DNA-polymeraasien DNA-synteesi difosfaattisubstraateista

Tulokset ja keskustelu

Aloitimme testaamalla Taq:ia (Thermus aquaticus -kasvintuhoojasta), korkean uskollisuuden Vent:iä (exo-, Thermococcus litoralis -kasvintuhoojasta), Pfu:ta (exo+, Pyrococcus furiosus -kasvintuhoojasta), Deep Vent:iä (exo+, Pyrococcus sp. GB-D) ja Q5 (exo+) DNA-polymeraaseja perinteisissä polymeraasiketjureaktioissa (PCR), joissa substraatteina käytetään deoksiribonukleosidimonofosfaattia (dGMP), dNDP:tä ja dNTP:tä (kuva 1 A ja B). Minkä tahansa dNTP:n korvaaminen dNDP:llä tuki vankkaa DNA-synteesiä, ja jatkokokeet kahdella, kolmella tai kaikilla neljällä dNDP:llä dNTP:n sijaan tukivat PCR:ää. Varmistaaksemme, että tuotteet eivät johtuneet kontaminoivista dNTP:istä ja että kaupallisissa puskureissa tai entsyymivarastoissa olevat stabilointiaineet eivät tehostaneet reaktioita, testasimme DNA-synteesiä puhdistetuista dNDP:istä käyttämällä kotitekoisia puskureita ja entsyymejä. Mukana oli myös bakteerien replikatiivisia entsyymejä, kuten bakteerien replikatiivisia DNA-polymeraaseja termofiilisestä Bacillus stearothermophilus -bakteerista (Bst) ja mesofiilisestä Bacillus subtilis -bakteerista (Bsu, suuri fragmentti). Nämä yhdessä Thermococcus kodakensis (KOD), Thermococcus sp. 9°N (9°N) ja Thermococcus gorganarius (Tgo) -organismeista peräisin olevien arkeaalisten polymeraasien kanssa osoittivat vankkoja alukkeen pidennyksiä käyttäen vain 100 µM puhdistettuja dNDP:tä 60 °C:ssa (paitsi Bsu, jota testattiin 37 °C:ssa kaikissa tapauksissa) (kuva 1C). Alukkeen pidennysreaktiot olivat tehokkaita kaikkien näiden entsyymien osalta, erityisesti Deep Ventin, KOD:n ja 9°N:n osalta. Taukoa havaittiin ennen dA:n ja dC:n sisällyttämistä nascent-oligonukleotidiin (Kuva 1 C ja D), mikä viittaa siihen, että dADP:n ja dCDP:n KM:t ovat riittävän korkeita hidastamaan alukkeen pidennystä 100 µM:n substraattikonsentraatiolla.

Saadaksemme mekanistisen käsityksen reaktiosta, tutkimme ensin sen tehokkuutta Taq-entsyymin avulla. Pidennyslämpötilan vaihtelu 50 °C:sta 72 °C:een ei johtanut havaittavaan eroon täyspitkän tuotteen määrässä. Kineettisten analyysien yksinkertaistamiseksi kaikki PCR-reaktiot suoritettiin käyttäen kaksivaiheista lämpötilajaksotusprotokollaa, jossa alukkeen hehkutus ja pidennys suoritettiin ensimmäisessä vaiheessa 72 °C:ssa ja dupleksi sulatettiin 95 °C:ssa toisessa vaiheessa (kuva S1A). Jotta dNDP:n hyödyntämisnopeuksia voitiin verrata kanonisiin dNTP:iin, pidennysaikaa vaihdeltiin 15:stä 120:een sekuntiin. 15 sekunnin pidennysajalla dNTP-reaktio tuotti noin nelinkertaisen määrän tuotetta verrattuna 2 minuutin pidennysajalla toteutettuun reaktioon, joka sisälsi dNDP:tä (Kuva S1B). Nämä tiedot viittasivat siihen, että difosfaattien sisällyttämisnopeus on hitaampi kuin perinteisten trifosfaattien, kuten olisi odotettavissa, kun otetaan huomioon dNDP:iden alhaisempi perustilan energia. Seuraavaksi kysyimme, ovatko yksittäiset vai kaikki neljä dNDP:tä vastuussa hitaammasta sisällyttämisnopeudesta. Tuotteen muodostumisen tarkkaa mittaamista varten käytettiin kvantitatiivista PCR:ää (qPCR). Kutakin difosfaattia kuulusteltiin itsenäisesti yhdistämällä se 0,2 mM:aan kolmea muuta dNTP:tä pitkän DNA-mallin monistamiseksi. Nämä reaktiot normalisoitiin kontrollireaktioon, joka sisälsi 0,2 mM kaikkia neljää dNTP:tä (kuva S1C). Arvo 1 tarkoittaa, että difosfaatti integroituu yhtä tehokkaasti kuin sen trifosfaattianalogi. Nämä tulokset viittaavat siihen, että dADP integroituu vähiten tehokkaasti (1 mM dADP:stä saatiin ∼60 % 0,2 mM dATP:stä), ja sen jälkeen tulevat deoksitymidiinidifosfaatti (dTDP) ja deoksisyytidiinidifosfaatti (dCDP). Toisaalta vain dGDP:n konsentraation kaksinkertaistaminen on tarpeen, jotta saavutetaan sama PCR-tehokkuus kuin dGTP:n kontrollireaktiossa.

DNA:n polymerisaation analysoimiseksi suoraan suoritimme alukkeen pidennysreaktion 32P-merkityllä alukkeella ja pitkällä (706 nt) templaatilla. Difosfaattikonsentraatiota vaihdeltiin 0,1-1,0 mM:n välillä, ja siihen yhdistettiin 0,2 mM kolmea muuta dNTP:tä, kuten edellä kuvatuissa qPCR-reaktioissa. Odotetusti dADP:n pitoisuuden lisääminen vähensi aikaa, joka tarvittiin täyspitkän tuotteen tuottamiseen (kuva 1E). Taukoa templaatti-DNA:n pituudella havaittiin ainoastaan dADP:n tapauksessa, mikä viittaa siihen, että polymeraasi pysähtyy dADP-substraattien sisällyttämisen aikana (kuva 1E). Toisaalta taukojen puuttuminen dTDP-reaktiossa viittasi siihen, että dTDP:tä hyödynnettiin tehokkaammin kuin dADP:tä (kuva S2A), kuten qPCR-analyysi viittaa (kuva S1A). Tuotteen muodostumisen analyysi osoitti, että dADP-konsentraatio, joka tarvitaan puolimaksiminopeuden saavuttamiseen, on ∼420 µM (Kuva S2B), mikä on yli kertaluokkaa suurempi kuin aiemmin mitattujen dNTP:iden KM (16 ja 24 µM) (5, 6). Lähellä dADP:n kyllästyskonsentraatiota täyspitkä DNA syntetisoituu noin 30 sekunnissa, ja kun otetaan huomioon, että 706 nt:n sekvenssi sisältää 182 adenosiinia, dADP:n keskimääräinen hyödyntämisnopeus on vähintään ∼6 s-1. Tämä on noin kertaluokkaa hitaampaa kuin Taq-polymeraasin keskimääräinen dNTP:n hyödyntämisnopeus (kcat = 47 s-1) ja on 1,5-kertainen Pfun kcat-arvoon nähden (7).

Vertaillaksemme edelleen DNA-synteesin kinetiikkaa pitkillä templaateilla dNDP:stä ja dNTP:stä käytimme 7 249 nt:n mittaista singe-juosteista DNA:ta (ssDNA:ta) sisältävää plasmidiplaasmidi-templaattia (8) M13mp18. Bsu- (37 °C:ssa), Bst- ja Taq-polymeraasit (60 °C:ssa) osoittivat voimakasta DNA-synteesiä dNDP:stä (kuva S2C). Mittasimme DNA-synteesin nopeutta käyttämällä SYTO9-interkalaattorin fluoresenssia, jota havainnoitiin reaaliaikaisella lämpösyklerillä dNDP:n ja dNTP:n pitoisuuksien vaihdellessa (kuva S2D) (9). Näiden nopeuksien kuvaaja nukleotidikonsentraation suhteen paljasti dNDP:n näennäisen KM:n olevan ∼0,4 mM ja synteesin maksiminopeuden, joka on noin 17 kertaa pienempi dNDP:lle kuin dNTP:lle (kuva S2E). Nämä tulokset osoittavat suorassa vertailussa identtisissä olosuhteissa, että DNA-synteesin nopeus dNDP:stä on hieman yli kertaluokkaa pienempi kuin dNTP:stä ja että Vmax/KM on siten noin 400 kertaa pienempi dNDP:lle kuin dNTP:lle.

Kanonisilla trifosfaattisubstraateilla tapahtuva polymerisaatioreaktio kasvattaa nascentin DNA-säikeen pituutta yhdellä nukleotidilla vapauttaen PPi:n (3). Käänteisreaktiossa, pyrofosforolyysissä, aluketta lyhennetään yhdellä nukleotidilla ja vapautuu dNTP. Vastaavasti, kun dNDP:tä käytetään substraatteina, polymeraasit vapauttavat fosfaatteja, ja käänteisreaktio on DNA:n fosforolyysi (kuva 2A). Varmistaaksemme, että polymeraasit käyttävät dNDP:tä suoraan eivätkä käytä toistaiseksi tuntematonta entsymaattista aktiivisuutta (tai kopurifioitua nukleotidifosfaattikinaasia), joka muuntaa kaksi dNDP:tä dNTP:ksi ja dNMP:ksi, käytimme puhdistettuja dNDP:itä ja analysoimme alukkeen pidennysreaktion tuotteita. Mittasimme fosfaatin tuotantoa käyttämällä fluoresoivaa anturia, joka on peräisin bakteerien fosfaattia sitovasta proteiinista ja jolla on korkea spesifisyys fosfaatille (10). Havaitsimme, että puhdistettujen dNDP:iden ja Taq-DNA-polymeraasin läsnä ollessa fosfaattia kertyy (kuva 2B), mutta kokeissa, joissa polymeraasia ei ollut mukana, sitä ei kertynyt. Kontrollikokeissa, joissa käytettiin dNTP:tä, havaittiin fosfaatin muodostumista, mutta sen nopeus oli hitaampi ja entsyymistä riippumaton, mikä viittaa siihen, että havaittu fosfaatti oli peräisin dNTP:n hajoamisesta dNDP:ksi ja fosfaatiksi eikä liittynyt DNA-synteesiin. Nämä tulokset vahvistivat, että Taq käyttää dNDP:tä suoraan substraatteina ja vapauttaa fosfaattia DNA-synteesin sivutuotteena. Kun mittasimme edellä kuvatulla 7 249 nt:n M13 ssDNA:lla tehdyissä alukkeenpidennyksissä tuotetun fosfaatin määrän, havaitsimme, että 1,6 nM:n templaatilla tuotettiin ∼1-11 µM fosfaattia yli dNDP:n hajoamisesta aiheutuvan taustafosfaattituotannon (kuva S3A). Tämä fosfaattipitoisuus vastaa ∼2-6 000 molekyyliä DNA:ta kohti eli noin 0,1-0,9 dNDP:n avulla kopioitua templaattia. Laaja vaihteluväli johtuu suhteellisen suuresta fosfaattitaustasta lähtöaineistossa ja taustareaktiosta, joka on vähennetty alukkeen pidennysreaktion signaalista.

Varmistaaksemme, että reaktiot eivät tuota dNTP:tä dNDP:stä, inkuboimme Taq-polymeraasia 250 µM:n dCDP:llä ja dTDP:llä, ja erottelimme reaktiot ioninvaihtokromatografian avulla (Kuva S3B). Tämä analyysi ei paljastanut entsyymiä sisältävässä reaktiossa uusia molekyylilajeja, jotka vastasivat mono- tai trifosforyloituja nukleotideja, verrattuna entsyymivapaaseen reaktioon, mikä osoittaa, että entsyymivalmisteessa ei ole fosforyylitransferaasiaktiivisuutta, ja tukee entisestään dNDP:iden suoraa hyväksikäyttöä dNDP:iden DNA:n synteesissä.

Kuten edellä on kuvattu, reaktiot, joissa käytetään dNDP:iden kanssa substraattien kanssa, vapauttavat epäorgaanista fosfaattia (Pii), ja käänteisreaktio on näin ollen dna:n fosforolyysin kaltainen reaktio (Kuva 2A). Tämän käänteisreaktion tehokkuuden testaamiseksi tutkittiin templaattisäikeeseen anneenoidun 5′ 32P-merkityn alukkeen fosforolyysiä inkuboimalla sitä entsyymin ja 10 mM Pi:n kanssa. Kuvassa 2C näkyy Taq-DNA-polymeraasin suorittama terminaalisen 3′-nukleotidin poisto alukesäikeestä Pi:n ja PPi:n läsnä ollessa, mikä osoittaa, että Taq-DNA-polymeraasi voi suorittaa DNA-polymerisaation käänteisreaktion sekä dNTP:stä että dNDP:stä. Termofiilisten Bst-, Deep Vent-, KOD- (kuva S4A), 9°N-, Tgo- ja mesofiilisten Bsu-polymeraasien analyysi osoitti myös DNA:n fosforolyysiä (kuva S4B), vaikkakin vähäisemmässä määrin. Kontrollireaktio Escherichia coli DNA-polymeraasi I:n Klenow-fragmentilla, joka ei hyväksy dNDP:tä substraattina, tutkittiin myös (Kuva S4C) ja osoitti, että PPi:n, mutta ei Pi:n, läsnäolo johtaa alukkeen lyhenemiseen.

Käänteisreaktion tarkemmaksi analysoimiseksi valmistimme dsDNA:ta, joka oli leimattu sisältäpäin 32P-fosfaatilla, suorittamalla alukkeen pidennysreaktion α-32P-dATP:llä, minkä jälkeen tehtiin PAGE-puhdistus. Analysoimme käänteisreaktion tuotteet käyttämällä anioninvaihto- (polyetyleenimiini) TLC:tä. Odotetusti sisäisesti leimatun DNA:n inkubointi Taq-polymeraasin ja pyrofosfaatin kanssa tuotti tuotteita, jotka yhdistyivät dATP:n kanssa. Reaktiot fosfaatin läsnä ollessa tuottivat nopeammin siirtyviä lajeja, jotka vastasivat dADP:tä, ja reaktiot ilman fosfaattia tai pyrofosfaattia eivät tuottaneet yhtään siirtyvää lajia, mikä osoittaa, että pelkän Taq-polymeraasin läsnä ollessa DNA säilyi koskemattomana (kuva 2D) ja vahvistaa, että käänteisreaktio on DNA:n fosforolyysiä.

Viimeiseksi käänteisreaktion substraattiriippuvaisen kinetiikan analyysi osoitti KM:n olevan ∼10 ± 5 mM (n = 9) ja 57 ± 5 µM (n = 5) fosfaatille ja pyrofosfaatille, vaikka magnesiumfosfaatin alhainen liukoisuus yli 10 mM:n esti tarkkojen mittausten tekemisen (kuva 2E). DNA-polymeraasien kiderakenteet, joiden aktiivisissa keskuksissa on pyrofosfaattia tai fosfonoformihappoa, osoittavat Coulombin vuorovaikutusta proteiinin kanssa (11⇓-13). Näiden kahden substraatin KM:n 200-kertainen suhde vastaa ∼15 kJ/mol (3,6 kcal/mol) 72 °C:ssa, mikä on sidosenergia, joka vastaa suunnilleen ylimääräisen fosfaatin ja proteiinissa olevan kompensoivan kationin välistä ionista vuorovaikutusta ja tukee mallia, jossa fosfaatti/pyrofosfaatti tunnistetaan pääasiassa varaus-varaus-vuorovaikutuksen kautta. Arviot käänteisreaktion maksiminopeuksista noudattivat samanlaista suuntausta: näissä olosuhteissa Vmax oli 0,0010 ± 0,0005 s-1 ja 0,205 ± 0,005 s-1 fosfaatille ja pyrofosfaatille, mikä paljastaa jälleen noin 200-kertaisen suhteen näiden kahden aktiivisuuden välillä. Kaiken kaikkiaan näiden kahden substraatin kyllästyspitoisuuksien alapuolella fosfaattireaktio on noin 4 × 104 kertaa tehottomampi, mikä viittaa siihen, että DNA:n fosforolyysi ei aiheuta merkittävää uhkaa genomin vakaudelle.

Saadaksemme lisätietoa DNA:n synteesistä matalaenergisistä substraateista (dNDP:t ja pii) mittasimme aktivoitumisenergiat käyttämällä Arrhenius-analyysia eteen- ja taaksepäin suuntautuvien reaktioiden osalta. Koska oikeiden dNTP:iden tunnistamiseen ja sisällyttämiseen liittyvien konformaatiomuutosten yhden molekyylin mittaukset paljastivat nopeamman proteiinin liikkeen kuin havaittu reaktiokinetiikka (14), Taq-polymeraasin eteenpäin suuntautuvan reaktion nopeutta rajoittava vaihe liittyy todennäköisesti kemian vaiheeseen tai katalyyttiä edeltävään aktiivisen alueen uudelleenjärjestelyyn, joka on riippuvainen vuorovaikutuksesta substraattifosfaattien kanssa. Havaitsimme, että sekä eteen- että taaksepäin suuntautuvien reaktioiden Vmax on alhaisempi dNDP:n ja fosfaatin kuin dNTP:n ja pyrofosfaatin osalta, mikä viittaa siihen, että nopeutta rajoittava vaihe on herkkä substraattien fosforylaatiotilalle. Substraatin fosforylaatio voi kuitenkin vaikuttaa sekä prekatalyyttiseen uudelleenjärjestelyyn (kuten aktiivisen alueen jäännösten kohdistamiseen ja katalyyttisen Mg2+-ionin sitoutumiseen) että kemialliseen vaiheeseen; näin ollen kumpikin vaihe voi olla nopeutta rajoittava dNDP:iden läsnäollessa edellyttäen, että ne eivät tuo mekanismiin uutta hidasta konformaatiovaihetta. Pol β:ssä näillä kahdella vaiheella on aiemmin ehdotettu olevan samankaltaiset nopeusvakiot (15), ja korkean energian substraatteja (dNTP:tä ja pyrofosfaattia) käyttävien edestakaisten ja käänteisten reaktioiden lasketut aktivaatioenergiat eroavat toisistaan vain 15 kJ/mol (4). Termofiilisten Taq- ja Klentaq1-entsyymien tapauksessa eteenpäin suuntautuvan reaktion aktivaatioenergia vaihtelee suuresti, 90-125 kJ/mol, riippuen kokeellisista olosuhteista ja todennäköisesti reagoivien nukleotidien identiteetistä (8, 16), kun taas pyrofosforolyysin aktivaatioenergiaa ei ole tietojemme mukaan määritetty kokeellisesti.

Analysoimme 50 µM:n dCDP:n, dADP:n ja dTDP:n yksittäisten nukleotidien liittymisnopeuksia, jotka pinoutuivat vastaavasti dA:n, dC:n ja dA:n päälle alukkeen pidennysreaktion aikana. Arrhenius-analyysi osoitti ln(kobs):n lineaarisen riippuvuuden 1/T:stä alle 60 °C:n lämpötilassa tehdyissä kokeissa, jolloin aktivoitumisenergiat olivat 85 ± 14, 108 ± 11 ja 112 ± 15 kJ/mol kolmelle nukleotidille (kuva 3 A ja B; n = 6 kutakin nukleotidia kohti). Arrhenius-analyysi käänteisreaktiosta 0,4 mM fosfaatin kanssa, jolloin saatiin yksi dADP-molekyyli, paljasti suuren aktivoitumisenergian 138 ± 10 kJ/mol (n = 5), joka vastaa Taq:n suorittaman DNA:n fosforolyysin havaittua hidasta nopeutta (kuvat 3 A ja B) ja merkitsee merkittävää lisäystä pyrofosforolyysin laskettuun aktivoitumisenergiaan (92 kJ/mol Pol β:ssä) (4). Näin ollen dADP:n edestakaisten ja käänteisreaktioiden aktivoitumisenergia eroaa ∼30 kJ/mol, mikä antaa vahvan etumatkan DNA-synteesille. Eteenpäin suuntautuvan reaktion etusija johtaa pienempään vaatimukseen fosfaattituotteen sitomisesta myöhemmän aineenvaihduntareitin kautta, toisin kuin dNTP-pohjaisessa DNA-synteesissä ja pyrofosfaatin hydrolyysissä epäorgaanisten pyrofosfataasien avulla. Lisäksi, jos matalaenergiset substraatit eivät vaikuta Taq-polymeraasin prekatalyyttisiin konformaatiomuutoksiin ja kemian vaihe on nopeutta rajoittava, dNDP:iden ja fosfaattien hyödyntäminen voi antaa uutta kokeellista tietoa DNA-synteesin entsymaattisesta katalyysistä.

Tutkimuksemme osoittaa, että Taq ja useat muut DNA-polymeraasien A- ja B-perheeseen kuuluvat entsyymit, mukaan lukien sekä termofiilisten että mesofiilisten bakteerien replikatiiviset entsyymit, voivat korvata kanoniset trifosfaattisubstraatit difosfaattianalogeilla. Varhaiset todisteet γ-fosfaatin käyttökelpoisuudesta nukleotidisubstraatissa saatiin HIV-1:n käänteisen transkriptaasin ja bakteriofagi RB69:n DNA-polymeraasi gp43:n tutkimuksista. HIV-1 RT:n variantit, jotka poistavat saapuvan dNTP:n γ-fosfaatin ja polymeraasin välisen sähköstaattisen vuorovaikutuksen, johtivat aktiivisuuden säilymiseen, vaikkakin paljon hitaammalla nopeudella (17⇓-19), ja bakteriofaagin RB69 DNA-polymeraasi gp43:lla oli samanlainen aktiivisuus (20). Molemmat näistä virusentsyymeistä hyväksyvät dNTP:t substraatteina, mutta KM (tai KD) on 500 ja 17 kertaa korkeampi ja nopeusvakio 100 ja 400 kertaa alhaisempi kuin HIV-1 RT:n ja RB69 gp43:n dNTP:ille (20, 21). Tutkimuksemme osoittaa, että solujen replikaatiopolymeraaseilla on tämä aktiivisuus, kuvaa substraattiaffiniteetteja ja aktivaatioenergioita sekä eteen- että taaksepäin suuntautuville reaktioille ja viittaa siihen, että DNA-synteesi dNDP:stä on kohtuullisen tehokasta erityisesti termostabiileille entsyymeille.

Tuloksemme viittaavat siihen, että DNA:n replikaatio voidaan toteuttaa käyttämällä dNDP:tä substraattina. Termofiileissä genomin replikaatio saattaa olla vähemmän herkkä solun energialataukselle kuin mesofiileissä, koska termostabiilit polymeraasit voivat hyväksyä sekä difosforyloituja että trifosforyloituja substraatteja. Solunsisäinen ATP/ADP-suhde vaikuttaa näin ollen vähemmän DNA:n replikaatioon, ja suhteellisen suuri tehokkuus, jolla DNA:ta syntetisoidaan korkeissa lämpötiloissa, viittaa siihen, että termofiilit voivat luopua kokonaan trifosforyloiduista substraateista. Lisäksi paleobiologiset todisteet viittaavat siihen, että biosfäärimme viimeinen yhteinen esi-isä oli termofiili (22⇓-24), ja tutkimuksemme viittaa siihen, että disfosforyloidut substraatit ovat saattaneet riittää varhaisten organismien genomin replikaatioon, mikä on lieventänyt tarvetta suurienergisten trifosforyloidun aineenvaihdunnan välituotteiden aineenvaihduntaan. Tällöin difosfaatteja voitaisiin pitää välikappaleina korkeaenergisten metaboliittien evoluutiossa, ja ne voivat sisältää varhaisen genomin esi-isien rakennuspalikoita, kuten ribonukleotideja tai yksinkertaisempia nukleiinihappoja.

DNA-polymeraasilla on merkittävä rooli lukuisissa bioteknologioissa. Tässä raportoidulla difosfaattisubstraattien käytöllä on potentiaalia tehdä käytännölliseksi kalliiden analogien, kuten isotooppisesti leimattujen tai kemiallisesti modifioitujen nukleotidien, sisällyttäminen, jolloin ei tarvita haastavia trifosfaattisynteesejä. Tämä DNA-polymeraasien ominaisuus voi myös tarjota menetelmän, jolla voidaan havaita korkean läpimenon DNA-sekvensoinnissa käytettävät nukleotidit. Kaksi yleistä menetelmää havaitsee alukkeen pidentämiseen liittyvän PPi-poistumisryhmän joko sekundaarisen kemiluminesenssimäärityksen avulla tai seuraamalla paikallisen pH:n muutosta (25, 26). Käyttämällä dNDP-substraattia saadaan Pi:tä, mikä tarjoaa lisämahdollisuuden erottaa yhdistetyt nukleotidit toisistaan. Tämä DNA-polymeraasin kykyjen lisääntynyt arvostus viittaa myös siihen, että muiden trifosfaatista riippuvaisten entsyymien tutkiminen voi paljastaa, että ne sietävät alhaisemman energiapitoisuuden omaavia, helpommin saatavilla olevia difosfaattisubstraatteja evoluution välituotteina.