Hohe Prävalenz des Humanen Papillomavirus bei kolorektalem Krebs bei Hispanics: Eine Fall-Kontroll-Studie

Abstract

Die Rolle des Humanen Papillomavirus (HPV) bei der kolorektalen Karzinogenese ist nach wie vor unklar. Aufgrund der hohen Inzidenz von HPV-assoziierten Malignomen unter puertoricanischen Hispanics zielte diese Studie darauf ab, die Prävalenz von HPV-Infektionen und die virale Integration in kolorektales Gewebe zu untersuchen, um die mutmaßliche Rolle von HPV bei der Entstehung von kolorektalem Karzinom (CRC) zu bewerten. In dieser Fall-Kontroll-Studie wurde die Prävalenz von HPV-Infektionen in kolorektalem Karzinom (Fälle n = 45) und normaler Darmschleimhaut von krebsfreien Probanden (Kontrollen n = 36) mittels einer verschachtelten PCR-Strategie untersucht. In HPV-positiven Geweben wurde eine HPV-16-Genotypisierung durchgeführt, und der physikalische Status des HPV-16-Genoms wurde durch E2-Nachweis bestimmt. HPV wurde bei 19 von 45 (42,2 %) Darmkrebsfällen (Durchschnittsalter 61,1 ± 10,7 Jahre, 24 Männer) und bei 1 von 36 (2,8 %) Kontrollen (Durchschnittsalter 60,9 ± 9,6 Jahre, 24 Männer) mit einer OR = 25,58 (95 % CI 3,21 bis 203,49) nachgewiesen. HPV-16 wurde in 63,2 % der HPV-positiven kolorektalen Tumoren nachgewiesen; eine Genomintegration wurde in allen HPV-16-positiven Fällen beobachtet. Dies ist der erste Bericht, der die hohe Prävalenz von HPV-Infektionen bei kolorektalen Tumoren in der hispanischen Karibik zeigt. Trotz des Nachweises der HPV-Integration in das Wirtsgenom ist eine weitere mechanistische Analyse zur Untersuchung der HPV-Onkoprotein-Expression und der mutmaßlichen Rolle dieser Onkoproteine bei der kolorektalen Karzinogenese gerechtfertigt.

1. Einleitung

Humane Papillomavirus (HPV)-Infektionen sind die häufigsten sexuell übertragbaren Infektionen in den Vereinigten Staaten (USA) (http://www.cdc.gov/std/hpv/STDFact-HPV.htm). HPV sind epitheliotrope, doppelsträngige DNA-Viren, die die Plattenepithelien der Schleimhautzellen der Haut infizieren. Die Virusvermehrung findet in den Zellkernen statt und ist eng an den Differenzierungszustand der Zelle gebunden. Es gibt weit über 100 Genotypen von HPV. Die Typen 6, 11, 40 und 42 werden häufig mit gutartigen Läsionen in Verbindung gebracht und als Typen mit geringem Risiko eingestuft. HPV-16, HPV-18, HPV-31 und HPV-45 haben ein hohes onkogenes Potenzial und werden als Hochrisikotypen bezeichnet. HPV wurde als ursächlicher Erreger von Gebärmutterhals-, Vaginal-, Anal-, Mund- und Peniskrebs identifiziert. Studien haben auch starke Korrelationen zwischen HPV und der Entwicklung vieler Krebsarten wie Speiseröhre, Rachen und Kehlkopf gezeigt. Die mutmaßliche Rolle der HPV-Infektion bei der kolorektalen Karzinogenese ist jedoch noch nicht hinreichend geklärt und bleibt umstritten.

Die Pathogenese des kolorektalen Karzinoms ist auf molekularer Ebene besser verstanden worden; die Ätiologie des kolorektalen Karzinoms ist jedoch immer noch unvollständig geklärt. In den letzten zehn Jahren haben mehrere Studien darauf hingedeutet, dass HPV bei der kolorektalen Karzinogenese eine Rolle spielen könnte. Der Nachweis von HPV in Dickdarmgewebe hat zu einer Vielzahl von Arbeiten geführt, in denen ein kausaler Zusammenhang zwischen HPV und Darmkrebs vermutet wird. Das Vorhandensein von HPV in Dickdarmgewebe wird nach wie vor sehr kontrovers diskutiert, da die Ergebnisse nicht immer reproduzierbar sind. Da die Integration des HPV-Genoms notwendig ist, damit das Virus sein karzinogenes Potenzial entfalten kann, ist die Bewertung des physikalischen Zustands des viralen Genoms nach der Bestätigung einer HPV-Infektion für die Feststellung eines kausalen Zusammenhangs unerlässlich. Die Inaktivierung des E2-Gens durch genomische Integration fördert die Expression der Onkoproteine E6 und E7, die die Funktion von p53 bzw. pRB antagonisieren. Der daraus resultierende Abbau von p53 und pRB, der durch diese Onkoproteine vermittelt wird, erleichtert die virale DNA-Vermehrung im Wirt und führt durch in der Literatur gut beschriebene Mechanismen zu Neoplasien.

CRC ist weltweit für etwa 694.000 Todesfälle verantwortlich. In den USA ist CRC die am dritthäufigsten diagnostizierte Krebsart und die dritthäufigste Krebstodesursache. In Puerto Rico (PR) ist CRC die am zweithäufigsten diagnostizierte Krebsart und die häufigste Krebstodesursache bei Männern und Frauen. Eine hohe Prävalenz von HPV-bedingten Krebserkrankungen und eine hohe Prävalenz von HPV in Anogenitalproben wurde bei puertoricanischen Männern und Frauen festgestellt. Die Seroprävalenz von HPV-16 wurde in einer bevölkerungsbasierten Stichprobe von Erwachsenen in der PR mit 11,3 % angegeben, was mit der in den USA gemeldeten Prävalenz (11,5 %) vergleichbar ist. In Anbetracht der hohen Sterblichkeitsrate bei Darmkrebs und der hohen Inzidenz HPV-bedingter Erkrankungen in der PR bestand das übergeordnete Ziel dieser Fall-Kontroll-Studie darin, den Zusammenhang zwischen Darmkrebs und HPV-Infektion in Stichproben puerto-ricanischer Hispanoamerikaner zu untersuchen.

2. Methoden

2.1. Ethikerklärung

Diese Studie wurde vom IRB der University of Puerto Rico Medical Sciences Campus genehmigt (#A7330109). Alle Verfahren standen im Einklang mit den ethischen Standards des IRB.

2.2. Probandenrekrutierung und Stichprobengewinnung

Fälle und Kontrollen wurden nacheinander mit Hilfe von Zufallsstichproben rekrutiert, wobei die Häufigkeit nach Geschlecht und Alter abgestimmt wurde. Die Studienteilnehmer im Alter von 21 Jahren oder älter wurden rekrutiert, wenn sie aufgrund von Routineuntersuchungen, Symptomen und/oder Überweisungen durch Gastroenterologen und kolorektale Chirurgen die Einrichtungen des Puerto Rico Medical Center für Koloskopien aufsuchten. Der Zweck dieser Studie wurde erläutert, und alle Studienteilnehmer gaben vor der Aufnahme in die Studie ihre informierte Zustimmung. Alle Teilnehmer, die in diese Analyse einbezogen wurden, waren Hispanoamerikaner. Die Zugehörigkeit zu einer hispanischen Bevölkerungsgruppe wurde durch die von den Teilnehmern selbst angegebene Herkunft oder ihren Geburtsort definiert. Alle Kontrollpersonen, die in diese Studie aufgenommen wurden, hatten normale Ergebnisse ihrer Koloskopie. Bei Personen mit CRC wurde die Diagnose Adenokarzinom durch die Histopathologie bestätigt. Personen mit erblichen Krebssyndromen und entzündlichen Darmerkrankungen wurden ausgeschlossen.

Frisches gefrorenes Gewebe wurde von 45 nicht familiären, sporadischen CRC-Patienten (Fälle) und 36 krebsfreien Personen (Kontrollen) gewonnen. Die Gewebe wurden den CRC-Patienten während der Tumorresektion entnommen. Anal- oder Perianaltumore und Gewebeproben von Personen, die nach eigenen Angaben HIV-positiv waren, wurden ausgeschlossen. Die Tumorlokalisation wurde als proximal (vom Zökum bis zum distalen Querkolon), distal (von der Milzflexur bis zum Sigma) oder rektal (die letzten 20 cm des Kolons) klassifiziert. Kontrollbiopsien des kolorektalen Gewebes wurden bei Routinekoloskopien aus dem distalen Dickdarm entnommen.

Mit Hilfe des Fragebogens zur Erfassung von Risikofaktoren für Darmkrebs (http://coloncfr.org/) des Collaborative Family Registries wurden von jedem Patienten klinische und soziodemografische Daten erhoben, darunter Geschlecht, Lebensstil, medizinische Vorgeschichte und familiäre Krebsvorbelastung. Zu den soziodemografischen und klinischen Merkmalen, die in der Studie analysiert wurden, gehörten das Geschlecht (männlich versus weiblich), das Durchschnittsalter (<61 Jahre versus ≥61 Jahre), die Diagnose von DM Typ 2 (ja versus nein), die familiäre Vorbelastung mit Krebs (ja versus nein) und die familiäre Vorbelastung mit Darmkrebs (ja versus nein). Als familiäre Vorbelastung gilt, wenn ein Verwandter ersten, zweiten oder dritten Grades an Krebs erkrankt ist. Die Lebensstilmerkmale, die in dieser Studie analysiert wurden, waren Alkoholkonsum (jemals versus nie) und Raucherstatus (jemals versus nie).

2.3. DNA-Extraktion

Genomische DNA (gDNA) wurde aus ≈100 mg Gewebe unter Verwendung des DNA-Isolierungskits für Zellen und Gewebe (Roche Applied Science, Indianapolis, IN) gemäß den Anweisungen des Herstellers extrahiert. Zur Qualitätskontrolle wurde die PCR-Amplifikation des -Actin-Gens verwendet, um die gDNA-Integrität zu bewerten; Proben, aus denen kein -Actin amplifiziert werden konnte, wurden von der Studie ausgeschlossen.

Um die Kreuzkontamination von Probe zu Probe zu minimieren, wurden die folgenden standardisierten Vorsichtsmaßnahmen getroffen: Alle Instrumente und Arbeitstische wurden vor der Probenmanipulation mit DNAZap (Ambion, Foster City, CA) abgewischt, gefolgt von 10 % Bleichmittel und 70 % ETOH. Für jede Probe wurden neue, sterile Klingen verwendet. Die Verarbeitung des Gewebes und die Nukleotidextraktion waren auf maximal 10 Proben pro Tag beschränkt. Ungefähr 100 mg jeder Probe wurden nach dem Zufallsprinzip verblindet kodiert und für weitere Analysen verwendet.

2.4. HPV-Nachweis und Genotypisierung

Der Nachweis menschlicher HPV-DNA erfolgte mittels einer verschachtelten PCR-Strategie unter Verwendung von PGMY09/PGMY11 als äußere Primer und GP5+/GP6+ als innere Primer. Diese Primer amplifizieren eine HPV-L1-Konsensusregion, mit der mehr als 25 HPV-Typen nachgewiesen werden können. Jede Reaktion wurde in einem Gesamtvolumen von 25 μL mit 200 ng gDNA, 12,5 μL Bullseye HS-Taq 2x Master Mix (MidSci, St. Louis, MO) und 100 nmol/L gepoolter PGMY09/11-Primer durchgeführt. Es wurden die folgenden Bedingungen verwendet: 15 Minuten bei 95°C, gefolgt von 35 Zyklen von je 60 Sekunden bei 94°C, 60°C und 72°C, mit einer abschließenden Verlängerung von 10 Minuten bei 72°C. Zwei Mikroliter der ersten PCR-Reaktion wurden als Template für die nested PCR verwendet. Die Bedingungen für die nested PCR waren identisch mit denen der ersten PCR-Reaktion, mit Ausnahme der Annealing-Temperatur, die 52°C betrug. Die amplifizierten Produkte wurden elektrophoretisch untersucht und mit einem ChemiDoc (Bio-Rad, Hercules, CA) analysiert. Der Nachweis von pHPV-16 gereinigter Plasmid-DNA (ATCC 45113D) wurde als Positivkontrolle und Wasser als Negativkontrolle verwendet.

Die Genotypisierung von HPV-16-DNA wurde mit den typspezifischen Primern für HPV-16 E6 durchgeführt. Für den ersten Lauf wurden die HPV-16E6-Primer Pr80 (5′-CTGACTCGAG/TTTATGCACCAAAAGAGAAC-3′) und Pr625 (5′-GATCAGTTGTCTGGTTGC-3′) verwendet, mit den gleichen PCR-Bedingungen wie oben beschrieben, mit Ausnahme der Annealing-Temperatur, die 68°C betrug. Die Bedingungen für die nested PCR mit den Primern Pr106: 5′-GTTTCAGGACCCACAGGAGC-3′ und Pr562: 5′-GTACTCACC CC/TGATTACAGCTGGGTTT C-3′ waren die gleichen, mit Ausnahme der Annealing-Temperatur, die 60°C betrug. Als Positiv- bzw. Negativkontrollen wurden der Nachweis der gereinigten pHPV-16-Plasmid-DNA (ATCC 45113D) und Wasser verwendet. Die Amplikons wurden wie beschrieben elektrophoretisiert und visualisiert. Zehn Prozent der durch nested PCR getesteten Proben wurden im Labor des AIDS-Forschungsprogramms an der Ponce School of Medicine & Health Sciences (Ponce, PR) mit dem INNO-LiPA HPV Genotyping Extra Kit (Fujirebio, Gent, Belgien) extern validiert und bestätigt.

2.5. Physikalischer HPV-Status

Der physikalische Status des HPV-16-Genoms wurde durch Untersuchung der E2-Sequenzintegrität mit einer zuvor beschriebenen nested PCR-Strategie bestimmt. Alle Tumore, die HPV-16-DNA enthielten, wurden analysiert (). Die nested PCR-Analyse wurde mit zwei Sätzen spezifischer HPV-16-Primer durchgeführt, darunter zwei Vorwärtsprimer, Pr7581 (5′-CACTGCTTGCCAACCATTCC-3′) und Pr7677 (5′-GCC AAC GCC TTA CAT ACC G-3′) sowie 2 Reverse-Primer, Pr128 (5′-GTCGCTCCTGTGGGTCCTG-3′) und Pr223 (5′-ACGTCGCAGTAACTGTTGC-3′). Beide PCRs wurden unter denselben Bedingungen wie zuvor beschrieben durchgeführt, mit Ausnahme der Annealing-Temperatur, die 60°C betrug. Die Amplikons wurden wie beschrieben analysiert. Als Positivkontrollen wurde DNA verwendet, die aus den menschlichen Gebärmutterhals-Zelllinien CaSki (CRL-1550) und SiHa (HTB-35) extrahiert wurde. Das Fehlen eines PCR-Produkts wurde als E2-Sequenzunterbrechung und Integration der viralen DNA in das Wirtsgenom interpretiert. Das Vorhandensein von E2-Amplikonen weist auf das Vorhandensein von episomalen HPV-16-Genomen hin.

2.6. Statistische Analyse

Die soziodemografischen, klinischen und Lebensstil-Merkmale der Fälle und Kontrollen wurden anhand von Häufigkeitsverteilungen für kategorische Variablen und zusammenfassenden Maßen für quantitative Variablen beschrieben. Zum Vergleich der Studiengruppen wurden zweiseitige Tests verwendet: der Chi-Quadrat-Test oder der exakte Test von Fisher für kategorische Variablen und der Student’s-Test oder der Mann-Whitney-Test zum Vergleich quantitativer Variablen. Unbedingte logistische Regressionsmodelle wurden verwendet, um die OR mit 95%iger Sicherheit für CRC in Abhängigkeit vom HPV-Status und anderen Variablen zu schätzen. Die statistischen Analysen wurden mit SPSS 17.0 (SPSS Inc.) und Epi InfoTM 7 (CDC) durchgeführt.

3. Ergebnisse

3.1. Soziodemografische, lebensstilbezogene und klinische Merkmale der Studienteilnehmer

Die demografischen und klinischen Merkmale der Studienpopulation (; 45 CRC-Fälle und 36 Kontrollen) sind in Tabelle 1 dargestellt. Das Durchschnittsalter der CRC-Fälle betrug 61,1 Jahre (zwischen 38 und 86 Jahren; 24 waren männlich). In der Kontrollgruppe lag das Durchschnittsalter bei 60,9 Jahren (zwischen 42 und 85 Jahren; 15 waren männlich). Im Vergleich zu den Kontrollpersonen war bei den Darmkrebsfällen die Wahrscheinlichkeit höher, dass eine Darmkrebserkrankung in der Familie vorlag (OR 0,29; 95 % 0,10-0,80). Was das von den Betroffenen angegebene Alter der an Darmkrebs erkrankten Familienmitglieder anbelangt, so lag das mittlere Alter der Darmkrebsdiagnose bei den Verwandten der Fälle und der Kontrollen bei 60 Jahren. Beim Vergleich von Fällen und Kontrollen mit Verwandten, bei denen Darmkrebs im Alter von ≥60 Jahren bzw. <60 Jahren diagnostiziert wurde, wurden keine statistisch signifikanten Zusammenhänge festgestellt. Es wurden keine anderen signifikanten Assoziationen gefunden.

3.2. HPV-DNA-Nachweis

Ein signifikanter Unterschied in der Prävalenz der HPV-Infektion wurde beim Vergleich von kolorektalem Tumorgewebe und normaler Mukosa von Kontrollen festgestellt. HPV-DNA wurde in 19 der 45 (42,2 %) CRC-Proben und in 1 der 36 (2,8 %) untersuchten Kontrollproben nachgewiesen (Abbildung 1). Eine HPV-Infektion war positiv mit CRC assoziiert (OR 25,58; 95% CI 3,22 bis 203,49) (Tabelle 2). Der Zusammenhang zwischen HPV-positivem Status und CRC wurde in allen anatomischen Regionen des Dickdarms beobachtet.

Abbildung 1

HPV-Nachweisassay. Diese Abbildung zeigt das elektrophotetische Profil von 12 repräsentativen Fällen, die mittels nested PCR auf den Nachweis von HPV L1 untersucht wurden. Die Fälle 2, 4, 5, 6, 8 und 10 sind positiv, wie das Vorhandensein des durch das Primerpaar GP 5+/6+ erzeugten Amplikons zeigt. Spur M ist der Molekulargrößenmarker; die Spuren 13 und 14 waren HPV-positive bzw. Wasser-Kontrollen.

3.3. Soziodemografische, lebensstilbezogene und klinisch-pathologische Merkmale der HPV-positiven Fälle

Das Durchschnittsalter der HPV-positiven CRC-Fälle betrug 60,3 Jahre (zwischen 45 und 86 Jahren; 9 waren Männer). Es wurde kein signifikanter Zusammenhang zwischen dem HPV-positiven Status und den folgenden Faktoren festgestellt: Geschlecht, Alter, Tabak- oder Alkoholkonsum, Diabetes in der Vorgeschichte, Krebs in der Familienanamnese oder Darmkrebs in der Familienanamnese (Tabelle 3). Es wurden keine signifikanten Zusammenhänge zwischen dem HPV-Status und der histologischen Differenzierung, dem Tumorstadium oder der Lokalisation festgestellt (Tabelle 4).

HPV (+) CRC (%) HPV (-) CRC (%) Wert OR (95% CI) Geschlecht Männlich 9 (47.4) 15 (57.7) 0.49 0.66 (0.20-2.17) weiblich 10 (52.6) 11 (42.3) Referenz Altersmedian 59 (45-86) 61.5 (38-83) 61 8 (42.1) 15 (57.7) 0.30 0.53 (0.16-1.77) 61 11 (57.9) 11 (42.3) Referenz Lebensstil Je Zigaretten geraucht Ja 9 (47.4) 15 (57.7) 0.49 0.66 (0.20-2.17) Nein 10 (52.6) 11 (42.3) Referenz Jemals Alkohol getrunken Ja 9 (47.4) 16 (61.5) 0.35 0.56 (0.17-1.86) Nein 10 (52.6) 10 (38.5) Referenz Klinische Vorgeschichte Diagnose Diabetes Ja 4 (21.1) 7 (29.1) 0.73 0.65 (0.14-2.73) Nein 15 (78.9) 17 (70.8) Referenz Krebserkrankungen in der Familie Ja 16 (84,2) 16 (61,5) 0,10 3,33 (0,77-14.42) Nein 3 (15.8) 10 (38.5) Referenz Karzinom in der Familie Ja 3 (15.8) 5 (19.2) 0.79 (0.14-3.95) Nein 16 (84.2) 21 (80.8) Referenz

Die Zahl der Fälle kann je nach Verfügbarkeit der Informationen zwischen den Kategorien variieren. Die Werte wurden mit Hilfe von Chi-Quadrat-Tests oder exakten Tests von Fisher berechnet, sofern zutreffend. Mittlere exakte Methode; Fisher’s exakter Test.

Tabelle 3

Zusammenfassung der demografischen, lebensstilbezogenen und klinischen Merkmale der CRC-Fälle nach HPV-Status.

HPV (+) CRC (%) HPV (-) CRC (%) Wert OR (95% CI) Differenzierung Schlecht 1 (5.3) 1 (3.8) 1.14 (0.03-47.21) Gut/mittelmäßig 14 (73.7) 16 (61.5) Referenz Stadium Fortgeschritten (III und IV) 7 (38.9) 6 (37.5) 0.93 1.06 (0.27-4.24) Früh (0, I und II) 11 (61.1) 10 (62.5) Referenz Tumorlage Proximal 4 (21.1) 3 (11.53) 0.43 2.04 (0.37-12.16) Distal und Rektum 15 (79.0) 23 (88.5) Referenz

Die Anzahl der Fälle kann je nach Verfügbarkeit der Informationen zwischen den Kategorien variieren. Die Werte wurden mit Hilfe von Chi-Quadrat-Tests oder exakten Tests von Fisher berechnet, sofern angemessen. Mittlere exakte Methode; exakter Test von Fisher.

Tabelle 4

Klinisch-pathologische Merkmale kolorektaler Tumoren nach HPV-Status.

3.4. HPV-16-Genotypisierung und Bewertung des Virusstatus

HPV-16 wurde in 12 der 19 HPV-positiven CRC-Proben (63,2 %) nachgewiesen; die übrigen 7 (36,8 %) entsprachen anderen HPV-Genotypen (nicht typisiert). HPV-16 wurde in der HPV-positiven Kontrollprobe nicht nachgewiesen. Die Verteilung der HPV-16-positiven Tumoren hinsichtlich der Tumorlokalisation war wie folgt: 33,3 % (4 von 12) der Proben befanden sich im proximalen Dickdarm (Zökum, aufsteigender Dickdarm und querverlaufender Dickdarm), 50,0 % (6 von 12) im distalen Dickdarm (Milzbeuge, absteigender Dickdarm und sigmoider Dickdarm), und 16,7 % (2 von 12) wurden im Rektum entdeckt. Von den Nicht-HPV-16-Tumoren befanden sich 2 von 7 (28,6 %) im distalen Kolon und 5 von 7 (71,43 %) im Rektum. Der physikalische Status der HPV-16-DNA in CRC-Gewebe wurde durch den Nachweis von HPV-16 E2 bestimmt. Das Amplikon, das dem intakten E2 entspricht, wurde in keinem der HPV-16-positiven Fälle nachgewiesen, was darauf hindeutet, dass das HPV-16-Genom integriert war.

4. Diskussion und Schlussfolgerungen

HPV ist in kolorektalen Tumoren nachgewiesen worden. Die Rolle von HPV in der kolorektalen Karzinogenese ist jedoch noch nicht geklärt und bleibt umstritten. In der aktuellen Untersuchung berichten wir über eine rigorose Bewertung von HPV-Infektionen in kolorektalem Gewebe (CRC-Fälle und normale Mukosa-Kontrollen) aus einer gut charakterisierten hispanischen Population, die Berichten zufolge eine hohe Inzidenz von HPV-assoziierten Malignomen und eine hohe CRC-Mortalitätsrate aufweist. Die HPV-16-Genotypisierung und der physikalische Status des HPV-16-Genoms wurden ebenfalls untersucht.

In den untersuchten Tumorgeweben wurde eine hohe Prävalenz der HPV-Infektion (42,2 %) festgestellt. Nur 1 der 36 (2,8 %) Kontrollproben war positiv für einen Nicht-HPV-16-Typ. Die in unserer Kohorte festgestellte Prävalenz von HPV-Infektionen in kolorektalen Tumoren ist vergleichbar mit Prozentsätzen, die zuvor in Studien aus verschiedenen Ländern mit unterschiedlichen experimentellen Ansätzen berichtet wurden. Bei der immunhistochemischen Analyse von in Formalin fixierten, in Paraffin eingebetteten (FFPE) Gewebeproben von Personen aus den USA (30 Kontrollen, 30 Adenome und 43 CRC) wurde HPV-DNA in 27 % bzw. 69 % der Adenome und CRC nachgewiesen. HPV-Typ-spezifische PCR-Analysen von DNA aus FFPE-Proben chinesischer Personen wiesen HPV in 29 % der Adenome () und in 53 % der kolorektalen Karzinome () nach. Eine andere Studie, bei der dieselbe Nested-PCR-Strategie wie in dieser Studie in Kombination mit In-situ-PCR angewandt wurde, wies HPV-DNA in 51 % der kolorektalen Karzinom-Proben () und nicht in Kontrollproben () von Personen aus den USA nach. In anderen Studien, in denen dieselbe Nested-PCR-Strategie bei Darmkrebs-Proben von argentinischen Personen angewandt wurde, wurde HPV in 44 % der Darmkrebs-Proben nachgewiesen () . Pérez et al. (2005) berichteten jedoch, dass HPV in 33 % der untersuchten nicht-neoplastischen kolorektalen Gewebe vorhanden war () . Im Gegensatz dazu konnten mehrere Studien HPV nicht nachweisen und legen nahe, dass eine HPV-Infektion kein Risikofaktor für CRC ist.

HPV-16 ist der häufigste Hochrisikotyp in Amerika. HPV-16 wurde auch bei HPV-assoziierten malignen Erkrankungen in der PR, wie Kopf- und Halskrebs und Gebärmutterhalskrebs, als sehr häufig beschrieben. In unserer Studie war HPV-16 der am häufigsten nachgewiesene Hochrisiko-HPV-Typ; HPV-16 war in 63,2 % der HPV-positiven Darmkrebs-Proben (12 von 19) vorhanden, was mit einigen früheren Berichten vergleichbar ist, in denen HPV-16 der am häufigsten nachgewiesene Hochrisiko-HPV-Typ war. Auch bei der Analyse von HPV-positiven Darmkrebs-Proben mit einer PCR-basierten HPV-16-Genotypisierungsmethode wurde HPV-16 als häufigster Virustyp nachgewiesen, der in 41 der 60 Fälle (68,3 %) vorhanden war. Bei der HPV-16-Genotypisierung mit denselben Primerpaaren, die in dieser Studie verwendet wurden, wurde HPV-16 in 36 % der CRC-Proben nachgewiesen () . Bei Verwendung von nicht-PCR-basierten HPV-16-Genotypisierungstechniken wurde HPV-16 in 16-94 % der HPV-positiven CRC-Proben gefunden.

Die Diskrepanzen in der Literatur, in der über den Nachweis von HPV und HPV-16 in kolorektalen Tumoren berichtet wird, können auf methodische Unterschiede zurückgeführt werden, einschließlich Studiendesign, Art der Gewebeprobe, Probengröße, Probenentnahme und Unterschiede in der Empfindlichkeit der verwendeten HPV-Nachweis- oder Genotypisierungstechnik. Gefrorene Gewebeproben wurden verwendet, weil die extrahierte DNA von besserer Qualität ist als die DNA aus FFPE, die abgebaut wird. Durch das Fixierungsverfahren wird die DNA zu Fragmenten <200 bp abgebaut, was zu einer geringeren PCR-Ausbeute und der Unfähigkeit führt, lange Zielmoleküle zu amplifizieren. Daher ist die aus FFPE extrahierte DNA nicht optimal für die in unseren Analysen verwendete Nested-PCR-Strategie. Die Primer-Kombination PGMY/GP+ amplifiziert HPV L1 (450 bp). Diese Primer-Kombination hat sich als typsensitiver erwiesen als die MY/GP+ Primer-Sets, da sie ein breiteres Spektrum von HPV-Typen nachweist. Weitere Unterschiede beim Nachweis von HPV in Darmkrebs wurden mit regionalen Unterschieden in der Prävalenz von HPV-Infektionen in Verbindung gebracht, die durch den rassischen/ethnischen und geografischen Hintergrund der Testpersonen beeinflusst werden. Zum Beispiel wird HPV-18 am häufigsten bei Darmkrebsfällen aus Asien und Europa nachgewiesen.

HPV wurde in Darmkrebsgewebe in mehreren Tumorproben aus dem gesamten Dickdarm nachgewiesen. HPV wurde in 21,05 % der proximalen Tumore, in 42,11 % der distalen Tumore und in 36,84 % der Tumore im Rektum nachgewiesen. Die breite anatomische Verteilung von HPV-Infektionen in Darmkrebs-Tumorgewebe deutet darauf hin, dass die HPV-Infektion bei Darmkrebs nicht das Ergebnis einer retrograden Virusübertragung aus dem Anogenitalbereich ist. Angesichts dieser Ergebnisse können wir die Möglichkeit einer hämatologischen Ausbreitung, wie von Bodaghi et al. vorgeschlagen, nicht ausschließen. Es gibt Hinweise auf HPV-Infektionen bei Kleinkindern und Universitätsstudentinnen, die noch nie penetrativen Geschlechtsverkehr hatten, was dafür spricht, dass eine HPV-Übertragung über andere, nicht sexuelle Wege möglich ist. Obwohl HPV eine sexuell übertragbare Krankheit ist, haben wir keine Informationen über das Sexualverhalten gesammelt, die es uns ermöglicht hätten, zu beurteilen, ob es einen Zusammenhang zwischen CRC und Sexualverhalten gibt.

Die Integration des Virus in das Wirtsgenom ist ein kritischer Schritt bei der Entstehung von Gebärmutterhalskrebs. Die Integration von HPV in das Wirtsgenom wurde bei etwa 90 % der Zervixkarzinome festgestellt. Diese Fälle weisen eine Expression der viralen Onkogene E6 und E7 auf. Der physische HPV-Status kann durch das Fehlen eines PCR-Produkts nachgewiesen werden, da der offene Leserahmen E2 bei der Integration von HPV in das Wirtsgenom gestört wird. Mögliche Einschränkungen bei der Anwendung dieser Methode könnten die folgenden sein: Der Test kann integrierte virale DNA nur dann nachweisen, wenn keine episomale HPV-DNA vorhanden ist, er kann nicht zwischen rein episomalen und gemischten Formen unterscheiden, und die Möglichkeit einer viralen Integration ohne Verlust des E2-Genfragments wird nicht berücksichtigt. In unserer Studie wiesen jedoch alle positiv getesteten HPV-16-Fälle eine Integration auf, was das Vorhandensein von episomalen Genomen ausschließt. Der hohe Prozentsatz der Integration des HPV-16-Genoms in das Wirtsgenom unterstützt die Möglichkeit, dass HPV eine Rolle bei der kolorektalen Karzinogenese spielen könnte. Unsere Ergebnisse sind zwar ermutigend, müssen aber mit Vorsicht interpretiert werden. Trotz der hohen Prävalenz der Infektion kolorektaler Tumoren mit einem Hochrisiko-HPV-Typ (HPV-16) und dem Nachweis der viralen Genomintegration müssen künftige Studien bewerten, ob die HPV-Infektionen aktiv sind und ob die Onkoproteine E6 und E7 exprimiert werden, um zur kolorektalen Karzinogenese beizutragen und/oder eine kausale Rolle zu spielen.

Unsere Studie hat eine relativ kleine Stichprobengröße, was eine Einschränkung für stratifizierte und eingeschränkte Analysen darstellen kann. Dies könnte zu einigen ungenauen Schätzungen führen (wie die breiten 95 %-Konfidenzintervalle zeigen). Dennoch ist die Größenordnung der beobachteten Odds Ratios für den Zusammenhang zwischen HPV und Darmkrebs sehr hoch und es ist unwahrscheinlich, dass sie auf einen statistischen Fehler vom Typ I zurückzuführen sind. Die in dieser Studie gewonnenen Daten in Kombination mit Berichten in der Literatur reichen noch nicht aus, um zu dem Schluss zu kommen, dass HPV gemäß den Bradford-Hill-Kriterien für die Verursachung von Darmkrebs ursächlich ist. Fünf der 9 postulierten Kriterien sind erfüllt. (1) Stärke: Starke statistisch signifikante Assoziationen wurden in dieser Studie und in der Literatur berichtet. (2) Konsistenz: HPV wurde in anderen Studien, die dieselbe Methodik verwendeten, bei Darmkrebs nachgewiesen. (3) Plausibilität: HPV integriert sich in das Wirtsgenom und exprimiert onkogene Proteine, von denen bekannt ist, dass sie die Karzinogenese fördern. (4) Analogie: Hochrisiko-HPV, wie HPV-16, spielen eine kausale Rolle bei anderen Krebsarten wie Gebärmutterhalskrebs. (5) Zeitlichkeit: HPV wurde auch in Adenomen, Vorläuferläsionen von Darmkrebs, nachgewiesen. Weitere Längsschnittstudien zur Bewertung der Rolle von HPV bei der kolorektalen Karzinogenese sind erforderlich, um das Kriterium der Konsistenz und Zeitlichkeit vollständig zu unterstützen. Zusammenfassend lässt sich sagen, dass diese Studie eine hohe Prävalenz von HPV-Infektionen, eine hohe Prävalenz von HPV-16 (einem Hochrisikotyp) und die Integration des HPV-16-Genoms in kolorektales Tumorgewebe von karibischen Hispanics zeigt. Weitere Analysen sind erforderlich, um einen kausalen Zusammenhang zwischen HPV und kolorektalem Karzinom herzustellen.

Interessenkonflikt

Die Autoren erklärten, dass kein Interessenkonflikt besteht.

Danksagungen

Dieses Projekt wurde durch RCMI Grant G12MD007600 und Grant U54MD007587 vom NIMHD unterstützt. Zusätzliche Unterstützung wurde durch die Grants R21CA167220 und U54CA096297 des NCI gewährt. Die Autoren danken Dr. Ana Patricia Ortiz für die kritische Durchsicht dieser Arbeit.