2.03.3.1 Nesteadsorptio- ja gradienttikromatografia
Jokainen vuorovaikutuskromatografiatyyppi vaatii liikkuvan faasin, joka sisältää kaksi tai useampia liuottimia. Nesteadsorptiokromatografiassa (Liquid Adsorption Chromatography, LAC) alku- ja loppuliukoinen liikkuva faasi ovat hyviä liuottimia polymeerille. Useimmissa tapauksissa stationäärifaasina käytetään silikageeliä. Pylvääseen ruiskutettu näyte adsorboituu piidioksidin pinnalle alkuperäisessä liikkuvassa faasissa. Hyvin pienimolaarisilla näytteillä adsorptio voi olla riittävän heikkoa, ja desorptio voi tapahtua samassa liikkuvassa faasissa. Tällöin eluointi tapahtuu isokraattisissa olosuhteissa.
Useimmissa tapauksissa ja erityisesti suuremman moolimassan näytteille adsorptio on liian voimakasta. Liikkuvan faasin vahvuudella on dramaattinen vaikutus retentioon. Heikolla liikkuvalla faasilla polymeerin retentioaika ylittää yleensä reilusti kaiken kohtuullisen kokeellisen ajan. Eluution voimakkuuden lisääminen johtaa lopulta äkillisesti päinvastaiseen käyttäytymiseen: polymeeriä ei pidätä lainkaan ja se poistuu kolonnista välitilavuudella Vo. Eluutio-olosuhteiden pieni muutos aiheuttaa siirtymisen nollaretentiosta äärettömään. Tämä ”päälle tai pois” -käyttäytyminen voidaan ymmärtää moninkertaisen kiinnittymisen seurauksena.3 Synteettiset polymeerit koostuvat suuresta määrästä toistuvia yksiköitä. Periaatteessa kaikilla niistä on mahdollisuus adsorboitua, mutta adsorboituneen polymeerikierukan konformaatio koostuu yleensä silmukoista ja hännistä, jotka ulottuvat liuokseen, sekä adsorboituneiden toistoyksiköiden ketjuista. Polymeeriketju pysyy stationäärifaasissa niin kauan kuin vähintään yksi sen toistuvista yksiköistä on adsorboitunut. Ketju voi siirtyä vain, jos kaikki sen muodostavat yksiköt ovat liikkuvassa faasissa. Jos oletetaan, että kunkin yksikön adsorptio-desorptiotasapaino on riippumaton, makromolekyylin liikkuvuusehto on toistoyksiköiden vastaavien todennäköisyyksien ja ketjun pituuden funktio. Heikkojen eluenttien ja pitkien polymeeriketjujen osalta voidaan olettaa, että aina on olemassa toistoyksikkö, joka on vuorovaikutuksessa pakkausmateriaalin kanssa. Näin ollen todennäköisyys sille, että makromolekyyli säilyy hyvin pitkään, on hyvin suuri. Näin ollen useimmissa tapauksissa on käytettävä liuotingradientteja liikkuvan faasin liuotinlujuuden lisäämiseksi ja makromolekyylien adsorptio-desorptiokäyttäytymisen tasapainottamiseksi.
LAC:ia on sovellettu laajalti kopolymeerien erottamiseen kemiallisen koostumuksen mukaan, ja ensimmäisen artikkelin julkaisivat Teramachi et al. vuonna 1979.12 Mori ym. kehittivät erotusmenetelmiä erilaisille styreeni-akrylaattikopolymeereille, kun taas Mourey ym. keskittyivät erilaisiin polyakrylaattiyhdistelmiin.13-17
Toinen tärkeä näkökohta polymeerien adsorptiokromatografiassa on liukoisuus. Liukoisuus edellyttää yleensä Gibbsin vapaan energian negatiivista muutosta sekoittuessa. Tämä täyttyy helposti pienimolaarisilla liuoksilla suuren entropiaosuuden vuoksi. Pienimolekyylisissä sekoittumisprosesseissa osuus TΔSm on niin suuri, että edes positiiviset ΔHm-arvot eivät estä liukenemista. Toisin kuin pienimolaarisilla yhdisteillä, makromolekyyleillä on yleensä alhainen järjestys kiinteässä tilassa. Tämän lisäksi toistoyksiköiden säännöllinen järjestys polymeeriketjua pitkin säilyy liuetessa. Lisäksi samanpainoisissa liuoksissa liuenneiden hiukkasten määrä on paljon suurempi pienimolaarisissa näytteissä kuin polymeerisysteemeissä. Näin ollen entropian osuus ΔGm:ään on pieni, ja ehto ΔGm < 0 edellyttää negatiivista entalpian muutosta, ΔHm < 0. Näin ollen liuottimen liukoisuusparametrien on oltava hyvin lähellä polymeerin parametreja. Sen lisäksi, että makromolekyylien liukoisuus liikkuvaan faasiin on riittävä, liikkuvalta faasilta vaaditaan tietty liuottimen vahvuus. Adsorptiokromatografian erotusmekanismi huomioon ottaen liuottimen vahvuuden on oltava riittävän suuri, jotta se edistää makromolekyylien desorptiota pakkauksesta.
Yksi LC-tyypiksi, jossa hyödynnetään kemialliselta koostumukseltaan erilaisten makromolekyylien liukoisuutta, on korkean suorituskyvyn saostusnestekromatografia (High Performance Precipitation Liquid Chromatography, HPPLC).3 HPPLC:ssä aluksi käytettävä liikkuva faasi on näytteelle liukenemattomaksi tarkoitettu aine niin, että pylvääseen ruiskutettu näyte saostuu. Tämän jälkeen suoritetaan gradienttieluutio lisäämällä näytteeseen hyvää liuotinta, jolloin fraktiot alkavat uudelleen liueta ja eluoitua liikkuvaan faasiin. Koska liukoisuus on kemiallisen koostumuksen funktio, HPPLC:tä voidaan käyttää kopolymeerien ja polymeeriseosten kemiallisen koostumuksen erottamiseen. Glöckner ja muut ovat esittäneet esimerkkejä tällaisesta erottelusta styreeni- ja akrylaattikopolymeerien osalta.18-21
Hyvin usein erottelutekniikkaa on vaikea luokitella LAC:ksi tai HPPLC:ksi, koska ei ole täysin selvää, saostuuko näyte kokonaan alkuperäisessä liikkuvassa faasissa (makromolekyylien erilaiset kemialliset koostumukset). Tällaisissa tapauksissa erottelu voidaan luokitella normaalifaasiseksi nestekromatografiaksi (NP-LC) tai käänteisfaasiseksi nestekromatografiaksi (RP-LC). Molemmissa tapauksissa alkuperäisen ja lopullisen liikkuvan faasin on oltava näytteen kannalta hyviä liuottimia. NP-LC:ssä käytetään polaarista (hydrofiilistä) stationäärifaasia. Alkuperäinen liikkuva faasi on vähemmän polaarinen ja liuottimen voimakkuutta lisätään lisäämällä polaarista liuotinta. Tyypillisiä esimerkkejä ovat n-heksaani-tetrahydrofuraani (THF)22 ja n-heksaani-kloroformi.23 RP-LC:ssä käytetään poolittomia (hydrofobisia) pysyviä faaseja ja polaarista alkuperäistä liikkuvaa faasia, jota muutetaan gradientin aikana vähemmän polaarisella liuottimella. Tyypillisiä esimerkkejä tässä tapauksessa ovat ACN-THF24 ja ACN-metyleenikloridi.25
Tyypillinen esimerkki satunnaisten kopolymeerien erottamisesta NP-LC:llä on esitetty kuvassa 3. Käyttämällä syanopropyylisidonnaista silikageeliä stationäärifaasina ja liuotingradienttia iso-oktaani-THF, desyylimetakrylaatin ja metyylimetakrylaatin kopolymeerit erotettiin koostumuksen mukaan.26 Tuoreemmassa sovelluksessa Garcia et al. osoittivat, että erittäin tehokkaita RP-LC-erotuksia voidaan tehdä hyvin lyhyillä kolonneilla ja jyrkillä gradienteilla alle 3 minuutissa (ks. kuva 4).27
Kuva 3. Satunnaisten desyylimetakrylaatti-metyylimetakrylaatti-kopolymeerien gradientti-HPLC-kromatogrammit. Paikallaan oleva faasi: Nucleosil 5 CN, 200 mm × 4,6 mm i.d.; liikkuva faasi: iso-oktaani-THF-gradientti. Kopolymeerien koostumukset on ilmoitettu DMA-MMA:na mol.%:na.
Painettu teoksesta Pasch, H.; Trathnigg, B. HPLC of Polymers; Springer: Berlin-Heidelberg-New York, 1998,2 Springer Science+Business Media -yhtiön ystävällisellä luvalla.
Kuvio 4. Styreeni-etyyliakrylaattikopolymeerien viiden HPLC-erotuksen päällekkäisyys. Keskimääräiset styreenipitoisuudet ja keskihajontapalkit on annettu. Paikallaan oleva faasi: Luna C18 100 Å, 30 mm × 4,6 mm i.d.; liikkuva faasi: THF-ACN-gradientti; kopolymeerien nimellinen styreenipitoisuus: 0 mol.% (1), 20 mol.% (2), 40 mol.% (3), 60 mol.% (4), 80 mol.% (5) ja 100 mol.% (6).
Luvalla otettu lähteestä: Garcia Romero, I.; Bashir, M. A.; Pasch, H. e-Polymers 2005, 079,27.
.