Observation of fertilized embryos to cleavage embryos
Since the first rabbit embryo culture was described in 1912 and mouse zygote could be cultured in vitro to form blastocyst stage embryos , alkion laadusta on tullut tärkeä tekijä raskauden kannalta sen jälkeen, kun koeputkialkio on siirretty kohtuun, koska alkion laatu korreloi läheisesti siirretyn alkion istutuksen kanssa kohtuun. Ensimmäisen koeputkilapsen, Louise Brownin, syntymän jälkeen heinäkuussa 1978, josta Robert Edwardsille myönnettiin vuoden 2010 fysiologian tai lääketieteen Nobel-palkinto koeputkihedelmöityksen (IVF) ja alkionsiirron (ET) kehittämisestä sellaisten naisten hedelmättömyyden hoitamiseksi, joilla ei ole patentoivia munanjohtimia, koeputki-alkioiden tuotantoa (IVP, in vitro embryo production) on käytetty laajalti ihmisten hedelmättömyyden hoidossa ja eläinpopulaatioiden lisääntymisessä ja laajentamisessa. Avustetun lisääntymistekniikan onnistuminen riippuu kuitenkin pääasiassa sellaisten elinkelpoisten alkioiden tuottamisesta, joilla on suuri implantoitumispotentiaali. Vielä tärkeämpää on, että parhaan siirrettävän alkion valinnasta on tullut IVF:n suurin haaste. Alkioiden varhaisessa viljelyssä alkion laadun arviointi perustui pääasiassa siirrettyjen alkioiden morfologisiin kriteereihin. Näin ollen alkion morfologian sarjahavainnointi on embryologien yleinen tekniikka alkioiden arvioimiseksi, ja sitä on pidetty tärkeimpänä implantaation ja raskauden ennusteena. Pitkällä aikavälillä alkiolääkärit arvioivat alkioiden laatua ja morfologiaa ottamalla alkiot pois inkubaattorista ja asettamalla ne mikroskoopin alle. Morfologian havainnoinnin lisäksi tutkijat ovat kiinnostuneita useista tutkimuksista, jotka koskevat solujen ydinmuutoksia, geenien aktivoitumista ja ilmentymistä, sytoplasman proteiinien ilmentymistä, blastomereiden erilaistumista ja niin edelleen. Nämä tutkimukset johtavat kuitenkin usein alkioiden kuolemaan. Esimerkiksi varhaisessa tutkimuksessamme, jossa havainnoitiin mikrospiraalimuutosta siittiöiden päästyä munasoluun tai munasolun aktivoinnin jälkeen, lannoitetut zygootit tai aktivoidut munasolut oli kiinnitettävä objektilasille ja värjättävä immunosytokemiallisella fluoresceiinilla ja laser-konfokaalimikroskopialla . Tutkimuksemme osoitti selvästi mikrotubulusten ja kromatiinin muuttumisen naudan munasolun aktivoinnin ja introsytoplasmisen siittiöinjektion (ICSI; kuva 1) jälkeen. Siittiöt munasoluun tai kalsiumionofori ja etanoli voivat aktivoida munasolun ja aiheuttaa toisen polaarirungon ekstruusion. Toisen polaarirungon ajankohdan havainnoimiseksi värjäsimme munasolujen eri vaiheita aktivoinnin jälkeen. Tulos osoitti, että 5 tunnin kuluttua aktivoinnin jälkeen toinen polaarinen keho voi olla täysin ekstrudoitunut (kuva 2).
Kuva 1. Otokyytit.
Laserkeilaava konfokaalimikroskopia karan ja kromatiinin muutoksista eri ajankohtina aktivoinnin ja intrasytoplasmisen siittiöiden injektion (ICSI) jälkeen naudalla. Isot kirjaimet (vasemmalla) osoittavat muutoksen aktivoinnin jälkeen ja pienet kirjaimet (oikealla) ICSI:n jälkeen. A/a osoitti 0,5 tuntia, B/b on 2 tuntia, C/c on 3 tuntia ja D/d on 7 tuntia aktivoinnin tai ICSI:n jälkeen. Prenucleus aktivoidussa munasolussa ja prenucleus ICSI-munasolussa ovat näkyneet punaisella värillä.
Kuvio 2.
Laser-skannaava konfokaalimikroskopia spindle- ja kromatiinimuutosten näkymisestä aktivoinnin jälkeisinä eri ajankohtina naudalla. Spindelin kromosomit alkavat jakautua 0,5 tunnin kuluttua aktivoinnista, ja spindelin jakautumisen loppuunsaattamiseen tarvitaan noin 3 tuntia, ja toinen polaarinen runko voi purkautua noin 5 tunnin kuluttua. Punainen ja vihreä yhdessä osoittavat karaa, ja punainen piste osoittaa ensimmäistä polaarista kehoa.
Geeniekspression tutkiminen edellyttää usein mRNA:n tai proteiinin eristämistä alkioista ; näin ollen alkiot olisi lysoitava, eikä yksikään alkio jäisi eloon. Solujen erilaistumisen tutkimiseksi moraali- ja blastokystavaiheen alkioissa on käytetty kaksoisvärjäystä fluoreseiinimikroskopiamenetelmällä sisäisen solumassan (ICM) erottamiseksi trofo-ekodermista (TE). Kahden eri solun lukumäärät voidaan laskea eri värien perusteella (ICM sinisenä ja TE vaaleanpunaisena, kuva 3).
Kuva 3.
Erilaisten solujen erottaminen naudan blastokystaalkioissa kaksoisvärjäyksen avulla. Ylimmässä kuvassa on blastokystaalkio, jossa on merkitty sisäinen solumassa (ICM) ja trofektodermisolujen (TE) ympärillä. Alemmassa kuvassa on naudan blastokystan alkio kaksoisvärjättynä, jossa sinisellä on ICM-solut ja vaaleanpunaisella TE-solut. Ylempi kuva on peräisin verkkosivujen hausta, ja kirjoittaja kiittää suuresti professori Fuliang Du:n kohteliaisuutta julkaisemattomasta alemmasta kuvasta.
Nämä tutkimusmenetelmät vahingoittavat lopulta kaikkia alkioita, eikä näitä menetelmiä voida soveltaa kliiniseen käytäntöön. Näin ollen nykyinen alkioiden laadunarviointi perustuu ensisijaisesti siirrettyjen alkioiden morfologisiin kriteereihin, joihin kuuluu kolme pääparametria, kuten blastomeerien säännöllisyys, pirstaleisuus ja sytoplasman rakeisuus . Alkion laadun arvioinnissa voidaan ottaa huomioon myös alkion solujen lukumäärä eri viljelypäivinä ja moniytimisyys . Useissa raporteissa on todettu yhteys hajautumisvaiheen alkioiden morfologisten ominaisuuksien ja raskauden onnistumisen välillä. Näin ollen tämä on tällä hetkellä perusmenetelmä alkion laadun arvioinnissa ihmisen IVF:ssä ja eläinten in vitro -alkioiden tuotannossa. Vaikka tätä menetelmää on helppo käyttää, siinä otetaan kuitenkin usein alkiot pois inkubaattorista, mikä aiheuttaa huolta viljelyolosuhteiden turvallisuudesta ja vakaudesta. Tarkkailun aikana saattaa myös jäädä huomaamatta joitakin alkion kehityksen avainkohtia. Halkioalkioiden arviointi viljelyn aikana ja ennen alkionsiirtoa on tärkeä kliininen käytäntö. Tällä hetkellä in vitro -hedelmöitettyjen alkioiden arviointi perustuu pääasiassa visuaaliseen havainnointiin mikroskoopin avulla. Viime vuosina ihmisten IVF-klinikoilla on käytetty erilaisia time-lapse-mikroskopia-inkubaattoreita alkion kasvun ja kehityksen kaikkien vaiheiden seuraamiseksi. Vaikka ihmisalkioiden valintakäytännössä on käytetty alkion istutusta edeltävää alkionmääritys- ja seulontatekniikkaa (PGD/PGS) raskausprosentin parantamiseksi, nämä tekniikat ovat invasiivisia alkioille. Toisen ei-invasiivisen menetelmän löytäminen hyvän alkion valitsemiseksi on erittäin hyödyllistä ihmisen ART-käytännössä. Sallam et al. tarkastelivat ei-invasiivisia menetelmiä alkioiden valintaan ja arvioivat näitä menetelmiä parhaan tällä hetkellä saatavilla olevan näytön valossa selvittääkseen, onko jokin niistä kypsä korvaamaan tai täydentämään perinteistä morfologista arviointimenetelmää. Tarvitsemme siis tehokkaampia välineitä alkioiden morfokineettisten merkkiaineiden arviointiin.
2.1. Alkion pilkkoutumisen morfokinetiikka time-lapse-kuvantamiseen perustuen
Kymmenien vuosien ajan tutkijat ovat yrittäneet seurata monisoluisten organismien kehitystä hedelmöittyneestä munasolusta aikuiseksi. Vaikka tutkijat olivat tutkineet tämän prosessin yksittäisiä vaiheita, ei ollut olemassa menetelmää, jonka avulla he olisivat voineet mallintaa koko kehitysprosessia elävänä. Tällä hetkellä kahdessa Nature Methods -julkaisussa raportoidut valolehtimikroskopian edistysaskeleet ovat antaneet tutkijoille mahdollisuuden visualisoida varhaista kehitystä hyvin yksityiskohtaisesti. Uusimmissa valolehtimikroskoopeissa käytetään laservalolevyjä, jotka valaisevat näytteen ohuen osan ja kuvaavat koko tason yhdellä otoksella. Näin ne voivat käyttää paljon vähemmän valoa kuin konfokaali- tai kaksifotonimikroskoopit. Se on erittäin nopea mutta myös erittäin hellävarainen suoriutuakseen erittäin hyvin useilla kriittisillä tavoilla samanaikaisesti . Drosofilan, seeprakalojen ja hiirten kaltaisten kokonaisten alkioiden kehityksen kuvaamiseen tämä uusi monikatselukuvaustekniikka on fantastinen.
Time-lapse-kuvaus on toinen ei-invasiivinen, kehittyvä tekniikka, joka mahdollistaa alkion kehityksen 24 tunnin seurannan, mikä tarjoaa mahdollisuuden lisätä morfologisen informaation määrää ja laatua ilman, että viljelmän olosuhteet häiriintyvät . Aikajaksomikroskooppi on erittäin hyödyllinen alkion kehityksen tarkkailussa. Viime vuosikymmenen aikana monet ihmisten IVF-klinikat tai -keskukset ovat alkaneet käyttää time-lapse-kuvausta seuratakseen alkion kasvua ja jakautumista in vitro -viljelyn aikana ja lopulta valitsemaan hyvälaatuisen alkion siirrettäväksi tallenteiden ja kuvien perusteella. Tämän tekniikan on raportoitu pystyvän parantamaan siirretyn alkion istutusta ja raskautta. Alkion jakautumisen aikajaksotallenteen perusteella voidaan määrittää alkion normaali jakautumisnopeus. Näin ollen tämän kirjan toisessa luvussa on hahmoteltu alkion pilkkoutumisen ajoitusta morfokineettisten markkereiden perusteella time-lapse-monitorin avulla. Tämän alkion pilkkoutumisen ajoituksen hahmotelman perusteella alkiontutkijat voivat selvästi tietää, missä vaiheessa alkion pitäisi olla eri ajankohtina. Näin voidaan valita optimaalisen laatuinen alkio tai suuren implantaatiopotentiaalin omaava alkio siirrettäväksi, jotta saavutetaan korkeampi raskausprosentti. Käyttämällä jatkuvasti ja usein tallentavaa time-lapse-järjestelmää voidaan joitakin morfokineettisiä merkkiaineita paljastaa time-lapse-järjestelmässä. Esimerkiksi alkion solujen nopea jakautuminen tiettynä ajankohtana johtaa usein alhaisempaan implantaatioprosenttiin. Normaalitilanteessa jakautuminen zygootista 2-3 soluun kestää noin 10-11 tuntia, mutta Rubio et al. havaitsivat, että joillakin alkioilla jakautuminen kestää vain noin 5 tuntia, ja näiden alkioiden implantaatioprosentti on paljon alhaisempi kuin normaalisti jakautuneiden alkioiden (1,2 % vs. 20 %). Myös alkion epätasainen jakautuminen, joka määritellään yhden blastomeerin hajoamisena kolmeksi tytärblastomeeriksi tai solusyklin keston ollessa alle 5 tuntia, johtaa usein huomattavasti alhaisempaan implantaatiopotentiaaliin. Näin ollen voimme käyttää näitä tarkempia morfokineettisiä merkkiaineita alkion laadun erottamiseen.
Kolmannessa luvussa tutkitaan ja todennetaan edelleen, onko time-lapse-kuvaustekniikka hyödyllinen ”huippulaatuisten” siirrettävien alkioiden valinnassa ART-tulosten parantamiseksi perinteisen morfologisen arvioinnin sijasta. Mielenkiintoista on, että alkion sukupuolen, alkion pirstoutumisen, hoitoprotokollien, erilaisten elatusaineiden ja alkion morfokinetiikan välisiä mahdollisia korrelaatioita on arvioitu joidenkin uusien time-lapse-kuvantamislaitteita koskevien tutkimusten perusteella. Lisäksi keskustellaan erilaisista algoritmeista ja ennustemalleista, jotka on suunniteltu ART-sykleissä, joissa käytetään time-lapse-kuvausta. Esimerkiksi monet tutkimukset eläinten ja ihmisten alkioiden kehitysnopeudesta tavallisella morfologisella havainnoinnilla osoittivat, että urosten alkiot kasvavat nopeammin kuin naaraiden alkiot. Nykyinen time-lapse-kuvantaminen voi kuitenkin antaa yksityiskohtaisempaa ja tarkempaa tietoa uros- ja naarasalkioiden eroista varhaisen jakautumisen aikana. Vaikka naarasalkioiden morfokineettiset parametrit olivat myöhäisiä (t8), morula- (tM) ja blastokystavaiheen morfokineettisiä parametreja, ne laajenivat aikaisemmin kuin urokset. Näin ollen tarkkailun keskeiset ajankohdat liittyvät alkion sukupuolen kehitykseen. Mielenkiintoista on, että kirjoittajat suunnittelivat mallin toisen synkronoinnin ja morulan muodostumisen ajankohdan mukaan neljällä alaryhmällä ennustaakseen todennäköisyyttä, että alkio on naaras.
Alkiohalkaisun morfokinetiikan jatkotutkimusta ja tutkimista varten neljännessä luvussa käsitellään joitakin menetelmiä alkion halkaisun spatiotemporaalista analyysia varten in vitro.Alkion varhaisvaiheen kuvien automatisoitu tai puoliautomaattinen time-lapse-analyysi alkion pilkkoutumisvaiheen aikana voi antaa tietoa mitoosin ajoituksesta, sekä jakautumisajankohdan että -mallin säännönmukaisuudesta sekä solulinjasta. Molekulaaristen prosessien samanaikainen seuranta mahdollistaa geneettisen ilmentymisen ja solujen fysiologian ja kehityksen välisten yhteyksien tutkimisen. Time-lapse-kuvausdatan ja analyyttisen ohjelmiston avulla voidaan helposti luoda alkioiden neliulotteinen videosekvenssi, jolloin kasvavat alkiot näyttävät uusia näkemyksiä alkion ajallisesta kehityksestä. Tässä luvussa kirjoittajat kuvaavat kolme menetelmää, joissa on vaihtelevia laitteistoja ja ohjelmistoanalyysejä, antamalla joitakin esimerkkejä tuloksista, jotka avaavat ikkunan uuteen tietoon kehityksellisessä alkionkehityksessä, kun alkion jakautumismallia ja sukulinjoja tutkitaan in vivo.
2.2. Jakautuvan alkion geeniekspressio ja alkion elinkelpoisuuden noninvasiivinen arviointi elatusaineanalyysin avulla
Esiimplantaatioalkion kehitys kokee joukon kriittisiä tapahtumia ja huomattavia epigeneettisiä muutoksia, ja geeniekspression uudelleenohjelmointi tapahtuu alkion genomin aktivoimiseksi. Preimplantaatioalkion kehityksen alkuvaiheessa äidin mRNA:t ohjaavat alkion kehitystä. Koko alkion varhaiskehityksen ajan säilyy erilainen metylaatiokuvio, joskin joillakin on vaihekohtaisia muutoksia. Viimeaikaiset tutkimukset ovat osoittaneet, että erilainen demetyloitumisprosessi johtaa vanhempien geenien erilaiseen ilmentymiseen varhaisessa kehitysvaiheessa olevissa alkioissa, mikä voi vaikuttaa oikeaan kehitykseen . Myös ei-koodaavien RNA:iden, pitkien ei-koodaavien RNA:iden (lncRNA:iden) ja lyhyiden ei-koodaavien RNA:iden, mikroRNA:iden (miRNA:iden), on osoitettu olevan tärkeässä roolissa mRNA:iden säätelyssä, ja sen vuoksi niiden rooli elinsiirtoa edeltävässä kehityksessä on korostunut. Viidennessä luvussa tarkastellaan eri tekijöitä, jotka vaikuttavat geeniekspressioon preimplantaatioalkion kehityksen aikana, mukaan lukien sukusolujen ja preimplantaatioalkioiden epigeneettiset tekijät, joissa keskitytään metylaatioprofiileihin. Ei-koodaavien RNA:iden vaikutuksia geeniekspressioon arvioitiin perusteellisesti.
Koska geeniekspressio ilmenee alkion kehityksen aikana in vitro -viljelyssä, preimplantaatioalkiot vaativat usein ravinteikkaita ravitsemusviljelyaineita. Alkion on kasvunsa ja kehityksensä aikana absorboitava joitakin tärkeitä ravitsemuksellisia komponentteja elatusaineesta ja tuotettava metabolisesti joitakin sivutuotteita geeniekspression tuloksina. Tästä näkökulmasta katsottuna alkioiden in vitro -viljely tarjoaa myös erittäin tärkeän materiaalin alkioiden ei-invasiivista arviointia varten tutkimalla biomarkkereita käytetystä alkionviljelyaineesta. Nykyiset kehitetyt menetelmät keskittyvät kehittyvistä alkioista erittyvien metabolisten yhdisteiden mittaamiseen. Näissä tutkimuksissa käytetään pääasiassa nykyaikaisen analytiikan ja proteomiikan välineitä. Eräät tutkimukset viittaavat siihen, että alkionviljelymedian metabolinen profilointi optisten ja ei-optisten spektroskopioiden avulla voi olla hyödyllinen lisä nykyisiin alkioiden arviointistrategioihin ja antaa tietoa lisääntymispotentiaaliltaan kasvavien alkioiden fenotyypistä.
Kuudennessa luvussa kirjoittajat kuvaavat uutta löytöään, ihmisen haptoglobiinimolekyylin alfa-1-ketjua alkion elinkelpoisuuden kvantitatiivisena biomarkkerina. Retrospektiivisten, sokeiden kokeiden sarjassa saavutettiin yli 50 prosentin onnistumisprosentti. Tässä luvussa esitetään yhteenveto tällä hetkellä saatavilla olevista metabolista ja proteomista lähestymistavoista alkion elinkelpoisuuden ei-invasiiviseksi molekyyliarvioinniksi. Viimeaikaiset tutkimukset osoittivat, että ravintoainemateriaalin molekyylikomponenttien arviointi on lupaava alue etsiessä merkkiaineita alkion onnistuneelle istutukselle ja sitä seuraavalle kliinisen raskauden kehittymiselle ja terveen vauvan syntymiselle, jotta voidaan tehostaa ART-tekniikoita käyttävää hoitoa. Jos viljelymedian molekulaarista koostumusta voidaan käyttää ylimääräisenä ei-invasiivisena menettelynä alkion valitsemiseksi valikoivaan siirtoon, se on erittäin hyödyllinen ihmisen IVF-raskauden tuloksen parantamiseksi.