În general, trei caracteristici primare ale compușilor chimici pot fi folosite pentru a crea separări HPLC. Acestea sunt:
– Polaritatea
– Sarcina electrică
– Dimensiunea moleculară
În primul rând, să luăm în considerare polaritatea și cele două moduri primare de separare care exploatează această caracteristică: cromatografia în fază normală și cromatografia în fază inversă.
Separări bazate pe polaritate
Structura, activitatea și caracteristicile fizico-chimice ale unei molecule sunt determinate de aranjamentul atomilor săi constituenți și de legăturile dintre ei. În cadrul unei molecule, un aranjament specific al anumitor atomi care este responsabil pentru proprietăți speciale și reacții chimice previzibile se numește grup funcțional. Această structură determină adesea dacă molecula este polară sau nepolară. Moleculele organice sunt clasificate în clase în funcție de grupul (grupurile) funcțional(e) principal(e) pe care îl (le) conține fiecare. Utilizând un mod de separare bazat pe polaritate, retenția cromatografică relativă a diferitelor tipuri de molecule este determinată în mare măsură de natura și localizarea acestor grupe funcționale. După cum se arată în figura P, clasele de molecule pot fi ordonate în funcție de retenția lor relativă într-un interval sau spectru de polaritate cromatografică de la foarte polar la foarte nepolar.
Figura P: Spectrul polarității cromatografice în funcție de grupa funcțională a analitului
Apa este un compus polar. Benzenul este un compus nepolar. Moleculele cu polaritate cromatografică similară au tendința de a fi atrase una de cealaltă; cele cu polaritate diferită prezintă o atracție mult mai slabă, dacă există, și pot chiar să se respingă reciproc. Acest lucru devine baza modurilor de separare cromatografică bazate pe polaritate.
O altă modalitate de a ne gândi la acest lucru este prin analogia familiară: uleiul și apa nu se amestecă. Spre deosebire de magnetism, unde polii opuși se atrag reciproc, separările cromatografice bazate pe polaritate depind de atracția mai puternică dintre cei asemănători și de atracția mai slabă dintre cei opuși. Țineți minte, „Asemănător atrage asemănător” în cromatografia bazată pe polaritate.
Figura Q: Combinația adecvată a fazelor mobile și staționare afectează separarea bazată pe polaritate
Pentru a proiecta un sistem de separare cromatografică , creăm o competiție pentru diverși compuși conținuți în probă prin alegerea unei faze mobile și a unei faze staționare cu polarități diferite. Apoi, compușii din probă care au o polaritate similară cu cea a fazei staționare vor fi întârziați, deoarece sunt mai puternic atrași de particule. Compușii a căror polaritate este similară cu cea a fazei mobile vor fi atrași preferențial de aceasta și se vor deplasa mai repede.
În acest fel, pe baza diferențelor în atracția relativă a fiecărui compus pentru fiecare fază, se creează o separare prin modificarea vitezelor analiților.
Figurile R-1, R-2 și R-3 prezintă intervale tipice de polaritate cromatografică pentru fazele mobile, fazele staționare și, respectiv, analiții din probă. Să le luăm în considerare pe fiecare în parte pentru a vedea cum un cromatograf alege fazele adecvate pentru a dezvolta competiția de atracție necesară pentru a realiza o separare HPLC bazată pe polaritate.
Figura R-1: Spectrul polarității cromatografice a fazelor mobile
O scală, cum ar fi cea prezentată în figura R-1, pe care unii solvenți obișnuiți sunt plasați în ordinea polarității cromatografice relative se numește serie eluotropică. Moleculele de fază mobilă care concurează eficient cu moleculele de analit pentru situsurile atractive ale fazei staționare deplasează acești analiți, determinându-i să se deplaseze mai repede prin coloană . Apa se află la capătul polar al scalei fază mobilă-solvent, în timp ce hexanul, o hidrocarbură alifatică, se află la capătul nepolar. Între acestea, solvenții individuali, precum și amestecurile de solvenți miscibili , pot fi plasați în ordinea puterii de eluție. Care capăt al scalei reprezintă faza mobilă „cea mai puternică” depinde de natura suprafeței fazei staționare unde are loc competiția pentru moleculele de analit.
Figura R-2: Spectrul polarității cromatografice a particulelor în fază staționară
Silica are o suprafață activă, hidrofilă, care conține grupe funcționale silanolice acide. În consecință, se încadrează la capătul polar al scalei de fază staționară prezentată în figura R-2. Activitatea sau polaritatea suprafeței de silice poate fi modificată în mod selectiv prin legarea chimică la aceasta a unor grupe funcționale mai puțin polare . Exemplele prezentate aici includ, în ordinea descrescătoare a polarității, grupe de cianopropil-sililil- , n-octil-sililil- și n-octadecil-sililil- pe silice. Aceasta din urmă este o împachetare hidrofobă , foarte nepolară.
Figura R-3: Spectrul de polaritate cromatografică a compusului/analitului
Figura R-3 repetă spectrul de polaritate cromatografică al probei noastre . După ce a luat în considerare polaritatea ambelor faze, atunci, pentru o anumită fază staționară, un cromatograf trebuie să aleagă o fază mobilă în care analiții de interes sunt reținuți, dar nu atât de puternic încât să nu poată fi eluți. Dintre solvenții cu putere similară, cromatograful ia în considerare ce combinație de faze poate exploata cel mai bine diferențele mai subtile de polaritate și solubilitate a analitului pentru a maximiza selectivitatea sistemului cromatografic. Asemănarea se atrage cu asemănarea, dar, după cum probabil vă puteți imagina din discuția de până acum, crearea unei separări bazate pe polaritate implică cunoașterea probei și experiența cu diferite tipuri de analiți și moduri de retenție. Pentru a rezuma, cromatograful va alege cea mai bună combinație între o fază mobilă și o fază staționară de particule cu polarități opuse în mod corespunzător. Apoi, pe măsură ce analiții din probă se deplasează prin coloană, regula asemănător atrage asemănător va determina care analiți încetinesc și care avansează cu o viteză mai mare.
HPLC cu fază normală
În separările sale de extracte de plante, Tswett a avut succes folosind o fază staționară polară cu o fază mobilă mult mai puțin polară. Acest mod clasic de cromatografie a devenit cunoscut sub numele de fază normală.
Figura S-1: Cromatografie în fază normală
Figura S-1 reprezintă o separare cromatografică în fază normală a amestecului nostru de testare cu trei coloranți. Faza staționară este polară și reține cel mai puternic colorantul galben polar. Colorantul albastru relativ nepolar este câștigat în competiția de retenție de către faza mobilă, un solvent nepolar, și se eluează rapid. Deoarece colorantul albastru se aseamănă cel mai mult cu faza mobilă , acesta se deplasează mai repede. Este tipic pentru cromatografia în fază normală pe silice ca faza mobilă să fie 100% organică; nu se folosește apă.
HPLC în fază inversă
Termenul de fază inversă descrie modul de cromatografie care este exact opusul fazei normale, și anume utilizarea unei faze mobile polare și a unei faze staționare nepolare. Figura S-2 ilustrează amestecul negru de trei coloranți care este separat folosind un astfel de protocol.
Figura S-2: Cromatografie în fază inversă
Acum, compusul cel mai puternic reținut este colorantul albastru mai nepolar, deoarece atracția sa față de faza staționară nepolară este cea mai mare. Colorantul galben polar, fiind slab reținut, este câștigat în competiție de faza mobilă apoasă, polară, se deplasează cel mai rapid prin pat și se eluează cel mai devreme, deoarece asemănător se atrage asemănător.
Astăzi, deoarece este mai reproductibilă și are o aplicabilitate largă, cromatografia în fază inversă este utilizată pentru aproximativ 75% din toate metodele HPLC. Cele mai multe dintre aceste protocoale utilizează ca fază mobilă un amestec apos de apă cu un solvent organic polar, miscibil, cum ar fi acetonitrilul sau metanolul. Acest lucru asigură, de obicei, interacțiunea adecvată a analiților cu suprafața nepolară, hidrofobă a particulelor. O silice cu legătură C18 este cel mai popular tip de împachetare HPLC cu fază inversă.
Tabelul C prezintă un rezumat al caracteristicilor fazei pentru cele două moduri principale de separare HPLC pe baza polarității. Rețineți, pentru aceste moduri bazate pe polaritate, asemănătorul se atrage cu asemănătorul.
Tabelul C: Caracteristicile fazelor pentru separările bazate pe polaritate
Cromatografia de interacțiune hidrofilă
HILIC poate fi privită ca o variantă a cromatografiei în fază normală. În cromatografia în fază normală, faza mobilă este 100% organică. Doar urme de apă sunt prezente în faza mobilă și în porii particulelor polare de împachetare. Analiții polari se leagă puternic de faza staționară polară și este posibil să nu se elueze.
Adăugarea unei cantități de apă în faza mobilă organică face posibilă separarea și eluția compușilor polari care sunt puternic reținuți în modul cu fază normală . Apa, un solvent foarte polar, concurează eficient cu analiții polari pentru faza staționară. HILIC poate fi rulat fie în modul de eluție izocratică, fie în modul de eluție în gradient. Compușii polari care sunt inițial atrași de particulele de material de împachetare polar pot fi eluate pe măsură ce polaritatea fazei mobile crește . Analiții sunt eluzionați în ordinea creșterii hidrofilicității . În faza mobilă pot fi adăugați tamponi sau săruri pentru a menține analiții ionizabili într-o singură formă.
Cromatografia cu interacțiune hidrofobă
HIC este un tip de cromatografie cu fază inversă care este utilizată pentru a separa biomoleculele mari, cum ar fi proteinele. De obicei, este de dorit să se mențină aceste molecule intacte într-o soluție apoasă, evitându-se contactul cu solvenți organici sau suprafețe care le-ar putea denatura. HIC profită de interacțiunea hidrofobă a moleculelor mari cu o fază staționară moderat hidrofobă, de exemplu, silice cu legături de butil, mai degrabă decât cu legături de octadecil. Inițial, concentrațiile mai mari de săruri în apă vor favoriza reținerea proteinelor pe împachetare. Separările în gradient se execută de obicei prin scăderea concentrației de sare. În acest fel, biomoleculele sunt eluate în ordinea creșterii hidrofobicității.
Separații bazate pe sarcină: Cromatografia cu schimb de ioni
Pentru separările bazate pe polaritate, cei asemănători sunt atrași de cei asemănători, iar cei opuși pot fi respinși. În cromatografia de schimb de ioni și în alte separări bazate pe sarcină electrică, regula este inversă. Cei asemănători se pot respinge, în timp ce cei opuși sunt atrași unul de celălalt. Fazele staționare pentru separările prin schimb de ioni se caracterizează prin natura și puterea funcțiilor acide sau bazice de pe suprafețele lor și prin tipurile de ioni pe care le atrag și le rețin. Schimbul de cationi este utilizat pentru a reține și a separa ionii încărcați pozitiv pe o suprafață negativă. În schimb, schimbul de anioni este utilizat pentru a reține și separa ionii încărcați negativ pe o suprafață pozitivă. Cu fiecare tip de schimb de ioni, există cel puțin două abordări generale pentru separare și eluție.
Figura T: Cromatografia cu schimb de ioni
Schimbătorii de ioni puternici poartă grupe funcționale care sunt întotdeauna ionizate. Ei sunt utilizați în mod obișnuit pentru a reține și separa ionii slabi. Acești ioni slabi pot fi eluți prin deplasare cu o fază mobilă care conține ioni care sunt mai puternic atrași de situsurile fazei staționare. Alternativ, ionii slabi pot fi reținuți pe coloană, apoi neutralizați prin modificarea in situ a pH-ului fazei mobile, ceea ce face ca aceștia să-și piardă atracția și să fie eluați.
Schimbătorii de ioni slabi pot fi neutralizați peste sau sub o anumită valoare a pH-ului și își pierd capacitatea de a reține ioni prin sarcină. Când sunt încărcați, sunt utilizați pentru a reține și separa ionii puternici. Dacă acești ioni nu pot fi eluți prin deplasare, atunci situsurile de schimb din faza staționară pot fi neutralizate, oprind atracția ionică și permițând eluția analiților încărcați.
Tabel D: Orientări privind schimbul de ioni
Când schimbătorii de ioni slabi sunt neutralizați, ei pot reține și separa speciile prin interacțiuni hidrofobe sau hidrofile; în aceste cazuri, puterea de eluție este determinată de polaritatea fazei mobile . Astfel, schimbătorii de ioni slabi pot fi utilizați pentru separări cu mod mixt .
Tabelul D prezintă liniile directoare pentru principalele categorii de schimb de ioni. De exemplu, pentru a reține un analit puternic bazic , folosiți o particulă de fază staționară schimbătoare de cationi slabi la pH > 7; aceasta asigură o suprafață a particulei încărcată negativ. Pentru a elibera sau elua baza puternică, reduceți pH-ul fazei mobile sub 3; acest lucru elimină sarcina de suprafață și oprește mecanismul de retenție prin schimb ionic.
Rețineți că un pKa este valoarea pH-ului la care 50% din grupul funcțional este ionizat și 50% este neutru. Pentru a asigura o suprafață a analitului sau a particulei esențial neutră sau complet încărcată, pH-ul trebuie ajustat la o valoare cu cel puțin 2 unități peste pKa, după caz.
Nu folosiți un schimbător de cationi puternici pentru a reține o bază puternică; ambele rămân încărcate și puternic atrase una de cealaltă, făcând aproape imposibilă eluția bazei. Aceasta poate fi eliminată numai prin inundarea schimbătorului de cationi puternici cu o bază concurentă care prezintă o retenție și mai puternică și care deplasează compusul de interes prin câștigarea competiției pentru situsurile de schimb active. Această abordare este rareori practică sau sigură în HPLC și SPE.
Separări bazate pe mărime: Cromatografia de excludere a mărimii –
În anii 1950, Porath și Flodin au descoperit că biomoleculele pot fi separate pe baza mărimii lor, mai degrabă decât pe baza încărcăturii sau polarității lor, trecându-le, sau filtrându-le, printr-un polimer dextran hidrofil cu porozitate controlată. Acest proces a fost denumit filtrare pe gel. Ulterior, o schemă analogă a fost utilizată pentru a separa oligomerii și polimerii sintetici folosind împachetări de polimeri organici cu dimensiuni specifice ale porilor. Acest proces a fost numit cromatografie cu permeabilitate în gel. Separări similare realizate cu ajutorul unor garnituri de silice cu porozitate controlată au fost denumite cromatografie de excludere a dimensiunilor . Introduse în 1963, primele instrumente HPLC comerciale au fost concepute pentru aplicații GPC.
Toate aceste tehnici se realizează de obicei pe faze staționare care au fost sintetizate cu o distribuție a mărimii porilor într-un interval care permite analiților de interes să intre sau să fie excluși din mai mult sau mai puțin din volumul de pori al umpluturii. Moleculele mai mici pătrund în mai mulți pori la trecerea lor prin pat. Moleculele mai mari pot pătrunde doar în porii care depășesc o anumită dimensiune, astfel încât să petreacă mai puțin timp în pat. Cele mai mari molecule pot fi excluse în totalitate din pori și să treacă doar între particule, eluzionând foarte repede într-un volum mic. Fazele mobile sunt alese din două motive: în primul rând, sunt solvenți buni pentru analiți; și, în al doilea rând, pot preveni orice interacțiune între analiți și suprafața fazei staționare. În acest fel, moleculele mai mari se eluează primele, în timp ce moleculele mai mici se deplasează mai lent și se eluează mai târziu, în ordinea descrescătoare a mărimii lor în soluție. De aici și regula simplă: cele mari ies primele.
Din moment ce este posibilă corelarea greutății moleculare a unui polimer cu dimensiunea sa în soluție, GPC a revoluționat măsurarea distribuției greutății moleculare a polimerilor care, la rândul ei, determină caracteristicile fizice care pot îmbunătăți sau diminua prelucrarea, calitatea și performanța polimerilor.