For at undersøge virkningen af at øge enzymkoncentrationen på reaktionshastigheden skal substratet være til stede i en overskydende mængde; dvs. at reaktionen skal være uafhængig af substratkoncentrationen. Enhver ændring i mængden af produkt, der dannes i løbet af et bestemt tidsrum, vil være afhængig af den tilstedeværende enzymkoncentration. Grafisk kan dette fremstilles som:
Disse reaktioner siges at være af “nulorden”, fordi hastigheden er uafhængig af substratkoncentrationen og er lig med en eller anden konstant k. Produktdannelsen forløber med en hastighed, der er lineær med tiden. Tilsætning af mere substrat tjener ikke til at øge hastigheden. I nulordenskinetik resulterer det, at man lader assayet køre i dobbelt tid, i en dobbelt så stor mængde produkt.
| Order | Rate ligning | |
|---|---|---|
| nul | rate = k | hastigheden er uafhængig af substratkoncentrationen |
| første | hastighed = k | hastigheden er proportional med den første potens af substratkoncentrationen |
| nederste | hastighed = k=k2 | hastigheden er proportional med kvadratet på substratkoncentrationen |
| nederste | hastighed = k | hastigheden er proportional med første potens af hver af to reaktanter |
Mængden af enzym, der er til stede i en reaktion, måles ved den aktivitet, som det katalyserer. Forholdet mellem aktivitet og koncentration påvirkes af mange faktorer som f.eks. temperatur, pH-værdi osv. Et enzymassay skal udformes således, at den observerede aktivitet er proportional med den tilstedeværende enzymmængde, således at enzymkoncentrationen er den eneste begrænsende faktor. Det er kun opfyldt, når reaktionen er nul-orden.
I figur 5 er aktiviteten direkte proportional med koncentrationen i området AB, men ikke i BC. Enzymaktiviteten er generelt størst, når substratkoncentrationen er ubegrænsende.
Når koncentrationen af produktet af en enzymatisk reaktion plottes mod tiden, fås en lignende kurve, figur 6.
Mellem A og B repræsenterer kurven en reaktion af nul-orden; dvs. en reaktion, hvor hastigheden er konstant med tiden. Efterhånden som substratet er opbrugt, er enzymets aktive steder ikke længere mættede, substratkoncentrationen bliver hastighedsbegrænsende, og reaktionen bliver af første orden mellem B og C.
For at måle enzymaktiviteten ideelt set skal målingerne foretages i den del af kurven, hvor reaktionen er af nulorden. Det er mest sandsynligt, at en reaktion er nul-orden i begyndelsen, da substratkoncentrationen da er højest. For at være sikker på, at en reaktion er nul-orden, skal der foretages flere målinger af produkt- (eller substrat-) koncentrationen.
Figur 7 illustrerer tre typer af reaktioner, der kan forekomme i enzymassager, og viser de problemer, der kan opstå, hvis der kun foretages enkeltmålinger.
B er en ret linje, der repræsenterer en nul-ordningsreaktion, som muliggør en nøjagtig bestemmelse af enzymaktiviteten i en del af eller hele reaktionstiden. A repræsenterer den reaktionstype, der blev vist i figur 6. Denne reaktion er i første omgang af nul-orden og bliver derefter langsommere, formentlig på grund af substratudtømning eller produktinhibering. Denne reaktionstype betegnes undertiden som en “ledende” reaktion. Den ægte “potentielle” aktivitet er repræsenteret ved den stiplede linje. Kurve C repræsenterer en reaktion med en indledende “forsinkelsesfase”. Igen repræsenterer den stiplede linje den potentielt målbare aktivitet. Ved hjælp af flere bestemmelser af produktkoncentrationen kan hver kurve udtegnes og den virkelige aktivitet bestemmes. En enkelt bestemmelse af slutpunktet ved E ville føre til den forkerte konklusion, at alle tre prøver havde identisk enzymkoncentration.