Fluoresenssi

Fluoresenssi on useimmiten kylmissä kappaleissa optisena ilmiönä esiintyvä luminesenssi, jossa molekyylien absorptio tietyllä aallonpituudella olevasta fotonista laukaisee toisen, pidemmän aallonpituuden omaavan fotonin emission. Fluoresoivaa ainetta kutsutaan fluorofooriksi. Absorboituneiden ja emittoituneiden fotonien välinen energiaero päätyy molekyylien värähtelyksi tai lämmöksi. Yleensä absorboitunut fotoni on ultraviolettialueella ja emittoitunut valo on näkyvällä alueella, mutta tämä riippuu käytetystä fluorofoorista ja muista tekijöistä.

Fluoresenssi on saanut nimensä kalsiumfluoridista koostuvan mineraalin fluoriitin mukaan, jossa tämä ilmiö usein esiintyy. Myös monet muut mineraalit ja orgaaniset materiaalit fluoresoivat, ja niitä käytetään useissa eri sovelluksissa. Fluoresenssista on hyötyä esimerkiksi molekyylien valaisemisessa ja merkitsemisessä analyyttisessä kemiassa ja biokemiassa. Fluoroforeja on käytetty solujen, vasta-aineiden ja muiden biologisten rakenteiden merkitsemiseen sekä niiden rakenteiden ja vaikutustapojen määrittämiseen.

Esimerkkejä fluoresoivista materiaaleista

Kivillä, mineraaleilla, kuiduilla ja monilla muilla materiaaleilla, joihin törmää rikosteknisessä tutkimuksessa tai jotka liittyvät erilaisiin keräilyesineisiin, voi olla ominaista fluoresenssia tai ne voivat fluoresoida eri tavalla lyhytaaltoisessa ultraviolettisäteilyssä, pitkäaaltoisessa ultraviolettisäteilyssä tai röntgensäteilyssä.

Monet kalsiittityypit ja meripihka fluoresoivat lyhytaaltoisessa ultraviolettisäteilyssä. Rubiinit, smaragdit ja Hope-timantti fluoresoivat punaisena lyhytaaltoisessa UV-valossa; timantit säteilevät valoa myös röntgensäteilyllä.

Raakaöljy (maaöljy) fluoresoi eri värejä, jotka vaihtelevat raskaiden öljyjen ja tervojen tylsän ruskeasta väristä hyvin kevyiden öljyjen ja kondensaattien kirkkaan kellertävään ja sinertävän valkoiseen. Tätä ilmiötä käytetään öljynetsintäporauksessa hyvin pienten öljymäärien tunnistamiseen porausjätteistä ja ydinnäytteistä.

Organiset nesteet, kuten antraseenin ja bentseenin tai tolueenin seokset tai stilbeenin seokset samoissa liuottimissa, fluoresoivat ultravioletti- tai gammasäteilyllä. Tämän fluoresenssin hajoamisajat ovat nanosekuntien luokkaa, koska valon kesto riippuu fluoresoivan aineen, tässä tapauksessa antraseenin tai stilbeenin, kiihottuneiden tilojen eliniästä.

Sovellukset

On olemassa monia luonnollisia ja synteettisiä yhdisteitä, jotka osoittavat fluoresenssia, ja niillä on useita sovelluksia. Jotkin syvänmeren eläimet, kuten greeneye, käyttävät fluoresenssia.

Valaistus

Yleinen loisteputki perustuu fluoresenssiin. Lasiputken sisällä on osittainen tyhjiö ja pieni määrä elohopeaa. Putkessa tapahtuva sähköpurkaus saa elohopea-atomit lähettämään valoa. Emittoitunut valo kuuluu ultraviolettialueelle (UV), on näkymätöntä ja haitallista useimmille eläville organismeille. Putki on vuorattu fosforiksi kutsutulla fluoresoivalla aineella, joka absorboi ultraviolettisäteilyä ja lähettää uudelleen näkyvää valoa. Loisteputkivalaisimet ovat erittäin energiatehokkaita verrattuna hehkulampputekniikkaan, mutta niiden tuottama spektri saattaa saada tietyt värit näyttämään epäluonnollisilta.

1990-luvun puolivälissä tulivat saataville valkoiset valoa säteilevät diodit (LEDit), jotka toimivat samanlaisen prosessin avulla. Tyypillisesti varsinainen valoa lähettävä puolijohde tuottaa valoa spektrin sinisessä osassa, joka osuu sirulle sijoitettuun fosforiyhdisteeseen; fosfori fluoresoi spektrin vihreästä punaiseen osaan. Fosforin läpi kulkevan sinisen valon ja fosforin emittoiman valon yhdistelmä tuottaa valkoisen valon nettopäästön.

Nykyaikaisen elohopeahöyryllä toimivan katulampun sanotaan kehittyneen loistelampusta.

Hehkulamput hapettavat fenyylioksalaattiesterin tuottaakseen valoa.

Kompakti loisteputkivalo (CFL, Compact Fluorescent Lighting) on samanlainen kuin mikä tahansa tyypillinen loisteputkivalaisin, mutta siinä on etuja. Se on itsepallastoituva ja sitä käytetään korvaamaan hehkulamput useimmissa sovelluksissa. Ne tuottavat neljänneksen vähemmän lämpöä lumenia kohti kuin hehkulamput ja kestävät noin viisi kertaa kauemmin. Nämä lamput sisältävät elohopeaa, ja niitä on käsiteltävä ja hävitettävä varoen.

Analyyttinen kemia

Fluoresenssi useilla aallonpituuksilla voidaan havaita array-detektorilla yhdisteiden havaitsemiseksi HPLC-virtauksesta. Myös ohutkerroskromatografialevyt (TLC) voidaan visualisoida, jos yhdisteet tai värjäysreagenssi on fluoresoiva.

Sormenjäljet voidaan visualisoida fluoresoivilla yhdisteillä, kuten ninhydriinillä.

Biokemia ja lääketiede

Biologiset molekyylit voidaan merkitä fluoresoivalla kemiallisella ryhmällä (fluoroforilla) yksinkertaisella kemiallisella reaktiolla, ja tunnisteen fluoresenssi antaa mahdollisuuden herkkään ja kvantitatiiviseen tunnistamiseen. Esimerkkejä ovat:

• Kudosten, solujen tai alisolurakenteiden fluoresenssimikroskopointi saadaan aikaan merkitsemällä vasta-aine fluoroforilla ja antamalla vasta-aineen löytää kohdeantigeeninsä näytteestä. Merkitsemällä useita vasta-aineita eri fluoroforeilla voidaan visualisoida useita kohteita yhdessä kuvassa.
• Automaattinen DNA:n sekvensointi ketjupäätteistysmenetelmällä; kullakin neljästä eri ketjupäätteisestä emäksestä on oma spesifinen fluoresoiva tunnisteensa. Kun leimatut DNA-molekyylit erotetaan toisistaan, fluoresoiva leima herätetään UV-lähteellä, ja molekyylin päättävän emäksen identiteetti tunnistetaan emittoituneen valon aallonpituuden perusteella.
• DNA:n havaitseminen: yhdisteellä etidiumbromidilla, joka voi vapaasti muuttaa konformaatiotaan liuoksessa, on hyvin vähän fluoresenssia. Etidiumbromidin fluoresenssi voimistuu huomattavasti, kun se sitoutuu DNA:han, joten tämä yhdiste on erittäin hyödyllinen DNA-fragmenttien sijainnin visualisoinnissa agaroosigeelielektroforeesissa. Etidiumbromidi voi olla myrkyllistä; turvallisempi vaihtoehto on väriaine SYBR Green.
• The DNA microarray
• Immunologia: Vasta-aineeseen on kiinnitetty fluoresoiva kemiallinen ryhmä, ja paikat (esim. mikroskooppisessa näytteessä), joihin vasta-aine on sitoutunut, voidaan nähdä ja jopa kvantifioida fluoresenssin avulla.
• FACS (fluoresenssiaktivoitu solulajittelu)
• Fluoresenssia on käytetty DNA:n ja valkuaisaineiden rakenteen ja konformaatioiden tutkimiseen tekniikoilla, joita ovat esimerkiksi fluoresenssin resonanssinergiansiirto, joka mittaa etäisyyttä angströmin tasolla. Tämä on erityisen tärkeää useiden biomolekyylien muodostamissa komplekseissa.
• Aequorin, joka on peräisin meduusasta Aequorea victoria, tuottaa sinistä hehkua Ca2+-ionien läsnä ollessa (kemiallisen reaktion avulla). Sitä on käytetty kalsiumin virtauksen kuvaamiseen soluissa reaaliajassa. Aequorinin menestys kannusti tutkimaan A. victoriaa lisää ja johti vihreän fluoresoivan proteiinin (GFP) löytämiseen, josta on tullut erittäin tärkeä tutkimusväline. GFP:tä ja siihen liittyviä proteiineja käytetään ilmoittajina monille biologisille tapahtumille, kuten solunalaiselle lokalisaatiolle. Geenien ilmentymistasoja mitataan joskus liittämällä GFP:n tuottamiseen tarkoitettu geeni toiseen geeniin.

Monilla biologisilla molekyyleillä on myös luontainen fluoresenssi, jota voidaan joskus käyttää ilman kemiallisen tunnisteen liittämistä. Joskus tämä luontainen fluoresenssi muuttuu, kun molekyyli on tietyssä ympäristössä, joten molekyylin jakautumista tai sitoutumista voidaan mitata. Esimerkiksi bilirubiini fluoresoi voimakkaasti, kun se sitoutuu seerumin albumiinin tiettyyn kohtaan. Sinkkiprotoporfyriinillä, jota muodostuu kehittyvissä punasoluissa hemoglobiinin sijasta, kun rautaa ei ole saatavilla tai lyijyä on läsnä, on kirkas fluoresenssi, ja sitä voidaan käyttää näiden ongelmien havaitsemiseen.

Vuonna 2006 fluoresenssisovellusten määrä on kasvussa biolääketieteellisessä biologiassa ja siihen liittyvissä tieteissä. Myös analyysimenetelmät näillä aloilla lisääntyvät, vaikkakin yhä epäonnisemmalla nimikkeistöllä lyhenteiden muodossa, kuten esim: FLIM, FLI, FLIP, CALI, FLIE, FRET, FRAP, FCS, PFRAP, smFRET, FIONA, FRIPS, SHREK, SHRIMP, TIRF. Useimmat näistä tekniikoista perustuvat fluoresenssimikroskooppeihin. Näissä mikroskoopeissa käytetään suuren intensiteetin valonlähteitä, yleensä elohopea- tai ksenonlamppuja, LEDejä tai lasereita, herättämään fluoresenssia tarkkailtavassa näytteessä. Tämän jälkeen optiset suodattimet erottavat herätevalon emittoituneesta fluoresenssista, joka havaitaan silmin tai (CCD)-kameralla tai muilla valonilmaisimilla (fotomonistinputket, spektrografit jne.). Tällaisten mikroskooppien, käytettyjen fluoresoivien koettimien ja niiden sovellusten ominaisuuksien parantamiseksi tehdään parhaillaan paljon tutkimusta. Erityisen huomionarvoisia ovat konfokaalimikroskoopit, jotka käyttävät neulanreikää optisen leikkauksen aikaansaamiseksi, jolloin näytteestä saadaan kvantitatiivinen, kolmiulotteinen kuva.

Turvallisuus

Fluoresenssilamput tuottavat paljon vähemmän hukkalämpöä kuin hehku- ja halogeenilamput. Halogeenilamput ovat osallisina suuressa määrässä tulipaloja, ja myös hehkulampuissa on hukkalämmön vuoksi suurempi tulipaloriski kuin loistelampuissa. Lamput voivat kaatua vahingossa tai joskus maanjäristysten kaltaisten tapahtumien seurauksena. Loistelamppujen käyttö voi siis olla keino ehkäistä tahattomia tulipaloja. Loistelamput voivat kuitenkin sisältää elohopeaa, ja tällaisen lampun rikkoutuminen voi johtaa kalliiseen elohopeavuotoon.

Teoreettisia pohdintoja

Fotokemia

Fluoresenssi syntyy, kun molekyyli tai kvanttipiste relaksoituu perustilaansa sen jälkeen, kun se on elektronisesti kiihdyttänyt itseään.

Kiihdytys: S 0 + h ν → S 1 {\displaystyle S_{0}+h\nu \to S_{1}}

Fluoresenssi (emissio): S 1 → S 0 + h ν {\displaystyle S_{1}\to S_{0}+h\nu } {\displaystyle S_{1}\to S_{0}+h\nu } , tässä h ν {\displaystyle h\nu } on yleinen termi fotonien energialle, jossa: h = Planckin vakio ja ν {\displaystyle \nu } = valon taajuus. (Jännittyvän ja emittoituvan valon erityiset taajuudet riippuvat tietystä systeemistä.)

Tilaa S0 kutsutaan fluorofoorin (fluoresoivan molekyylin) perustilaksi ja S1 on sen ensimmäinen (elektronisesti) jännittynyt tila.

Jännittyneessä tilassaan S1 oleva molekyyli voi relaksoitua useilla kilpailevilla reiteillä. Se voi läpikäydä ”ei-säteilevän relaksaation”, jossa heräte-energia haihtuu lämpönä (värähtelynä) liuottimeen. Jännittynyt orgaaninen molekyyli voi relaksoitua myös muuttumalla triplettitilaan, joka voi sen jälkeen relaksoitua fosforesenssin kautta tai toissijaisen ei-säteilevän relaksaatiovaiheen kautta.

S1-tilan relaksaatio voi tapahtua myös vuorovaikutuksessa toisen molekyylin kanssa fluoresenssin vaimentamisen kautta. Molekulaarinen happi (O2) on erittäin tehokas fluoresenssin vaimentaja sen epätavallisen tripletti perustilan vuoksi.

Molekyylit, jotka kiihottuvat valon absorption kautta tai jonkin muun prosessin kautta (esim. reaktiotuotteena), voivat siirtää energiaa toiselle ”herkistyneelle” molekyylille, joka muuttuu kiihottuneeseen tilaansa ja voi sitten fluoresoida. Tätä prosessia käytetään valopuikoissa.

Fluoresenssin kvanttituotto

Fluoresenssin kvanttituotto kertoo fluoresenssiprosessin tehokkuuden. Se määritellään emittoitujen fotonien lukumäärän ja absorboitujen fotonien lukumäärän suhteena.

Φ = # p h o t o n s e m i t t e d # p h o t o n s a b s o r b e d {\displaystyle \Phi ={\frac {\rm {\##\\\ fotonit\ emittoituneet}{\rm {\##\\ fotonit\ absorboituneet}}}}

Fluoresenssin maksimaalinen kvanttituotto on 1,0 (100 prosenttia); jokainen absorboitunut fotoni johtaa emittoituneeseen fotoniin. Yhdisteitä, joiden kvanttituotto on 0,10, pidetään edelleen melko fluoresoivina. Toinen tapa määritellä fluoresenssin kvanttituotto, on herätetyn tilan hajoamisnopeus:

k f ∑ i k i {\displaystyle {\frac {{k}_{f}}{\sum _{i}{k}_{i}}}}

jossa k f {\displaystyle {k}_{f}}} on säteilyn spontaanin emissionopeus ja

∑ i k i {\displaystyle \sum _{i}{k}_{i}}

on kaikkien virittyneiden tilojen hajoamisnopeuksien summa. Muut kiihdytetyn tilan hajoamisnopeudet johtuvat muista mekanismeista kuin fotoniemissiosta, ja siksi niitä kutsutaan usein ”ei-säteilyyn perustuviksi nopeuksiksi”, joita voivat olla:dynaaminen törmäysvaimennus, lähikentän dipoli-dipoli-vuorovaikutus (tai resonanssienergiansiirto), sisäinen konversio ja systeemien väliset ylitykset. Jos siis jonkin reitin nopeus muuttuu, se vaikuttaa sekä virittyneen tilan elinikään että fluoresenssin kvanttituottoon.

Fluoresenssin kvanttituotto mitataan vertaamalla sitä standardiin, jolla on tunnettu kvantologia; kiniinisuola, kiniinisulfaatti, rikkihappoliuoksessa on yleinen fluoresenssistandardi.

Fluoresenssin elinaika

Fluoresenssin elinaika tarkoittaa keskimääräistä aikaa, jonka molekyyli viipyy virittyneessä tilassaan ennen fotonin lähettämistä. Fluoresenssi noudattaa tyypillisesti ensimmäisen kertaluvun kinetiikkaa:

= 0 e – Γ t , {\displaystyle \left=\left_{0}e^{-\Gamma t},}

jossa {\displaystyle \left} on innostuneen tilan molekyylien konsentraatio hetkellä t {\displaystyle t} , 0 {\displaystyle \left_{0}} on alkukonsentraatio ja Γ {\displaystyle \Gamma} on alkukonsentraatio. on hajoamisnopeus eli fluoresenssin eliniän käänteisluku. Tämä on eksponentiaalisen hajoamisen tapaus. Erilaiset säteilevät ja ei-säteilevät prosessit voivat tyhjentää poistuneen tilan. Tällöin kokonaishajoamisnopeus on kaikkien nopeuksien summa:

Γ t o t = Γ r a d + Γ n r a d {\displaystyle \Gamma _{tot}=\Gamma _{rad}+\Gamma _{nrad}}

jossa Γ t o t {\displaystyle \Gamma _{tot}} on kokonaishajoamisnopeus, Γ r a d {\displaystyle \Gamma _{rad}} säteilevä hajoamisnopeus ja Γ n r a d {\displaystyle \Gamma _{nrad}} ei-säteilevä hajoamisnopeus. Se muistuttaa ensimmäisen kertaluvun kemiallista reaktiota, jossa ensimmäisen kertaluvun nopeusvakio on kaikkien nopeuksien summa (rinnakkaiskineettinen malli). Jos spontaanin emission nopeus tai jokin muu nopeus on nopea, elinikä on lyhyt. Yleisesti käytetyille fluoresoiville yhdisteille tyypilliset virittyneiden tilojen hajoamisajat fluoresoiville yhdisteille, jotka emittoivat fotoneja, joiden energia vaihtelee UV:stä lähi-infrapuna-alueelle, ovat välillä 0,5-20 nanosekuntia. Fluoresenssin elinikä on tärkeä parametri fluoresenssin käytännön sovelluksissa, kuten fluoresenssiresonanssienergiansiirrossa.

Säännöt

Fluoresenssia käsitteleviä sääntöjä on useita. Kasha-Vavilovin sääntö määrää, että luminesenssin kvanttituotto on riippumaton stimuloivan säteilyn aallonpituudesta.

Tämä sääntö ei aina päde ja sitä rikotaan vakavasti monissa yksinkertaisissa molekyyleissä. Hieman luotettavampi väite, vaikkakin edelleen poikkeuksia sisältäen, on, että fluoresenssispektri osoittaa hyvin vähän riippuvuutta stimuloivan säteilyn aallonpituudesta.

Katso myös

• Fluorescein
• Fluoresenssilamppu
• Valo
• Fosforesenssi
• Röntgensäteily

• Lakowicz, Joseph R. 2006. Principles of Fluorescence Spectroscopy, 3rd ed. New York: Springer. ISBN 978-0387312781
• Turro, Nicholas J. 1991. Modern Molecular Photochemistry. Mill Valley, CA: University Science Books. ISBN 0935702717
• Valeur, Bernard. 2002. Molecular Fluorescence: Principles and Applications. Weinheim: Wiley-VCH. ISBN 352729919X

Kaikki linkit haettu 14.4.2017.

• Fluorofoorit.org The database of fluorescent dyes
• Fluorescence on Scienceworld
• Basic Concepts in Fluorescence