramétereket mutattak, a hímeknél korábbi terjeszkedést mutattak. Így a megfigyelés kulcsfontosságú időpontjai az embrió nemi fejlődéséhez kapcsolódnak. Érdekes módon a szerzők a második szinkronizáció és a morula kialakulásának időpontja szerint négy alcsoportot tartalmazó modellt terveztek, hogy megjósolják az embrió nőneműségének valószínűségét.
Az embrióhasadás morfokinetikájának további tanulmányozása és feltárása érdekében a negyedik fejezet az embrióhasadás in vitro tér-időbeli elemzésének néhány módszerét tárgyalja.A korai stádiumú embriók hasadási stádiumban készült képeinek automatizált vagy félautomatizált time-lapse elemzése betekintést nyújthat a mitózis időzítésébe, mind az osztódás időzítésének és mintázatának szabályosságába, mind a sejtvonalba. A molekuláris folyamatok egyidejű nyomon követése lehetővé teszi a genetikai expresszió és a sejtek fiziológiája és fejlődése közötti összefüggések tanulmányozását. A time-lapse képalkotási adatok és az elemző szoftverek segítségével könnyen létrehozható az embriók négydimenziós videoszekvenciája, így a növekvő embriók új betekintést engednek az időbeli embriófejlődésbe. Ebben a fejezetben a szerzők három módszert ismertetnek a hardver és a szoftveres elemzés variációival, néhány példát bemutatva az eredményekre, hogy ablakot nyissanak a fejlődési embriológia új információira, mivel az embrió osztódási mintázatát és vonalvezetését in vivo tanulmányozzák.
2.2. Hogyan lehet az embrió osztódási mintázatát és vonalvezetését in vivo tanulmányozni? A hasadó embrió génexpressziója és az embrió életképességének noninvazív értékelése táptalajelemzéssel
A preimplantációs embrió fejlődésében kritikus események és figyelemre méltó epigenetikai módosulások sorozata zajlik, és a génexpresszió átprogramozása történik az embrionális genom aktiválása érdekében. A preimplantációs embrió fejlődésének korai szakaszában az anyai mRNS-ek irányítják az embrió fejlődését. A korai embrionális fejlődés során végig fennmarad a differenciált metilációs mintázat, bár egyesek stádiumspecifikus változásokat mutatnak. A legújabb vizsgálatok kimutatták, hogy a differenciális demetilációs folyamat a korai fejlődő embriókban differenciális szülői génexpressziót eredményez, amely hatással lehet a helyes fejlődésre . Emellett a nem kódoló RNS-ek, a hosszú nem kódoló RNS-ek (lncRNS) és a rövid nem kódoló RNS-ek, a mikroRNS-ek (miRNS-ek) fontos szerepet játszanak az mRNS-ek szabályozásában, ezért a preimplantációs fejlődésben betöltött szerepük jelentőséget nyert. Az ötödik fejezet áttekinti a preimplantációs embriófejlődés során a génexpressziót befolyásoló különböző tényezőket, amelyek közé tartoznak az ivarsejtek és a preimplantációs embriók epigenetikai tényezői, a metilációs profilokra összpontosítva. A nem kódoló RNS-ek génexpresszióra gyakorolt hatását alaposan értékeltük.
Mivel a génexpresszió megjelenése az embriófejlődés során in vitro tenyésztésben történik, a preimplantációs embrióknak gyakran gazdag tápközegre van szükségük. Az embriónak növekedése és fejlődése során fel kell vennie néhány fontos tápanyagkomponenst a táptalajból, és metabolikusan termelnie kell néhány mellékterméket, mint génexpressziós eredményt. Ebből a szempontból az embriók in vitro tenyésztése nagyon fontos anyagot szolgáltat a további nem invazív embrióértékeléshez az elhasznált embriótenyésztő közegben lévő biomarkerek vizsgálatával. A jelenleg kifejlesztett módszerek a fejlődő embriókból elválasztott metabolikus vegyületek mérésére összpontosítanak. Ezek a vizsgálatok elsősorban a modern analitika és a proteomika eszközeit használják. Egyes tanulmányok azt sugallják, hogy az embriók tenyésztőközegének metabolikus profilozása optikai és nem optikai spektroszkópia segítségével hasznos kiegészítője lehet a jelenlegi embrióértékelési stratégiáknak, és betekintést nyújthat a növekvő reprodukciós potenciállal rendelkező embriók fenotípusába .
A hatodik fejezetben a szerzők új felfedezésüket, az emberi haptoglobin molekula alfa-1 láncát, mint az embrió életképességének mennyiségi biomarkerét ismertetik. Egy retrospektív, vak kísérletsorozatban több mint 50%-os sikerességi arányt értek el. Ez a fejezet összefoglalja a jelenleg rendelkezésre álló metabolikus és proteomikai megközelítéseket, mint az embrió életképességének nem invazív molekuláris értékelését. A közelmúltban végzett vizsgálatok kimutatták, hogy a tápközeg molekuláris összetevőinek értékelése ígéretes terület a sikeres embrióbeültetés markereinek keresésében, az ezt követő klinikai terhesség kialakulásával és az egészséges baba születésével, az ART technikákkal történő kezelés hatékonyságának növelése érdekében . Ha a táptalajok molekuláris összetétele további nem invazív eljárásként használható a szelektív transzferre szánt embrió kiválasztására, az nagyon hasznos lesz a humán IVF terhesség eredményének javítása szempontjából.