Synteza DNA z substratów difosforanowych przez polimerazy DNA

Wyniki i dyskusja

Zaczęliśmy od testowania polimeraz Taq (z Thermus aquaticus), Vent o wysokiej wierności (exo-, z Thermococcus litoralis), Pfu (exo+, z Pyrococcus furiosus), Deep Vent (exo+, z Pyrococcus sp. GB-D) i Q5 (exo+) polimeraz DNA w tradycyjnych reakcjach łańcuchowej polimerazy (PCR) z monofosforanem deoksyrybonukleozydów (dGMP), dNDPs i dNTPs jako substratami (Rys. 1 A i B). Zastąpienie któregokolwiek z dNTPs przez dNDPs wspierało silną syntezę DNA, a dalsze eksperymenty z dwoma, trzema lub wszystkimi czterema dNDPs zamiast dNTPs wspierały PCR. Aby upewnić się, że produkty nie powstały w wyniku zanieczyszczenia dNTPs i że reakcje nie zostały wzmocnione przez stabilizatory obecne w komercyjnych buforach lub enzymach, przetestowaliśmy syntezę DNA z oczyszczonych dNDPs przy użyciu buforów i enzymów domowej roboty. Uwzględniliśmy również bakteryjne enzymy replikacyjne, takie jak bakteryjne replikacyjne polimerazy DNA z termofilnego Bacillus stearothermophilus (Bst) i mezofilnego Bacillus subtilis (Bsu, duży fragment). Te, wraz z archeologicznymi polimerazami z Thermococcus kodakensis (KOD), Thermococcus sp. 9°N (9°N) i Thermococcus gorganarius (Tgo), wykazywały silne przedłużanie primerów przy użyciu zaledwie 100 µM oczyszczonych dNDPs w temperaturze 60 °C (z wyjątkiem Bsu, która we wszystkich przypadkach była testowana w temperaturze 37 °C) (Rys. 1C). Reakcje przedłużania primerów były wydajne dla wszystkich tych enzymów, szczególnie dla Deep Vent, KOD i 9°N. Przed wbudowaniem dA i dC do powstającego oligonukleotydu zaobserwowano pauzę (Rys. 1 C i D), co sugeruje, że KM dla dADP i dCDP są wystarczająco wysokie, aby spowolnić przedłużanie primera przy stężeniu substratu 100-µM.

Aby uzyskać mechanistyczny wgląd w reakcję, najpierw zbadaliśmy jej wydajność przy użyciu enzymu Taq. Zmiana temperatury przedłużania z 50 °C do 72 °C nie spowodowała żadnej obserwowalnej różnicy w ilości produktu o pełnej długości. Aby uprościć analizy kinetyczne, wszystkie reakcje PCR przeprowadzono przy użyciu dwuetapowego protokołu cyklicznego w temperaturze, w którym primer był annealowany i przedłużany w pierwszym kroku w 72 °C, a dupleks topił się w 95 °C w drugim kroku (Figura S1A). Aby porównać szybkość utylizacji dNDP z kanonicznymi dNTPs, czas wydłużania zmieniano od 15 do 120 s. Dla czasu wydłużania 15 s, reakcja z dNTP wytworzyła około cztery razy więcej produktu w porównaniu z reakcją o czasie wydłużenia 2 min, która zawierała dNDPs (Fig. S1B). Dane te sugerują, że szybkość inkorporacji difosforanów jest wolniejsza niż tradycyjnych trifosforanów, jak można by się spodziewać, biorąc pod uwagę niższą energię stanu podstawowego dNDPs. Następnie zadaliśmy sobie pytanie, czy za wolniejszą szybkość inkorporacji odpowiada pojedynczy czy wszystkie cztery dNDP. Do dokładnego pomiaru tworzenia produktu użyto ilościowego PCR (qPCR). Każdy difosforan był badany niezależnie przez połączenie go z 0,2 mM pozostałych trzech dNTP w celu amplifikacji długiego szablonu DNA. Reakcje te były normalizowane do reakcji kontrolnej, która zawierała 0,2 mM wszystkich czterech dNTP (Rys. S1C). Wartość 1 wskazuje, że difosforan jest włączany równie wydajnie jak jego analog trifosforanowy. Wyniki te sugerują, że dADP jest włączany najmniej wydajnie (1 mM dADP dawał ∼60% z 0,2 mM dATP), a następnie difosforan deoksytymidyny (dTDP) i difosforan deoksycytydyny (dCDP). Z drugiej strony, tylko dwukrotny wzrost stężenia dGDP jest konieczny do osiągnięcia takiej samej wydajności PCR jak w przypadku reakcji kontrolnej z dGTP.

Aby bezpośrednio przeanalizować polimeryzację DNA, przeprowadziliśmy reakcję przedłużania primera znakowanego 32P i długiego (706 nt) szablonu. Stężenie difosforanu było zróżnicowane od 0,1 do 1,0 mM i połączone z 0,2 mM pozostałych trzech dNTP, podobnie jak w reakcjach qPCR opisanych powyżej. Zgodnie z oczekiwaniami, zwiększanie stężenia dADP zmniejszało czas potrzebny do wytworzenia produktu o pełnej długości (Rys. 1E). Zatrzymanie na długości szablonowego DNA zaobserwowano wyłącznie w przypadku dADP, co sugeruje, że polimeraza ulega zatrzymaniu podczas wbudowywania substratów dADP (Rys. 1E). Z drugiej strony, brak przerwy w reakcji z dTDP sugeruje, że dTDP jest bardziej wydajnie wykorzystywany niż dADP (Fig. S2A), jak sugeruje analiza qPCR (Fig. S1A). Analiza tworzenia produktu sugeruje, że stężenie dADP wymagane do osiągnięcia półmaksymalnej szybkości wynosi ∼420 µM (Rys. S2B), ponad rząd wielkości powyżej KM dla dNTPs zmierzonych wcześniej (16 i 24 µM) (5, 6). W pobliżu nasyconego stężenia dADP, synteza pełnej długości DNA trwa około 30 s, a biorąc pod uwagę, że sekwencja 706-nt zawiera 182 adenozyny, średnia szybkość wykorzystania dADP wynosi co najmniej ∼6 s-1. Jest to o rząd wielkości wolniejsze niż średnia szybkość wykorzystania dNTPs przez polimerazę Taq (kcat = 47 s-1) i jest w granicach 1,5-krotności kcat Pfu (7).

Aby dalej porównać kinetykę syntezy DNA na długich szablonach z dNDPs i dNTPs, użyliśmy jednoniciowego DNA (ssDNA) szablonu plazmidu M13mp18 o długości 7,249 nt (8). Polimerazy Bsu (w 37 °C), Bst i Taq (w 60 °C) wykazały silną syntezę DNA z dNDPs (Rys. S2C). Zmierzyliśmy szybkość syntezy DNA za pomocą fluorescencji interkalatora SYTO9, obserwowanej przez termocykler w czasie rzeczywistym przy różnych stężeniach dNDP i dNTP (Fig. S2D) (9). Wykres tych szybkości w stosunku do stężenia nukleotydów ujawnił pozorną KM ∼0,4 mM dla dNDPs i maksymalną szybkość syntezy, która jest około 17 razy niższa dla dNDPs niż dla dNTPs (Rys. S2E). Wyniki te wskazują, w bezpośrednim porównaniu w identycznych warunkach, że szybkość syntezy DNA z dNDPs jest nieco ponad rząd wielkości niższa niż z dNTPs i że Vmax/KM jest zatem około 400 razy niższa dla dNDPs niż dla dNTPs.

Reakcja polimeryzacji z kanonicznymi substratami trifosforanowymi zwiększa długość powstającej nici DNA o jeden nukleotyd, uwalniając PPi (3). Podczas reakcji odwrotnej, pirofosforylacji, primer jest skracany o jeden nukleotyd i uwalniany jest dNTP. Analogicznie, gdy jako substraty wykorzystywane są dNDP, polimerazy uwalniają fosforany, a reakcją odwrotną jest fosfoliza DNA (Rys. 2A). Aby potwierdzić, że polimerazy wykorzystują dNDP bezpośrednio, a nie korzystają z nieznanej dotąd aktywności enzymatycznej (lub kopuryfikowanej kinazy difosforanów nukleotydów), która przekształca dwa dNDP w dNTP i dNMP, użyliśmy oczyszczonych dNDP i przeanalizowaliśmy produkty reakcji przedłużania primerów. Produkcję fosforanów mierzyliśmy przy użyciu czujnika fluorescencyjnego, który pochodzi od bakteryjnego białka wiążącego fosforany i wykazuje wysoką specyficzność dla fosforanów (10). Stwierdziliśmy, że w obecności oczyszczonych dNDPs i polimerazy Taq DNA fosforan gromadzi się (Rys. 2B), ale w eksperymentach bez polimerazy nie. W kontrolnych eksperymentach z dNTPs obserwowano wytwarzanie fosforanu, ale jego tempo było wolniejsze i niezależne od enzymu, co sugeruje, że wykryty fosforan wynikał z degradacji dNTP do dNDP i fosforanu i nie był związany z syntezą DNA. Wyniki te potwierdziły, że Taq bezpośrednio wykorzystuje dNDP jako substraty, uwalniając fosforan jako produkt uboczny syntezy DNA. Kiedy zmierzyliśmy ilość fosforanu wytwarzanego w przedłużaniu primerów na opisanym powyżej 7,249-nt M13 ssDNA, stwierdziliśmy, że ∼1-11 µM fosforanu zostało wytworzone przy użyciu 1,6-nM szablonu ponad produkcję fosforanu tła z degradacji dNDP (Rys. S3A). To stężenie fosforanu odpowiada ∼2-6,000 cząsteczek na DNA, czyli około 0,1-0,9 wzorca skopiowanego przy użyciu dNDP. Szeroki zakres wynika ze stosunkowo dużego tła fosforanowego w materiale wyjściowym i reakcji tła odejmowanego od sygnału w reakcji wydłużania primera.

Aby sprawdzić, czy reakcje nie wytwarzają dNTPs z dNDPs, inkubowaliśmy polimerazę Taq z 250 µM dCDP i dTDP i rozdzielaliśmy reakcje za pomocą chromatografii jonowymiennej (Rys. S3B). Analiza ta nie ujawniła żadnych nowych gatunków molekularnych odpowiadających mono- lub trifosforylowanym nukleotydom w reakcji zawierającej enzym, w porównaniu z reakcją bez enzymu, wskazując na brak aktywności fosforylotransferazy w preparacie enzymatycznym i dodatkowo wspierając bezpośrednie wykorzystanie dNDP w syntezie DNA.

Jak opisano powyżej, reakcje z substratami dNDP uwalniają nieorganiczny fosforan (Pi), a reakcja odwrotna jest zatem fosforyzacją DNA (Fig. 2A). Aby sprawdzić wydajność tej odwrotnej reakcji, zbadaliśmy fosfolizę 5′ 32P-wyznakowanego primera zanegowanego do nici szablonowej, inkubując go z enzymem i 10 mM Pi. Rys. 2C przedstawia usuwanie terminalnego 3′ nukleotydu z nici primera przez polimerazę Taq DNA w obecności Pi i PPi, wykazując, że polimeraza Taq DNA może ulegać odwrotnej reakcji polimeryzacji DNA zarówno z dNTPs, jak i dNDPs. Analiza termofilnej polimerazy Bst, Deep Vent, KOD (Rys. S4A), 9°N, Tgo oraz mezofilnej polimerazy Bsu również wykazała fosfolizę DNA (Rys. S4B), choć w mniejszym stopniu. Zbadano również reakcję kontrolną z fragmentem Klenowa polimerazy DNA Escherichia coli I, która nie akceptuje dNDP jako substratów (Rys. S4C) i wykazano, że obecność PPi, ale nie Pi, powoduje skrócenie primera.

Aby dokładniej przeanalizować reakcję odwrotną, przygotowaliśmy dsDNA znakowane wewnętrznie 32P-fosforanem, wykonując reakcję przedłużania primera przy użyciu α-32P-dATP, a następnie oczyszczanie PAGE. Produkty reakcji odwrotnej analizowaliśmy za pomocą anionowymiennej (polietylenoiminowej) TLC. Zgodnie z oczekiwaniami, inkubacja wewnętrznie znakowanego DNA z polimerazą Taq i pirofosforanem dała produkty, które połączyły się z dATP. Reakcje w obecności fosforanu wytworzyły szybciej migrujące gatunki, odpowiadające dADP, a reakcje bez fosforanu lub pirofosforanu nie wytworzyły żadnych migrujących gatunków, wskazując, że w obecności samej polimerazy Taq DNA pozostało nienaruszone (Rys. 2D) i potwierdzając, że reakcją odwrotną jest fosfoliza DNA.

Wreszcie, analiza zależnej od substratu kinetyki reakcji odwrotnej ujawniła KM wynoszącą ∼10 ± 5 mM (n = 9) i 57 ± 5 µM (n = 5) odpowiednio dla fosforanu i pirofosforanu, chociaż niska rozpuszczalność fosforanu magnezu powyżej 10 mM uniemożliwiła nam uzyskanie precyzyjnych pomiarów (Rys. 2E). Struktury krystaliczne polimeraz DNA z pirofosforanem lub kwasem fosfonoformowym w miejscach aktywnych wykazują oddziaływanie kulombowskie z białkiem (11⇓-13). 200-krotny stosunek KM obu substratów odpowiada ∼15 kJ/mol (3,6 kcal/mol) w 72 °C, energii wiązania w przybliżeniu równej oddziaływaniu jonowemu pomiędzy dodatkowym fosforanem a kompensującym kationem na białku i wspierającej model, w którym fosforan/pirofosforan jest rozpoznawany głównie poprzez oddziaływanie ładunek-ładunek. Oszacowania maksymalnych szybkości reakcji odwrotnej wykazywały podobną tendencję: w tych warunkach Vmax wynosiła 0,0010 ± 0,0005 s-1 i 0,205 ± 0,005 s-1, odpowiednio dla fosforanu i pirofosforanu, ujawniając ponownie około 200-krotny stosunek pomiędzy tymi dwoma aktywnościami. W sumie, poniżej stężenia nasycającego obu substratów, reakcja fosforanowa jest około 4 × 104 razy mniej wydajna, co sugeruje, że fosfoliza DNA nie stanowi znaczącego zagrożenia dla stabilności genomu.

Aby uzyskać dalszy wgląd w syntezę DNA z niskoenergetycznych substratów (dNDPs i Pi), zmierzyliśmy energie aktywacji używając analizy Arrheniusa dla reakcji w przód i w tył. Ponieważ pomiary jednocząsteczkowe zmian konformacyjnych związanych z rozpoznawaniem i przyłączaniem właściwych dNTPs ujawniły szybszy ruch białka niż obserwowana kinetyka reakcji (14), etap ograniczający szybkość reakcji forward w polimerazie Taq jest prawdopodobnie związany z etapem chemicznym lub prekatalityczną rearanżacją miejsca aktywnego, która zależy od interakcji z fosforanami substratów. Zaobserwowaliśmy, że Vmax zarówno reakcji forward, jak i reverse jest niższe dla dNDP i fosforanu niż dla dNTP i pirofosforanu, co sugeruje, że etap ograniczający szybkość reakcji jest wrażliwy na stan fosforylacji substratów. Jednakże zarówno na rearanżację przedkatalityczną (taką jak wyrównanie reszt w miejscu aktywnym i związanie katalitycznego jonu Mg2+), jak i na etap chemii może wpływać fosforylacja substratu; dlatego też każdy z tych etapów może być ograniczający w obecności dNDP, zakładając, że nie wprowadzają one do mechanizmu nowego powolnego etapu konformacyjnego. W Pol β zaproponowano wcześniej, że te dwa etapy mają podobne stałe szybkości (15), a obliczone energie aktywacji dla reakcji forward i reverse wykorzystujących wysokoenergetyczne substraty (dNTPs i pirofosforan) różnią się zaledwie o 15 kJ/mol (4). W przypadku termofilnych enzymów Taq i Klentaq1, energia aktywacji reakcji forward różni się znacznie, od 90 do 125 kJ/mol, w zależności od warunków eksperymentalnych i prawdopodobnie tożsamości reagujących nukleotydów (8, 16), podczas gdy energia aktywacji pirofosfolizy nie została, według naszej wiedzy, wyznaczona doświadczalnie.

Przeanalizowaliśmy szybkość wbudowywania pojedynczych nukleotydów z 50 µM dCDP, dADP i dTDP, ułożonych odpowiednio na dA, dC i dA, podczas reakcji wydłużania primera. Analiza Arrheniusa wykazała liniową zależność ln(kobs) od 1/T dla eksperymentów w temperaturze poniżej 60 °C, ujawniając energie aktywacji wynoszące 85 ± 14, 108 ± 11 i 112 ± 15 kJ/mol dla trzech nukleotydów (Rys. 3 A i B; n = 6 dla każdego nukleotydu). Analiza Arrheniusa reakcji odwrotnej z 0,4 mM fosforanu, dającej cząsteczkę dADP, ujawniła dużą energię aktywacji wynoszącą 138 ± 10 kJ/mol (n = 5), zgodną z obserwowaną powolną szybkością fosforylacji DNA przez Taq (Rys. 3 A i B) i stanowiącą znaczny wzrost w stosunku do obliczonej energii aktywacji pirofosforylacji (92 kJ/mol w Pol β) (4). Energia aktywacji reakcji forward i reverse dla dADP różni się zatem o ∼ 30 kJ/mol, zapewniając silną tendencję do syntezy DNA. Skłonność do reakcji forward skutkuje mniejszym zapotrzebowaniem na sekwestrację produktu fosforanowego przez szlak metaboliczny downstream, w przeciwieństwie do syntezy DNA opartej na dNTP i hydrolizie pirofosforanu przez nieorganiczne pirofosfatazy. Ponadto, jeśli na przedkatalityczne zmiany konformacyjne w polimerazie Taq nie mają wpływu niskoenergetyczne substraty, a etap chemii jest ograniczający, wykorzystanie dNDPs i fosforanów może przynieść nowy eksperymentalny wgląd w enzymatyczną katalizę syntezy DNA.

Nasze badania wykazują, że Taq i kilka innych enzymów z obu rodzin A i B polimeraz DNA, w tym enzymy replikacyjne zarówno termofilnych, jak i mezofilnych bakterii, mogą zastąpić kanoniczne substraty trifosforanowe analogami difosforanowymi. Wczesne dowody na zbędność γ-fosforanu w substracie nukleotydowym pochodzą z badań nad odwrotną transkryptazą HIV-1 i polimerazą DNA gp43 bakteriofaga RB69. Warianty RT HIV-1, które znoszą elektrostatyczne oddziaływanie pomiędzy γ-fosforanem przychodzącego dNTP a polimerazą, skutkowały zachowaniem aktywności, chociaż w znacznie wolniejszym tempie (17⇓-19), a bakteriofag RB69 polimeraza DNA gp43 wykazywała podobną aktywność (20). Oba te wirusowe enzymy akceptują dNDP jako substraty, ale z KM (lub KD), które są 500 i 17 razy wyższe i stałymi szybkości, które są 100 i 400 razy niższe niż dla dNTPs przez HIV-1 RT i RB69 gp43, odpowiednio (20, 21). Nasze badania wykazują, że komórkowe polimerazy replikacyjne posiadają tę aktywność, opisują powinowactwa do substratów i energie aktywacji zarówno dla reakcji forward, jak i reverse, oraz sugerują, że synteza DNA z dNDPs jest dość wydajna, szczególnie dla enzymów termostabilnych.

Nasze wyniki sugerują, że replikacja DNA może być realizowana przy użyciu dNDPs jako substratów. W termofilach replikacja genomu może być mniej wrażliwa na ładunek energetyczny komórki niż w mezofilach, ponieważ termostabilne polimerazy mogą akceptować zarówno difosforylowane, jak i trifosforylowane substraty. Replikacja DNA jest więc mniej zależna od wewnątrzkomórkowego stosunku ATP/ADP, a stosunkowo wysoka wydajność syntezy DNA w podwyższonej temperaturze sugeruje, że termofile mogą być w stanie całkowicie zrezygnować z trifosforylowanych substratów. Ponadto, dowody paleobiologiczne sugerują, że ostatni wspólny przodek naszej biosfery był termofilem (22⇓-24), a nasze badania sugerują, że niefosforylowane substraty mogły być wystarczające do replikacji genomu wczesnych organizmów, łagodząc potrzebę metabolizmu wysokoenergetycznych trifosforylowanych intermediatów metabolicznych. W takim przypadku difosforany mogłyby być uważane za intermediaty w ewolucji wysokoenergetycznych metabolitów i mogą zawierać ancestralne bloki budulcowe wczesnych genomów, takie jak rybonukleotydy lub prostsze kwasy nukleinowe.

Polimeraza DNA odgrywa znaczące role w licznych biotechnologiach. Opisane tutaj wykorzystanie substratów difosforanowych ma potencjał praktycznego wykorzystania drogich analogów, takich jak znakowane izotopowo lub chemicznie modyfikowane nukleotydy, eliminując potrzebę trudnej syntezy trifosforanów. Ta cecha polimeraz DNA może również zapewnić metodę wykrywania nukleotydów stosowanych w wysokowydajnym sekwencjonowaniu DNA. Dwie popularne metody wykrywają grupę odchodzącą PPi związaną z przedłużaniem primera, albo poprzez wtórny test chemiluminescencyjny, albo poprzez monitorowanie zmiany lokalnego pH (25, 26). Użycie substratu dNDP daje Pi, oferując w ten sposób dodatkową możliwość rozróżnienia włączonych nukleotydów. To poszerzone zrozumienie możliwości polimerazy DNA sugeruje również, że badanie innych enzymów zależnych od trifosforanów może ujawnić tolerancję na mniej energetyczne, łatwiej dostępne substraty difosforanowe jako intermediaty ewolucyjne.