The cnidosac in Cladobranchia
Comparative anatomy of the cnidosac
Esimäistä tutkimusta ennen on tehty lukuisia oletuksia cnidosacin morfologian yhdenmukaisuudesta kleptoknidejä sisältävien kladobranchien keskuudessa . Erityisesti Edmunds tarjoaa piirroksia, jotka ovat huomattavan yhdenmukaisia Fionidae-, Favorinidae-, Facelinidae- ja Aeolidiidae-heimojen lajeissa, vaikka cnidosac-kuvaukset eivät olleetkaan kyseisen julkaisun ensisijainen tarkoitus. Kaikilla kyseisessä teoksessa kuvatuilla lajeilla on selkeä sisäänkäynti, joka yhdistää ruoansulatuskanavan ja cnidosacin (vaikkakin joissakin tapauksissa sisäänkäyntiä on kuvattu hieman pidennettynä, kanavan tapaan), ja selvä ulostulo ceraksen kärjessä, joka yhdistää cnidosacin ulkoilmaan. Lisäksi kaikilla cnidosacilla kuvataan olevan kleptocnidit, ja myös lihaksiston esitystapa on hyvin yhdenmukainen. Tähän mennessä yksityiskohtaisimman tutkimuksen aeolidien cnidosacsista ovat kirjoittaneet Kälker ja Schmekel , mutta siinä ei kuvattu riittävästi sitä vaihtelua, jota tässä rakenteessa on noin 600 aeolidilajin keskuudessa. Lisäksi Hancockia spp:n cnidosacin kaltaisia rakenteita alettiin tutkia vasta hiljattain .
Tässä tutkimuksessa havaitsimme, että cnidosacin sisäänkäynnin pituus, koko ja rakenne vaihtelevat enemmän kuin aiempien töiden perusteella odotettiin, samoin kuin ulostulon eli cnidoporeen rakenne, cnidosacia ympäröivä lihaksisto sekä kleptoknidien sijainti ja suuntautuminen . On tärkeää huomata, että vaikka tarjoamme laajan taksoninäytteen cnidosacin morfologisista piirteistä, monista lajeista oli saatavilla vain yksi yksilö analysoitavaksi. Näin ollen havaintoihin puuttumisesta tietyissä tapauksissa on suhtauduttava varauksella. Käsittelemme näitä taksoneita erityisesti jäljempänä.
Edellisissä töissä on esitetty vain lyhyt ja yksinkertainen sisäänkäynti cnidosaciin (eli suora aukko) , mikä johtuu todennäköisesti sellaisten taksonien valikoitumisesta, joilla on tämä ehto pelkästään sattumalta. Työmme viittaa siihen, että tämä on yleisin siirtymä ruoansulatuskanavan ja cnidosacin välillä. Hancock ja Embleton mainitsevat kuitenkin, että Aeolidia (= Eolis) papillosalla on sädekehämäinen kanava, ja Herdman ja Clubb toteavat, että nykyisellä Facelina bostoniensis -lajilla (= Facelina drummondi) on ”pitkä, kaareva yhdyskanava”. Muutamilla taksoneilla, kuten Aeolidia papillosa, Cerberilla amboinensis, Cratena peregrina, Pteraeolidia ianthina ja Paraflabellina ischitana, on sädekehämäinen kanava. Nämä taksonit eivät ole läheistä sukua, joten kanava ei ole homologinen niiden taksonien keskuudessa, joilla se on, mikä viittaa toiminnalliseen selitykseen sen esiintymiselle. Epäilimme aluksi, että tämän pitkänomaisen kanavan esiintyminen liittyy kleptoknidien kokoon, sillä A. papillosa, C. amboinensis ja P. ianthina eristävät kaikki suurempia kleptoknidejä (> 20 μm pituudeltaan). C. peregrina ja P. ischitana eivät kuitenkaan tue tätä, sillä nämä lajit sitovat pienempiä kleptokidejä. Näissä tapauksissa sädekanava voi olla jäänne esi-isien siirtymisestä ruokavaliossa, mutta sädekanavan mahdollinen toiminnallinen merkitys jää spekulatiiviseksi.
Samoin ei ole mitään johdonmukaista kaavaa niiden taksonien välillä, joilla on proliferaatiovyöhyke verrattuna niihin, joilla ei ole. Ainoa poikkeus on proliferaatiovyöhykkeen puuttuminen Phyllodesmium-suvun taksoneilla, jotka eivät sekventoi nematokystia. Ainoa Phyllodesmiumin laji, jossa havaitsimme proliferaatiovyöhykkeen, on P. jakobsenae, joka on ainoa Phyllodesmiumin laji, jonka tiedetään sisältävän kleptoknidejä. On edelleen epäselvää, miksi joillakin taksoneilla näyttää olevan proliferaatiovyöhyke, kun taas toisilla ei, mutta epäilemme, että pienessä määrässä tapauksia joidenkin näytteiden leikkaamisessa syntyneet artefaktit ovat johtaneet tämän alueen tuhoutumiseen (todennäköisesti säilymisvaikeuksien vuoksi), mikä johtaa kalvopalasiin ja vapaana leijuviin kleptoknideihin joidenkin lajien cnidoksaakissa (esim. Cratena peregrina; kuva 4d). Tämän seikan selvittämiseksi olisi tutkittava lisää näiden lajien yksilöitä. Proliferaatiovyöhykkeen näennäinen puuttuminen voi johtua myös eroista tutkittujen yksilöiden kasvuvaiheessa tai ceratojen kasvuvaiheessa, jos jotkin ceratat olivat regeneraatioprosessissa, mutta emme löytäneet todisteita, jotka tukisivat kumpaakaan näistä hypoteeseista. Lisäksi ainakin yhdessä aiemmassa tutkimuksessa mainittiin tämän alueen olemassaolo, mutta sitä ei käsitelty yksityiskohtaisesti. Cnidofagit ottavat tällä alueella vastaan nematocystoja ennen kuin ne siirtyvät kohti cnidosacin distaalista päätä. Proliferaatiovyöhykkeen tarkka laajuus on kuitenkin edelleen epäselvä. Joillakin lajeilla se näyttää rajoittuvan cnidosaciin (esim. Pteraeolidia ianthina; kuva 4a), mutta toisilla lajeilla tämä vyöhyke näyttää ulottuvan ruoansulatuskanavan viereisiin osiin (esim. Dondice occidentalis; kuva 4b). Suurimmalla osalla taksoneista, jotka eristävät nematokystia, löysimme vain hyvin yksinkertaisia ulostuloja cnidosacista, jota joissakin tapauksissa peittää ohut epiteeli. Tämä peite sisältää samankaltaisia soluja kuin ceratan epidermis, joka koostuu pitkulaisista pylväsmäisistä soluista, joissa on ilmeisesti monia erikoistuneita vakuoleja. Yksinkertaiset ulostulot ovat yleisimpiä sekä tutkimuksessamme että ilmeisesti muissakin . Muutamissa Aeolidiidae-heimon valituissa taksoneissa, kuten Aeolidia papillosa, Anteaeolidiella chromosoma ja Cerberilla amboinensis, on kuitenkin monimutkainen cnidopore (kuva 4c). Siinä on epiteelivuori, joka näyttää jatkuvan epidermiksen kanssa. Tämä rakenne on tunnistettu aiemminkin, mutta sitä pidettiin yksinkertaisesti erilaistumattomien solujen vyöhykkeenä, jonka uskottiin toimivan varastona kadonneille nidofageille. Epäilemme kuitenkin, että näin ei ole, koska se sijaitsee cnidosacin distaalisessa päässä ja on osa cnidoporea. Sen sijaan oletamme, että tämä solukerros on erityinen sopeutuminen anemoneista eristettyjen poikkeuksellisen pitkien ja kapeiden nematokystien vapauttamiseen (pituus jopa 50-60 μm, mutta leveys < 5 μm). Termiä cnidopore on aiemmin käytetty kritiikittömästi viittaamaan kaikkiin cnidosacista lähteviin ulostuloihin , mutta määrittelemme nyt termin cnidopore uudelleen tässä viittaamaan tähän mennessä vain Aeolidiidae-heimossa esiintyvään rakenteeseen.
Vaikka myös cnidosacia ympäröivä lihaksisto vaihtelee Aeolidida-heimossa, tämän vaihtelun merkitys on epäselvä. Cnidosacin ympärillä oleva lihaksisto on hyvin ohut tai puuttuu kokonaan vain muutamasta lajista, kuten Embletonia gracilis, Embletonia pulchra ja Bulbaeolidia alba. Lihaksen paksuus vaihtelee lajeittain, ja se vaihtelee yhdestä kerroksesta useisiin kerroksiin. Tämä lihaksiston paksuuden vaihtelu käy ilmi yhdestä aiemmasta tutkimuksesta , joskaan ei niin tarkasti kuin tässä osoitamme (taulukko 3). Lihaksen paksuuden tai lihaskerrosten lukumäärän vaihtelulle eri taksonien välillä ei ole ilmeistä evolutiivista selitystä, mutta paksumpi lihaskerros johtaisi todennäköisesti kleptoknidien voimakkaampaan ulostuloon. Suurempi lihaksisto saattaa liittyä saalistuspaineeseen, sisäänrakennettujen kleptocnidien kokoon tai kehitysvaiheeseen. Lisäyksilöiden sisällyttäminen kustakin lajista ja eri kehitysvaiheissa sekä kleptoknidien koon ja lihaksen paksuuden mittaaminen olisi hyödyllistä näiden hypoteesien arvioimiseksi.
Knidofagien erilaistuminen toiminnallisesta, aktiivisesta solusta kleptoknidien ”säiliöksi tai ruokakammioksi” kleptoknidien kärjessä heijastelee kleptoknidien kypsymistä protonin kuljettamisen kautta, jotka ovat epäkypsiä ja epäkypsiä, kun ne ovat ensimmäisen kerran sekventoituneina . Kypsymisen jälkeen soluilla ei näytä olevan enää toimintaa solujen monimutkaisuuden vähenemisen vuoksi. Aiemmat työntekijät ovat yrittäneet selvittää knidofagin kalvon alkuperää , ja viime aikoina he ovat päätyneet siihen tulokseen, että se on fagosomi, solukalvon muodostama erikoistunut vesikkeli . Nidofagien sisällä kleptoknidien määrä voi vaihdella sekä taksonien sisällä että niiden välillä. Tämä näyttää liittyvän kleptoknidien kokoon; tietyn nidofagin sisällä on yleensä vähemmän suuria kleptoknidejä (> 20 μm pituudeltaan) verrattuna niihin, joissa on pienempiä kleptoknidejä (yleensä 10 μm tai vähemmän). Esimerkkinä tästä on Pteraeolidia ianthina (kuva 4a), joka eristää useita eri kokoluokkiin kuuluvia nematocystoja.
Eroavaisuudet yleisestä teemasta
Tässä tutkimuksessa arvioidut morfologiset merkit näyttävät vaihtelevan melko paljon suvun sisällä, mutta suurin osa cnidokokkeista vaihtelee yleisesti ottaen teemassa, joka on säilynyt Aeolidida-heimossa. On kuitenkin vielä toisia, jotka ovat menettäneet tiettyjä cnidosac-rakenteita tai ovat menettäneet cnidosacin kokonaan. Voidaan olettaa, että cnidosacsit menettävät yhteyden ruoansulatuskanavaan tai cnidosacia ympäröivään lihaksistoon, kun ei ole sekventoituneita nematocystoja. Esimerkiksi Phyllodesmium-suvun lajeilla (lukuun ottamatta P. jakobsenae-suvun lajia) on lihaksiin sidottuja cnidosaakkeja, joissa ei näytä olevan kleptoknidejä, mutta niissä ei ole ilmeisiä sisäänkäyntejä ruoansulatuskanavan divertikkeliin tai uloskäyntejä ulkoiseen ympäristöön. Nämä lajit pikemminkin sitovat kemikaaleja puolustautumista varten, eivätkä ne näin ollen välttämättä tarvitse rakenteellista sisäänkäyntiä. Tällä tavoin Phyllodesmiumin cnidosacsit voivat olla samanlaisia kuin Charcotiidae-heimon vaippahermomuodostumat, joista ei ole uloskäyntiä mutta jotka vapauttavat sisältöä puristettaessa . Favorinus-suvun lajeilla cnidosacin yleinen rakenne (mukaan lukien ruoansulatuskanavan aukko ja lihakset cnidosacin ympärillä) pysyy kuitenkin samana, mutta kleptocnideja ei ole, koska nämä lajit syövät mielellään muiden gastropodien munia . Vaikka on mahdollista, että kleptoknidien puuttuminen johtuu Phyllodesmiumin ja Favorinuksen hypoteettisesta taipumuksesta vapauttaa nematokystia kiinnittymisprosessin aikana, pidämme tätä epätodennäköisenä. Ensinnäkin Phyllodesmiumin jäsenillä näyttää olevan ehjä epiteeli, jossa kleptoknidien voisi olettaa purkautuvan. Jos kleptoknidit heittäytyisivät ulos fiksaation aikana, kerat kiinnittyisivät siten, että kärjessä olisi aukko. Lisäksi kleptoknidien puuttuminen erityisesti Phyllodesmiumista on myös hyvin dokumentoitu (lukuun ottamatta P. jakobsenae -lajia). Favorinus-suvussa on mahdollista, että näin on, kun otetaan huomioon avoin epiteeli ceratan kärjessä (esim. kuva 2c), mutta kleptoknidien puuttuminen on sopusoinnussa tämän suvun jäsenten tavan kanssa syödä gastropodien munia.
Vielä useampia variaatioita tästä aiheesta löytyy Bulbaeolidia alba -suvusta, Embletonia spp:stä ja Fiona-suvun lajeista. Bulbaeolidia alba:lla on ruoansulatusrauhasen distaalisessa päässä pussi, joka sisältää vain satunnaisesti zooxanthellae (Symbiodinium). Lisäksi emme löytäneet pussin sisään- tai ulostuloa, ja rakennetta näyttää ympäröivän muutama ohut lihassäie. Oletimme, että kleptoknidien puuttuminen saattaa johtua B. alban hyvin pienestä koosta, minkä vuoksi sen puolustusvaatimus saattaa olla pienempi, mutta jopa Embletonia- ja Pseudovermis-sukujen pienemmillä taksoneilla on kleptoknidejä. Vaihtoehtoisesti oletamme, että sekvestraation puute voi liittyä niiden anemonien, joilla tämä laji ruokailee, sisältämien nematokystien kokoon tai käyttökelpoisuuteen. Kolmas vaihtoehto on, että B. alba sen sijaan varastoi pussiin muita luonnollisia yhdisteitä, jotka ovat peräisin sen saaliista, kuten Phyllodesmiumissa, tai jotka on tuotettu de novo. On myös mahdollista, että kleptoknidien puuttuminen B. alba -lajista johtuu pienestä näytemäärästä, mutta Phyllodesmiumin tapaan ei löytynyt todisteita ekstruusiosta. Embletoniidae-heimon jäsenet näyttävät menettäneen evolutiivisesti kokonaan nivustaipeen ympäröivän lihaksiston tai edustavan välivaihetta nivustaipeen evoluutiossa, kuten jäljempänä nivustaipeen evoluutiota käsittelevässä jaksossa käsitellään. Näillä taksoneilla ei myöskään ole selvää sisään- tai ulostuloa cnidosacin sisään- tai ulostuloon. Jotkut Fionidae-suvun Fiona-suvun lajit (tässä tutkimuksessa) ovat menettäneet cnidokystat kokonaan, ilmeisesti siksi, että tämän suvun lajit suosivat muita kuin nilviäisiä.
Sekoitettuja nematokystoja on löydetty myös yhdestä muusta Cladobranchia-suvun heimosta, Hancockiidae-suvusta. Näemme Hancockia californica -heimossa rakenteita, jotka ovat hyvin samankaltaisia kuin nidokystat (joita kutsumme nidokystan kaltaisiksi), ja kleptokystat on sijoitettu nidokystan kaltaisiin soluihin useisiin lihaksikkaisiin säkkeihin kunkin ceran kärjessä. Tällaisia rakenteita on löydetty myös Hancockia uncinatasta ja H. schoeferti -lajista, ja joissakin tapauksissa cnidosacin kaltaisia rakenteita on löydetty sekä ceratasta että rhinophoraalitupesta. Hancockiidae- ja Aeolidida-heimossa havaittuja rakenteita koskevia homologisia johtopäätöksiä käsitellään seuraavassa jaksossa.
Cladobranchia-heimon fylogenia ja cnidosacin evoluutio
Fylogeneettiset johtopäätökset
Kun otetaan huomioon, että suuri osa tähän sisältyvistä molekyylitiedoista on peräisin aiemmin julkaistuista tutkimuksista, fylogeneettisessä analyysissämme (kuva 5) päättelemämme topologia on johdonmukainen molemmissa viimeaikaisissa fylogenomiikan alan tutkimuksissa havaitun topologian kanssa . Tässä työssä laajennetaan kuitenkin aiempia tuloksia sisällyttämällä mukaan taksoneita, joita ei ole analysoitu viimeaikaisissa fylogenomitutkimuksissa, nimittäin Phyllodesmium-, Caloria-, Pruvotfolia-, Pteraeolidia-, Cratena-, Facelina-, Glaucus-, Calmella-, Piseinotecus-, Tergipes-, Notaeolidia-, Embletonia- ja Charcotia-sukujen taksoneita. Suurin osa näistä kuuluu kladeihin, joita voisimme odottaa aikaisemman molekyylitutkimuksen perusteella: Phyllodesmium on läheisessä sukulaisuussuhteessa Dondicen kanssa Aeolidiidae-heimon sisarlaji, Caloria kuuluu toiseen facelinidien klaadiin ja on läheisessä sukulaisuussuhteessa Pruvotfolian lajeihin, Facelina, Glaucus ja Cratena ovat läheisessä sukulaisuussuhteessa toiseen facelinidien klaadiin, Calmella on läheisessä sukulaisuussuhteessa Flabellina- ja Paraflabellina- lajeihin ja Tergipes kuuluu nykyiseen Fionidae-heimoon. Pteraeolidian sijoittuminen läheiseen sukulaisuuteen Palisan ja Austraeoliksen kanssa toisessa facelinidien klaadissa on kuitenkin uutta tässä tutkimuksessa, ja tässä esitetyt molekulaariset tiedot tukevat Charcotian asemaa Aeolididien sisarryhmässä, kuten morfologinen työ on aiemmin ehdottanut .
Kaikkien tässä esitettyjen uusien tietojen lisäämisestä huolimatta Notaeolidian ja Embletonian asema on edelleen epäselvä . Tuki näiden kahden suvun tarkalle sijainnille on heikko, ja nämä taksonit näyttävät osaltaan vaikuttavan alhaisiin bootstrap-arvoihin Aeolidida-suvun pohjalla. Tämä saattaa johtua Notaeolidian ja Flabellinopsis iodinean sekä Embletonian ja Unidentian välisestä pitkien haarojen vetovoimasta. Morfologiset analyysit tukevat kuitenkin myös sitä, että Notaeolidia on ainakin aiemmin eronnut Aeolididan sisällä. Näiden neljän taksonin sukulaisuuteen liittyvä epävarmuus vaikuttaa käsitykseemme cnidosacin evoluutiosta.
Havaitsimme myös, että yksittäisten geenipuiden analyysit (ja kolmen geenin analyysi) ovat yhdenmukaisia aiempien laajamittaisten PCR-pohjaisten sekvenssianalyysien kanssa . Nämä topologiat ja posterioriset todennäköisyydet tukevat ajatusta, että PCR-pohjaiset sekvensointitiedot käytetyistä geeneistä (COI, 16S ja 18S) tarjoavat jonkin verran hyötyä viimeaikaisten eroavaisuuksien päättelyyn, mutta että syvempien eroavaisuuksien päättelyyn tarvitaan korkean läpimenon sekvensointitietoja.
Nilviäisten evoluutio
Nilviäisten nematokystien sekvenssi on syntynyt Cladobranchian sisällä ainakin kahdesti tässä esitetyn fylogenian perusteella (kuva 6). Tämä tulos osoittaa myös, että Aeolididan sisällä lajit, jotka eivät sido nematokystia, ovat menettäneet tämän kyvyn, mikä näyttää tapahtuneen ainakin kolme kertaa. Lisäksi Embletoniidae-heimon varhainen divergenssi aeolidien fylogenian sisällä on viitteellinen; se viittaa siihen, että Embletoniidae-heimon sisällä oleva rakenne on cnidosac ja että lihaksiston puuttuminen cnidosacin ympäriltä voi edustaa välivaihetta kleptocnidien sitomisen evoluutiossa. Tarvitaan kuitenkin vahvempaa tukea sukulaisuussuhteille Aeolidida-heimon pohjalla, ennen kuin voidaan tehdä tarkempia johtopäätöksiä. Tuloksemme tukevat myös useita itsenäisiä cnidosacin häviämisiä, myös Fionan ja Tergipesin jäsenillä. Tämä näyttää johtuvan siitä, että Fiona on siirtynyt saalistamaan lähinnä äyriäisiä. Siirtyminen hydroideista muunlaisiin organismeihin on saattanut johtaa myös cnidosacien häviämiseen joistakin Tergipes-heimon lajeista.
Ruuansulatusrauhasen distaalisessa päässä olevan pussin oletetaan syntyneen ennen kykyä sitoa nematokystia (kuva 6; harmaa laatikko), vaikka tämä tulos perustuu oletukseen, että Charcotiidae- ja Proctonotidae-heimoissa esiintyvät päätepussit ovat homologisia Aeolidida-heimojen päätepussin kanssa. Tukea tälle hypoteesille on hyvin vähän, joten se vaikuttaa epätodennäköiseltä rekonstruktiomme perusteella. Charcotiidae- ja Proctonotidae-heimojen terminaalipussin katsotaan kuitenkin toimivan erittävinä rakenteina, ja jotkut ovat esittäneet, että aeolidien cnidosac on tämän pussin sopeutuminen puolustukseen. Vaikka homologia on edelleen epävarmaa, esi-isätilan rekonstruktiomme ei täysin hylkää tätä modifikaatiohypoteesia, jonka mukaan distaalinen pussi on sopeutunut eristämään nematokystia. Tämän hypoteesin tarkempi testaaminen edellyttää lisää morfologisia ja molekulaarisia tietoja Charcotiidae + Proctonotidae + Dironidae -kladin uusista lajeista, sillä tämä kladi ei ole analyysissämme hyvin edustettuna, mikä voi haitata evolutiivisia johtopäätöksiä.
Hancockiidae-heimon cnidosacin kaltaiset rakenteet näyttävät kehittyneen riippumattomasti distaalisesta pussista sekä Aeolidida-heimossa että sen sisarkladissa. Tätä tukevat tässä esitetyt fylogeneettiset analyysit sekä Hancockia- ja Aeolidia-lajien väliset erot sidekudosprosessissa. Näyttää esimerkiksi siltä, että Hancockia-lajit kapseloivat nematokystat ruoansulatuskanavan luumeniin ennen kuljetusta , toisin kuin aeolidit.