Alta prevalencia del virus del papiloma humano en el cáncer colorrectal en hispanos: Un estudio de casos y controles

Abstract

El papel del virus del papiloma humano (VPH) en la carcinogénesis colorrectal sigue siendo esquivo. Basándose en la alta incidencia de neoplasias malignas asociadas al VPH entre los hispanos puertorriqueños, este estudio tuvo como objetivo evaluar la prevalencia de la infección por el VPH y la integración viral en los tejidos colorrectales con el fin de evaluar su putativo papel en el cáncer colorrectal (CCR). En este estudio de casos y controles, se evaluó la prevalencia de la infección por VPH en el CCR (casos n = 45) y en la mucosa del colon normal de sujetos libres de cáncer (controles n = 36) mediante una estrategia de PCR anidada. Se realizó la genotipificación del VPH-16 en los tejidos positivos al VPH y se determinó el estado físico del genoma del VPH-16 mediante la detección de E2. El VPH se detectó en 19 de 45 (42,2%) casos de CCR (edad media de 61,1 ± 10,7 años, 24 varones) y en 1 de 36 (2,8%) controles (edad media de 60,9 ± 9,6 años, 24 varones) con una OR = 25,58 (IC 95%: 3,21 a 203,49). El VPH-16 se detectó en el 63,2% de los tumores colorrectales positivos al VPH; se observó la integración del genoma en todos los casos positivos al VPH-16. Este es el primer informe que muestra la alta prevalencia de las infecciones por VPH en los tumores colorrectales hispanos del Caribe. A pesar de la evidencia de la integración del VPH en el genoma del huésped, se justifica un mayor análisis mecanístico que examine la expresión de la oncoproteína del VPH y el papel putativo de estas oncoproteínas en la carcinogénesis colorrectal.

1. Introducción

Las infecciones por el virus del papiloma humano (VPH) son las infecciones de transmisión sexual más comunes en los Estados Unidos (EEUU) (http://www.cdc.gov/std/hpv/STDFact-HPV.htm). Los VPH son virus epiteliotrópicos de ADN de doble cadena que infectan los epitelios escamosos de las células mucosas de la piel. La multiplicación viral se produce en los núcleos celulares y está estrechamente vinculada al estado de diferenciación de la célula. Existen más de 100 genotipos de VPH. Los tipos 6, 11, 40 y 42 suelen estar asociados a lesiones benignas y se clasifican como tipos de bajo riesgo. El VPH-16, el VPH-18, el VPH-31 y el VPH-45 se consideran de alto potencial oncogénico y se denominan tipos de alto riesgo. El VPH se ha identificado como agente causal en los cánceres de cuello de útero, vaginales, anales, orales y de pene. Los estudios también han mostrado fuertes correlaciones entre el VPH y el desarrollo de muchos tipos de cáncer, como el de esófago, faringe y laringe. Sin embargo, el supuesto papel de la infección por el VPH en la carcinogénesis colorrectal no se ha dilucidado adecuadamente y sigue siendo controvertido.

La patogénesis del CCR ha llegado a comprenderse mejor a nivel molecular; sin embargo, la etiología del CCR sigue siendo incompleta. En la última década, varios estudios han sugerido que el VPH podría tener un papel en la carcinogénesis colorrectal . La detección del VPH en el tejido del colon ha dado lugar a una amplia gama de trabajos que proponen una asociación causal entre el VPH y el CCR. La presencia del VPH en el tejido del colon sigue siendo un tema de debate muy controvertido debido a las inconsistencias en la reproducibilidad de los resultados. Dado que la integración del genoma del VPH es necesaria para que el virus ejerza su potencial carcinogénico, la evaluación del estado físico del genoma viral tras confirmar la infección por VPH es esencial para establecer una asociación causal. La inactivación del gen E2 por integración genómica promueve la expresión de las oncoproteínas E6 y E7, que antagonizan la función de p53 y pRB, respectivamente . La degradación resultante de p53 y pRB mediada por estas oncoproteínas facilita la proliferación del ADN viral dentro del huésped y conduce a la neoplasia por mecanismos bien descritos en la literatura.

El CCR es responsable de aproximadamente 694.000 muertes en todo el mundo. En los Estados Unidos, el CCR es el tercer cáncer más diagnosticado y la tercera causa de muerte por cáncer. En Puerto Rico (PR), el CCR es el segundo más diagnosticado y la principal causa de muerte por cáncer entre hombres y mujeres . Se ha reportado una alta prevalencia de cánceres relacionados con el VPH y una alta prevalencia de VPH en muestras anogenitales entre hombres y mujeres puertorriqueños . La seroprevalencia del VPH-16 fue reportada en un 11.3% en una muestra poblacional de adultos en PR , la cual es similar a la reportada en los Estados Unidos (11.5%) . Por lo tanto, dadas las altas tasas de mortalidad por CCR y la alta incidencia de morbilidades relacionadas con el VPH en PR, el objetivo general de este estudio de casos y controles fue evaluar la asociación entre el CCR y la infección por VPH en muestras de hispanos puertorriqueños.

2. Métodos

2.1. Declaración ética

Este estudio fue aprobado por el IRB del Recinto de Ciencias Médicas de la Universidad de Puerto Rico (#A7330109). Todos los procedimientos se ajustaron a las normas éticas del IRB.

2.2. Reclutamiento de los sujetos y adquisición de la muestra

Los casos y los controles se reclutaron consecutivamente mediante un muestreo de conveniencia y se emparejaron en frecuencia por sexo y edad. Los participantes del estudio de 21 años o más fueron reclutados cuando acudieron a las instalaciones del Centro Médico de Puerto Rico para someterse a colonoscopias debido a exámenes de rutina, síntomas y/o referencias de gastroenterólogos y cirujanos colorrectales. Se explicó el propósito de este estudio y todos los participantes del estudio dieron su consentimiento informado antes de la inclusión. Todos los participantes incluidos en este análisis eran hispanos. La condición de hispano se definió por la herencia o el lugar de nacimiento declarados por el participante. Todos los sujetos de control incluidos en este estudio tenían resultados normales en su colonoscopia. Los individuos con CCR tenían un diagnóstico de adenocarcinoma confirmado por histopatología. Se excluyeron los sujetos con síndromes de cáncer hereditario y enfermedad inflamatoria intestinal.

Se obtuvo tejido fresco congelado de 45 pacientes de CCR esporádicos no familiares (casos) y 36 individuos sin cáncer (controles). Los tejidos se obtuvieron de pacientes con CCR durante la cirugía de resección del tumor. Se excluyeron los tumores anales o perianales y las muestras de tejido de individuos que declararon ser seropositivos. La localización del tumor se clasificó como proximal (desde el ciego hasta el colon transverso distal), distal (desde la flexura esplénica hasta el colon sigmoide) o rectal (últimos 20 cm del colon). Las biopsias de tejido colorrectal de control se obtuvieron del colon distal durante colonoscopias rutinarias.

Usando el Cuestionario de Factores de Riesgo de Cáncer Colorrectal de los Registros Familiares Colaborativos (http://coloncfr.org/), se recogieron datos clínicos y sociodemográficos de cada paciente, incluyendo el género, el estilo de vida, los antecedentes médicos y los antecedentes familiares de cáncer. Las características sociodemográficas y clínicas analizadas en el estudio fueron el género (hombre frente a mujer), la edad media (<61 años frente a ≥61 años), el diagnóstico de DM tipo 2 (sí frente a no), los antecedentes familiares de cualquier cáncer (sí frente a no) y los antecedentes familiares de CCR (sí frente a no). Los antecedentes familiares se definen como tener un familiar de primer, segundo o tercer grado con cáncer. Las características del estilo de vida que se analizaron en este estudio fueron el consumo de alcohol (alguna vez frente a nunca) y la condición de fumador (alguna vez frente a nunca).

2.3. Extracción de ADN

El ADN genómico (ADNg) se extrajo de ≈100 mg de tejido utilizando el kit de aislamiento de ADN para células y tejidos (Roche Applied Science, Indianápolis, IN) siguiendo las instrucciones del fabricante. Con fines de control de calidad, se utilizó la amplificación por PCR del gen de la -actina para evaluar la integridad del ADNg; las muestras de las que no se pudo amplificar la -actina se excluyeron del estudio.

Se tomaron las siguientes precauciones estandarizadas para minimizar la contaminación cruzada entre muestras: todos los instrumentos y bancos de trabajo se limpiaron con DNAZap (Ambion, Foster City, CA), seguido de lejía al 10% y ETOH al 70% antes de manipular las muestras. Se utilizaron cuchillas nuevas y estériles para cada muestra. El procesamiento de tejidos y la extracción de nucleótidos se limitaron a un máximo de 10 muestras por día. Aproximadamente 100 mg de cada muestra se codificaron al azar de forma ciega y se utilizaron para los análisis posteriores.

2.4. Detección y genotipado del VPH

La detección del ADN del VPH humano se realizó mediante una estrategia de PCR anidada utilizando PGMY09/PGMY11 como cebadores externos y GP5+/GP6+ como cebadores internos . Estos cebadores amplifican una región consenso del VPH L1 que detecta más de 25 tipos de VPH. Cada reacción se llevó a cabo en un volumen total de 25 μL que contenía 200 ng de ADNg, 12,5 μL de Bullseye HS-Taq 2x Master Mix (MidSci, St. Louis, MO) y 100 nmol/L de cebadores PGMY09/11 agrupados. Se utilizaron las siguientes condiciones: 15 minutos a 95°C, seguidos de 35 ciclos de 60 segundos cada uno a 94°C, 60°C y 72°C, con una extensión final de 10 minutos a 72°C. Se utilizaron dos microlitros de la primera reacción de PCR como molde para la PCR anidada. Las condiciones de la PCR anidada fueron idénticas a las de la primera PCR con la excepción de la temperatura de recocido, que fue de 52°C. Los productos amplificados se electroforizaron y analizaron utilizando un ChemiDoc (Bio-Rad, Hercules, CA). La detección del ADN plasmídico purificado de pHPV-16 (ATCC 45113D) se utilizó como control positivo y el agua como control negativo.

El genotipado del ADN del HPV-16 se llevó a cabo con los cebadores específicos del tipo dirigidos al HPV-16 E6 . Se utilizaron los cebadores HPV-16E6 Pr80 (5′-CTGACTCGAG/TTTATGCACCAAAAGAAC-3′) y Pr625 (5′-GATCAGTTGTCTGGTTGC-3′) para la primera ejecución, con las mismas condiciones de PCR descritas anteriormente a excepción de la temperatura de recocido, que fue de 68°C. Las condiciones para la PCR anidada con los cebadores Pr106: 5′-GTTTCAGGACCCACAGGAGC-3′ y Pr562: 5′-GTACTCACC CC/TGATTACAGCTGGTTT C-3′ fueron las mismas, con la excepción de la temperatura de recocido, que fue de 60°C. La detección del ADN plasmídico purificado de pHPV-16 (ATCC 45113D) y el agua se utilizaron como controles positivos y negativos, respectivamente. Los amplicones se electroforizaron y se visualizaron como se ha descrito. El diez por ciento de las muestras analizadas por PCR anidada fueron validadas y confirmadas externamente en el Laboratorio del Programa de Investigación del SIDA de la Escuela de Medicina de Ponce & Ciencias de la Salud (Ponce, PR) utilizando el kit INNO-LiPA HPV Genotyping Extra (Fujirebio, Gent, Bélgica).

2.5. Estado físico del VPH

El estado físico del genoma del VPH-16 se determinó examinando la integridad de la secuencia E2 mediante una estrategia de PCR anidada previamente descrita . Se analizaron todos los tumores que albergaban ADN del VPH-16 (). El análisis de la PCR anidada se realizó utilizando 2 conjuntos de cebadores específicos para el VPH-16 que incluían 2 cebadores delanteros, Pr7581 (5′-CACTGCTTGCCAACCATTCC-3′) y Pr7677 (5′-GCC AAC GCC TTA CAT ACC G-3′), y 2 cebadores inversos, Pr128 (5′-GTCGCTCGTGGTCG-3′) y Pr223 (5′-ACGTCGCAGTAACTGTTGC-3′). Ambas PCR se realizaron en las mismas condiciones descritas anteriormente, con la excepción de la temperatura de recocido, que fue de 60°C. Los amplicones se analizaron como se ha descrito. El ADN extraído de las líneas celulares cervicales humanas CaSki (CRL-1550) y SiHa (HTB-35) se utilizó como control positivo. La ausencia del producto de la PCR se interpretó como una alteración de la secuencia de E2 y la integración del ADN viral en el genoma del huésped. La presencia de amplicones E2 indica la presencia de genomas episomales del VPH-16.

2.6. Análisis estadístico

Las características sociodemográficas, clínicas y de estilo de vida de los casos y los controles se describieron utilizando distribuciones de frecuencia para las variables categóricas y medidas de resumen para las variables cuantitativas. Se utilizaron pruebas de dos caras para comparar los grupos de estudio: se utilizó la prueba de chi-cuadrado o la prueba exacta de Fisher para las variables categóricas y la prueba de Student o la prueba de Mann-Whitney para comparar las variables cuantitativas. Se utilizaron modelos de regresión logística incondicional para estimar la OR con un 95% de confianza del CCR en relación con el estado del VPH y otras variables. Los análisis estadísticos se realizaron con SPSS 17.0 (SPSS Inc.) y Epi InfoTM 7 (CDC).

3. Resultados

3.1. Características sociodemográficas, de estilo de vida e historial clínico de los participantes en el estudio

Las características demográficas y clínicas de la población del estudio (; 45 casos de CCR y 36 controles) se presentan en la Tabla 1. La edad media de los casos de CCR era de 61,1 años (entre 38 y 86 años; 24 eran varones). En el grupo de control, la edad media era de 60,9 años (entre 42 y 85 años; 15 eran varones). En comparación con los controles, los casos de CCR eran más propensos a informar de una historia familiar de CCR (OR 0,29; 95% 0,10-0,80). En cuanto a las edades de los familiares con CCR indicadas por el sujeto, la mediana de edad del diagnóstico de CCR en los familiares de los casos y los controles fue de 60 años. No se encontraron asociaciones estadísticamente significativas al comparar casos y controles con familiares diagnosticados de CCR a ≥60 años frente a <60 años. No se encontraron otras asociaciones significativas.

3.2. Detección del ADN del VPH

Se observó una diferencia significativa en la prevalencia de la infección por el VPH al comparar los tejidos de los tumores colorrectales y la mucosa normal de los controles. Se detectó ADN del VPH en 19 de las 45 (42,2%) muestras de CCR y en 1 de las 36 (2,8%) muestras de control estudiadas (Figura 1). La infección por VPH se asoció positivamente con el CCR (OR 25,58; IC 95%: 3,22 a 203,49), (Tabla 2). La asociación entre la positividad al VPH y el CCR se observó en todas las regiones anatómicas del colon.

3.3. Características sociodemográficas, de estilo de vida y clinicopatológicas de los casos positivos al VPH

La edad media de los casos de CCR positivos al VPH era de 60,3 años (con un rango de 45 a 86; 9 eran varones). No se encontraron asociaciones significativas entre el estado positivo al VPH y lo siguiente: sexo, edad, consumo de tabaco o alcohol, antecedentes de diabetes, antecedentes familiares de cualquier cáncer o antecedentes familiares de CCR (Tabla 3). No se observaron asociaciones significativas entre el estado del VPH y la diferenciación histológica, el estadio del tumor o la localización (Tabla 4).