PMC

Tässä lehdessä hiljattain ilmestyneessä Dayanin ja Wraithin pääkirjoituksessa tuotiin esiin haasteet, joita uusien immunoterapioiden kehittämiseen liittyy TGN1412:n katastrofaalisen kokeilun jälkeen. Tässä katsauksessa esitellään joitakin monista anti-D:n kliinisistä tutkimuksista saatuja tietoja, joilla voi olla merkitystä translaatioimmunologian kannalta.

Sikiön ja vastasyntyneen hydrops fetalis- tai Rhesushemolyyttisen taudin (HDFN) ehkäiseminen ennaltaehkäisevällä anti-D:llä on menestyksekkäin vasta-ainevälitteisen immunosuppression kliininen sovellus. HDFN syntyy, kun D-negatiivinen nainen immunisoituu sikiön D-positiivisille punasoluille fetomaternaalisen verenvuodon (FMH) jälkeen; tuotettu IgG-vasta-aine siirtyy istukan läpi aiheuttaen sikiön punasolujen tuhoutumisen pernan makrofageissa. 1940-luvulla, jolloin tämän taudin syy tunnistettiin ensimmäisen kerran, 1 % vauvoista syntyi HDFN:n kanssa ja 40 % heistä kuoli. Anti-D on yleisin siihen liittyvä vasta-aine. Punasolujen RhD-polypeptidi on veriryhmäantigeeneistä immunogeenisin, koska se puuttuu sellaisten D-negatiivisten henkilöiden soluista, joilla ei ole RHD-geeniä.

HDFN on nykyään harvinainen, mikä johtuu osittain sikiön ja vastasyntyneen hoidon parantumisesta, mutta pääasiassa siitä, että alttiita D-negatiivisia naisia ei ole voitu ennaltaehkäistä primaari-immunisoimalla heidät ennaltaehkäisevästi IgG-vasta-aineella . Vuodesta 1968 lähtien Yhdistyneessä kuningaskunnassa ja Yhdysvalloissa tehtyjen menestyksekkäiden kliinisten kokeiden jälkeen anti-D:tä on annettu synnytyksen jälkeen 10 prosentille kaikista naisista, mikä on vähentänyt taudin esiintyvyyttä noin 95 prosentilla. HDFN aiheuttaa nykyään alle 30 perinataalikuolemaa vuodessa. Vuonna 2002 National Institute of Health and Clinical Excellence (NICE) suositteli, että kaikille D-negatiivisille naisille annettaisiin synnytyksen jälkeisen profylaksian lisäksi rutiininomaisesti synnytyksen aikaista anti-D-profylaksiaa, jotta immunisoitumisprosentti vähenisi entisestään. Suonensisäistä anti-D:tä käytetään nyt myös terapeuttisesti joidenkin D-positiivisten potilaiden hoitoon, joilla on immuuni trombosytopeeninen purppura (ITP) . Näin ollen anti-D:n kysyntä kasvaa.

Anti-D-immunoglobuliini valmistetaan yhdistetystä hyperimmuuniplasmasta. Monien vuosien ajan virologiseen turvallisuuteen liittyvät kysymykset ja viime aikoina Creutzfeld-Jacobin taudin muunnos (vCJD) ovat kannustaneet etsimään vaihtoehtoisia toimituksia. Yhdistyneessä kuningaskunnassa fraktiointiin käytettävä plasma hankitaan nykyään pohjoisamerikkalaisilta luovuttajilta, koska on syytä epäillä, että brittiläiset luovuttajat voivat olla vCJD:n piileviä kantajia. Jotta ihmisveriplasmasta valmistettu polyklonaalinen anti-D voitaisiin korvata bioteknisillä versioilla sekä diagnostiseen että kliiniseen käyttöön, on tuotettu satoja monoklonaalisia (mAb) tai rekombinantteja (rAb) anti-D-vasta-aineita. Ne ovat kaikki peräisin ihmisen immunoglobuliinigeeneistä tai B-soluista, koska hiiret eivät tunnista RhD-antigeenia. Erilaisia ekspressiojärjestelmiä on käytetty, kuten ihmisen B-solulinjoja, kiinalaisen hamsterin munasarjasoluja (CHO-soluja), hiiren ja ihmisen heterohybridoomia ja rotan myeloomia.

Vaikka D-immunisaation tukahduttamisen tarkkaa mekanismia passiivisen IgG:n anti-D:n antamisella ei ole vielä selvitetty, tiedetään, että D-positiiviset punasolut poistuvat nopeasti pernaan makrofagien toimesta IgG:n Fc-reseptoriin perustuvan (IgG:n) vuorovaikutuksen välityksellä, ja että ne eivät ole enää immuuni-isoisia. Sen varmistamiseksi, että profylaktinen anti-D on todennäköisesti tehokas estämään D-immunisaation suurelle FMH:lle, naiset testataan 2-3 päivää myöhemmin sen tarkistamiseksi, että sikiön solut ovat poistuneet verenkierrosta . Muuten allogeenisten punasolujen elinaika on pitkä FMH:n tai verensiirron jälkeen. Alloimmuunivasteet kehittyvät hitaasti, tyypillisesti 5-15 viikkoa anti-D:n osalta . Tämä johtuu luultavasti siitä, että niillä ei ole vaarasignaaleja (vieraista molekyyleistä), joten immuunijärjestelmä ei tunnista niitä ennen kuin ne vanhenevat, mikä sitten stimuloi niiden fagosytoosia fosfatidyyliseriinireseptorien kautta . Ilman RhD-profylaksiaa noin 17 % D-negatiivisista naisista immunisoituu raskauden jälkeen D-positiivisen sikiön kanssa . Tämä ilmaantuvuus on pienempi kuin tarkoituksellisesti immunisoiduilla normaaleilla henkilöillä (jopa noin 85 % vastaa ), koska useimmilla naisilla FMH:n tilavuudet ovat liian pieniä, jotta punasolut olisivat immunogeenisiä . Raskaana olevat naiset voivat saada voimakkaan alloimmuunivasteen sietäen samalla puoliallogeenisen sikiönsä.

Viimeisten 20 vuoden aikana 19 anti-D mAb:tä ja rAb:ta testattiin 15:ssä first-in-man-tutkimuksessa. Niitä tarkasteltiin äskettäin uudelleen, ja niistä esitetään tässä yhteenveto. Vakavia haittavaikutuksia ei esiintynyt. FcγR-välitteisen fagosytoosin ja hemolyysin in vitro -biologiset määritykset ihmisen efektorisoluilla ovat vakiintuneita, ja niitä käytettiin seulonnassa. Kliinisissä tutkimuksissa arvioitiin vasta-aineiden kykyä poistaa pieniä määriä (alle 1 %) D-positiivisia punasoluja verenkierrosta, ja joissakin tutkimuksissa määritettiin sitten myös D-vasta-aineen kyky estää D-immunisaatio. Monia mAb:eja ja rAb:eja verrattiin suoraan polyklonaaliseen anti-D:hen.

Vasta-aineiden tehossa havaittiin suurta heterogeenisuutta (taulukko 1). Kaksi ihmisen B-lymfoblastoidisolulinjoista peräisin olevaa mAb:tä, BRAD-3 ja BRAD-5, välittivät nopean punasolupuhdistuman ja estivät D-immunisaation lähes yhtä tehokkaasti kuin polyklonaalinen anti-D, vaikka käytettiin kolme-neljä kertaa suurempaa annosta . BRAD-3:n ja BRAD-5:n puoliintumisaika plasmassa oli normaali, mutta biologinen hyötyosuus oli puolet pienempi kuin polyklonaalisella anti-D:llä . Kun nämä vasta-aineet ilmaistiin rAbseina CHO-soluissa, autologisten D-positiivisten punasolujen puhdistuma oli hitaampaa kuin alkuperäisten mAbsien . Suuressa tutkimuksessa, jossa käytettiin toista CHO:sta johdettua anti-D rAb:tä, MonoRho, saatiin pettymyksen tuottavia tuloksia, sillä punasolujen puhdistuma oli erittäin vaihteleva, yleensä hyvin hidas eikä se korreloinut anti-D:n annoksen kanssa. MonoRhon erittäin alhainen biologinen hyötyosuus saattaa osittain selittää tämän. Koehenkilöt eivät kuitenkaan tuottaneet anti-D:tä, vaikka heille ei annettu D-positiivisten punasolujen haasteinjektioita D-immunisaatiotilanteen määrittämiseksi. Myös hiiren myeloomasolulinjojen (hiiren ja ihmisen heterohybridoomina) tuottamat MAb:t osoittivat suurta vaihtelua punasolujen puhdistumisessa, mutta yllättäen yli puolet vastaanottajista tuli nopeasti D-immunisoituneiksi, kaksi kertaa enemmän kuin pelkillä punasoluilla. Näillä D-vasta-aineilla oli siis adjuvanttivaikutus, joka tehosti immuunivastetta D-positiivisille punasoluille sen sijaan, että se olisi estänyt sen, kuten oli tarkoitus. Myöhemmät tutkimukset, joissa käytettiin rotan myeloomasolujen tuottamia D-vasta-aineita, osoittivat, että ne edistivät autologisten punasolujen erittäin nopeaa puhdistumista, nopeammin kuin polyklonaaliset D-vasta-aineet. FOG-1:tä ilmentävän solulinjan muuttaminen hiiren solulinjasta rotan solulinjasta rotan solulinjaan oli silmiinpistävä vaikutus, sillä se muutti puhdistuman hyvin hitaasta ja epätäydellisestä hyvin nopeaksi. Jälkimmäisessä tutkimuksessa tähän liittyi hemolyysiä, jonkin verran puhdistumista maksaan ja kuumeisia reaktioita . Näitä reaktioita ei esiinny polyklonaalisen anti-D:n ennaltaehkäisyn jälkeen. Odottamatta FOG-1 rAb:n mutantit, joilla ei ollut FcγR-interaktioita in vitro, välittivät myös nopeaa punasolujen puhdistumista, vaikka normaalia selviytymistä oli odotettu. Näiden IgG-vasta-D:iden on täytynyt sitoutua muihin reseptoreihin kuin IgG:n FcγR:ään.

Monet anti-D mAb:t ja rAb:t eivät käyttäytyneet polyklonaalisen anti-D:n tavoin. Yksikään ei ollut aivan yhtä tehokas, ja jotkut jyrsijöiden solulinjoista saadut aineet johtivat jopa ei-toivottuihin immuunivasteisiin. In vivo -vasteet määräytyivät pääasiassa vasta-aineita tuottavan solulinjan lajin eikä proteiinisekvenssin mukaan. Näiden odottamattomien ja mahdollisesti haitallisten reaktioiden syynä voi olla se, että eläinsoluista tuotetut IgG-vasta-D:t olivat vuorovaikutuksessa synnynnäisen immuunijärjestelmän komponenttien kanssa. Todennäköisin selitys on niiden oligosakkaridikoostumuksen vaihtelu.

IgG:n glykosylaatiotyyppi riippuu solusta, jossa se tuotetaan, ja se on lajikohtainen. Jyrsijöiden IgG:n N-glykolyyli-neuramiinihapon ja korkean mannoosipitoisuuden omaavien oligosakkaridien kaltaiset rakenteet voivat tunnistaa synnynnäisen immuunijärjestelmän hahmontunnistusreseptorit (PRR) vieraiksi, mistä seuraa tulehdusta edistäviä vasteita. PRR:iin kuuluvat solujen asialoglykoproteiini- ja mannoosireseptorit. Sitouduttuaan anti-D:hen D-positiivisissa punasoluissa ne ovat saattaneet stimuloida vasta-ainevasteet D-antigeeniä vastaan. Plasmassa mannaania sitova lektiini voi aiheuttaa komplementtivälitteisen hemolyysin, kun se sitoutuu punasolun anti-D:n mannoosijäämiin. Endogeeniset IgG-vasta-aineet, jotka tunnistavat galaktoosi-α1,3-galaktoosia hiiren IgG:ssä, voivat sitoa tätä oligosakkaridia ilmentävää anti-D:tä. Äskettäin endogeeninen IgE-galaktoosi–α1,3-galaktoosin vastainen IgG on aiheuttanut yliherkkyysreaktioita joillakin potilailla, jotka ovat saaneet setuksimabia (syöpäimmunoterapia), jota on tuotettu hiiren myelooman SP2/0-soluissa. Sialiinihapon puuttuminen monista anti-D mAb:istä ja rAb:ista tekisi IgG:stä pro-inflammatorisen sitoutuessaan FcγR:ään .

Polyklonaaliset anti-D:t voivat olla joko hyödyllisiä tai tappavia eri kliinisissä tilanteissa. Kohteena olevien punasolujen annos on merkittävä tekijä. Pienten punasolumäärien puhdistuminen, kuten FMH:ssa, on ”hiljainen”, ei-tulehduksellinen, ei-hemolyyttinen prosessi. Jos D-positiivinen henkilö kuitenkin saa suuria anti-D-annoksia, kuten RhD-hemolyyttistä tautia sairastavalla sikiöllä tai harvoin ITP-potilailla, joita hoidetaan anti-D:llä infuusiona, voi syntyä vakava hemolyysi. Näissä toisinaan kuolemaan johtavissa tapauksissa lisäoireita ovat yleensä hydrops (turvotus) HDFN-potilailla ja akuutti hemoglobinemia, hemoglobinuria ja disseminoitunut intravaskulaarinen koagulaatio ITP-potilailla. Useimpien akuuttien hemolyysitapausten katsottiin johtuvan pikemminkin voimakkaasta ekstravaskulaarisesta hemolyysistä (makrofagivälitteisestä) kuin intravaskulaarisesta hemolyysistä . Vaikka tällaisia vakavia haittatapahtumia ei esiintyisikään, ITP-potilailla on usein kuumetta ja vilunväristyksiä anti-D-infuusion jälkeen, mikä viittaa tulehdusreaktioihin. Näin ollen jos ITP-potilaita hoidettaisiin tulehdusta edistävillä anti-D mAb:illa tai rAb:illa nykyisen polyklonaalisen anti-D:n sijasta, seurauksena saattaisi olla monitahoinen sarja tahattomia ja mahdollisesti vaarallisia reaktioita.

TGN1412:n vaiheen 1 tutkimuksen jälkeen anti-D:n kliinisten tutkimusten eräistä näkökohdista voi olla apua muiden immunoterapeuttisten lääkkeiden, erityisesti veressä oleviin soluihin kohdistuvien lääkkeiden, ensitutkimusten tulevassa kehittämisessä ja sääntelyssä (taulukko 2). Aloitusannoksen valinta on erityisen tärkeää. Kaikissa ihmisillä tehdyissä tutkimuksissa käytettiin pieniä annoksia punasoluja ja anti-D:tä. Joissakin tutkimuksissa, esimerkiksi BRAD-3-tutkimuksessa, autologiset punasolut (0-5 ml) päällystettiin anti-D:llä ex vivo, minkä jälkeen ne pestiin ja ruiskutettiin, jolloin vasta-aineannos minimoitiin ja haittavaikutusten mahdollisuus väheni. Näin pienten punasolumäärien poistumista voitiin seurata tarkasti, kun ne leimattiin isotooppisesti. Kun tämä vasta-aine osoittautui turvalliseksi ja tehokkaaksi, anti-D:tä ja punasoluja ruiskutettiin erikseen kliinisen tilanteen simuloimiseksi tarkemmin. Anti-D:n ja punasolujen pienillä annoksilla esiintyneiden tulehdusreaktioiden todisteet varmistavat varovaisuuden skaalaustutkimuksissa.

Johtopäätös, anti-D mAbien ja rAbien ihmisillä tehdyistä tutkimuksista saadut laajat tiedot viittaavat siihen, että niiden glykosylaatiolla on saattanut olla voimakas vaikutus niiden in vivo -aktiivisuuden muokkaamiseen. Jotkin rAbit pikemminkin lisäsivät kuin vähensivät D-immunisaation esiintyvyyttä, yksi aiheutti haitallisia hemolyyttisiä reaktioita ja yhdellä oli erittäin alhainen biologinen hyötyosuus. Näitä vaikutuksia ei voitu ennustaa tehtyjen in vitro -tutkimusten perusteella. Kun tulevaisuudessa kehitetään rekombinantteja glykoproteiineja ihmishoitoa varten, olisi otettava huomioon mahdollisuus, että muiden kuin ihmisen oligosakkaridien ja muiden solujen tai molekyylien kuin aiotun ligandin välillä voi esiintyä vuorovaikutuksia.