Observation of fertilized embryos to cleavage embryos
Odkąd w 1912 roku opisano pierwszą hodowlę zarodków króliczych, a zygota mysia mogła być hodowana in vitro w celu utworzenia zarodków w stadium blastocysty, Jakość zarodka stała się ważnym czynnikiem warunkującym ciążę po przeniesieniu zarodka in vitro do macicy, ponieważ jakość zarodka ma ścisły związek z implantacją przeniesionego zarodka w macicy. Od czasu narodzin pierwszego dziecka z „probówki”, Louise Brown w lipcu 1978 roku, za które w 2010 roku Nagrodę Nobla w dziedzinie fizjologii lub medycyny otrzymał Robert Edwards za opracowanie zapłodnienia pozaustrojowego (IVF) i transferu zarodka (ET) w celu leczenia niepłodności u kobiet z drożnymi jajowodami, produkcja zarodków in vitro (IVP) jest szeroko stosowana w leczeniu niepłodności u ludzi oraz w reprodukcji i powiększaniu populacji zwierząt. Jednakże, sukces technologii wspomaganego rozrodu zależy głównie od produkcji żywotnych zarodków o wysokim potencjale implantacji. Co ważniejsze, wybór najlepszego embrionu do transferu stał się głównym wyzwaniem w IVF. We wczesnej hodowli zarodków, ocena jakości zarodków była oparta głównie na kryteriach morfologicznych transferowanego zarodka. Dlatego seryjna obserwacja morfologii zarodka jest powszechną techniką oceny zarodków przez embriologów i jest uważana za kluczowy czynnik predykcyjny implantacji i ciąży. Przez długi czas embriolodzy dokonywali oceny jakości i morfologii embrionów, wyjmując je z inkubatora i umieszczając pod mikroskopem. Oprócz obserwacji morfologii, badacze są zainteresowani serią badań nad zmianami jądrowymi komórek, aktywacją i ekspresją genów, ekspresją białek cytoplazmatycznych, różnicowaniem blastomerów i tak dalej. Jednak badania te często kończą się śmiercią embrionów. Na przykład, w naszych wczesnych badaniach, które obserwowały zmiany mikrowrzeciona po wejściu plemnika do jaja lub aktywacji oocytu, zapłodnione zygoty lub aktywowane jaja musiały być utrwalone na slajdzie i zabarwione immunocytochemicznie fluoresceiną i laserową mikroskopią konfokalną. Nasze badania wyraźnie wykazały zmiany mikrotubul i chromatyny po aktywacji oocytu bydlęcego i introcytoplazmatycznej iniekcji plemnika (ICSI; Figura 1). Plemnik wprowadzony do oocytu lub jonofor wapnia i etanol mogą aktywować oocyt i spowodować ekstruzję drugiego ciała polarnego. Aby zaobserwować czas powstawania drugiego ciała polarnego, wybarwiliśmy różne stadia oocytów po aktywacji. Wynik pokazał, że po 5 godzinach postaktywacji drugie ciało polarne może być całkowicie wyekstrudowane (Figura 2).
Rysunek 1.
Laserowa skaningowa mikroskopia konfokalna zmian wrzeciona i chromatyny w różnym czasie po aktywacji i intracytoplazmatycznym wstrzyknięciu plemnika (ICSI) u bydła. Duże litery (po lewej) oznaczają zmiany po aktywacji, małe litery (po prawej) oznaczają zmiany po ICSI. A/a pokazano po 0,5 h, B/b po 2 h, C/c po 3 h, a D/d po 7 h od aktywacji lub ICSI. Prenukleus w aktywowanym jaju i prenuklei w jaju ICSI pojawiły się z czerwonym kolorem.
Rysunek 2.
Skaningowa laserowa mikroskopia konfokalna zmian wrzeciona i chromatyny w różnych okresach po aktywacji u bydła. Przy 0.5 h po aktywacji, chromosomy wrzeciona zaczynają się dzielić, a zakończenie podziału wrzeciona wymaga około 3 godzin i drugie ciało polarne może być wyciskane przy około 5 godzinach. Czerwony i zielony razem wskazują wrzeciono, a czerwony punkt wskazuje pierwsze ciało polarne.
Badanie ekspresji genów często wymaga wyizolowania mRNA lub białka z embrionów; stąd embriony musiały być lizowane i żaden embrion by nie przeżył. W celu zbadania różnicowania się komórek na zarodkach w stadium moralnym i blastocysty, zastosowano metodę podwójnego barwienia fluoresceiną w mikroskopii, aby odróżnić wewnętrzną masę komórkową (ICM) od trofektodermy (TE). Liczby dwóch różnych komórek mogą być liczone w oparciu o różne kolory (ICM jako niebieski i TE jako różowy, Rycina 3).
Rycina 3.
Rozróżnianie różnych komórek w zarodkach blastocyst bydlęcych za pomocą podwójnego barwienia. Górna ilustracja przedstawia zarodek blastocysty z zaznaczoną wewnętrzną masą komórkową (ICM) i wokół komórek trophektodermy (TE). Dolna ilustracja przedstawia podwójnie wybarwiony zarodek blastocysty bydlęcej z niebieskim kolorem jako ICM i różowym jako komórki TE. Zdjęcie na górze pochodzi z wyszukiwarki internetowej, a autor bardzo docenia uprzejmość Prof. Fuliang Du za niepublikowane zdjęcie dolne.
Te metody badawcze ostatecznie uszkadzają wszystkie zarodki, a zastosowanie tych metod w praktyce klinicznej jest niemożliwe. Dlatego też obecnie ocena jakości zarodków opiera się głównie na kryteriach morfologicznych transferowanych zarodków, które obejmują trzy główne parametry, takie jak regularność blastomerów, fragmentacja i ziarnistość cytoplazmy. Również liczba komórek zarodka w różnych dniach hodowli i wielojądrowość mogą być brane pod uwagę przy ocenie jakości zarodka. W wielu doniesieniach udokumentowano związek pomiędzy cechami morfologicznymi zarodków w stadium rozszczepienia a powodzeniem ciąży. Jest to więc obecnie podstawowa metoda oceny jakości zarodków w IVF u ludzi i w produkcji zarodków in vitro u zwierząt. Jednakże, chociaż jest to metoda łatwa do zastosowania, często wymaga wyjęcia zarodków z inkubatora, co prowadzi do obaw o bezpieczeństwo i stabilność warunków hodowli. Ponadto, niektóre kluczowe punkty rozwoju zarodka mogą zostać przeoczone podczas obserwacji. Ocena zarodków w trakcie hodowli i przed transferem zarodków jest ważną praktyką kliniczną. Obecnie główną metodą oceny zarodków zapłodnionych in vitro jest obserwacja wizualna z użyciem mikroskopu. W ostatnich latach w ludzkich klinikach IVF stosuje się różne inkubatory z mikroskopią poklatkową do monitorowania wszystkich etapów wzrostu i rozwoju zarodka. Chociaż technologie przedimplantacyjnej diagnostyki zarodków i screeningu (PGD/PGS) są stosowane w praktyce selekcji ludzkich zarodków w celu poprawy wskaźnika ciąż, techniki te są inwazyjne dla zarodków. Znalezienie innej, nieinwazyjnej metody selekcji dobrych zarodków będzie bardzo przydatne w praktyce ART u ludzi. Sallam i wsp. dokonali przeglądu nieinwazyjnych metod selekcji zarodków i ocenili te metody w świetle najlepszych obecnie dostępnych dowodów, aby stwierdzić, czy któraś z nich jest gotowa do zastąpienia lub uzupełnienia znanej od lat metody oceny morfologicznej. Potrzebujemy zatem bardziej wydajnych narzędzi do oceny markerów morfokinetycznych zarodków.
2.1. Embryo cleavage morphokinetics based on time-lapse imaging
Przez dekady badacze próbowali śledzić rozwój organizmów wielokomórkowych od zapłodnionego jaja do dorosłego osobnika. Podczas gdy naukowcy badali poszczególne etapy tego procesu, nie istniała żadna metoda, która umożliwiłaby im modelowanie całego procesu rozwoju na żywo. Obecnie, postępy w mikroskopii „light-sheet” opisane w dwóch artykułach Nature Methodspapers umożliwiły naukowcom bardzo szczegółową wizualizację wczesnego rozwoju. Najnowsze mikroskopy light-sheet wykorzystują arkusz światła laserowego do oświetlania cienkiego przekroju próbki i uchwycenia całej płaszczyzny w jednej migawce. Dzięki temu zużywają one znacznie mniej światła niż mikroskopy konfokalne czy dwufotonowe. Jest on bardzo szybki, ale również bardzo delikatny, aby działać wyjątkowo dobrze w wielu krytycznych aspektach w tym samym czasie. Do obrazowania rozwoju całych embrionów, takich jak te z Drosophila, zebrafish, i myszy, ta nowa technika obrazowania multiview jest fantastyczna.
Obrazowanie poklatkowe jest kolejną nieinwazyjną, pojawiającą się technologią, która pozwala na 24-godzinne monitorowanie rozwoju embrionów, oferując możliwość zwiększenia ilości i jakości informacji morfologicznych bez zakłócania warunków hodowli . Mikroskop poklatkowy jest bardzo przydatny do obserwacji rozwoju zarodka. W ostatniej dekadzie, wiele ludzkich klinik i ośrodków IVF zaczęło stosować obrazowanie poklatkowe do monitorowania wzrostu i podziału zarodków podczas hodowli in vitro, a w końcu do wyboru dobrej jakości zarodków do transferu na podstawie danych i zdjęć. Technikę tę uznano za zdolną do poprawy implantacji przeniesionego zarodka i uzyskania ciąży. Na podstawie zapisu poklatkowego rozszczepiania zarodków można określić normalną prędkość rozszczepiania zarodków. Tak więc, w drugim rozdziale tej książki, czas rozszczepienia zarodka został nakreślony w oparciu o markery morfokinetyczne przez monitor poklatkowy. Zgodnie z tym zarysem czasu rozszczepienia zarodka, embriolodzy mogą jasno określić, na jakim etapie powinien znajdować się zarodek w różnych punktach czasowych. W ten sposób do transferu można wybrać zarodek o optymalnej jakości lub zarodek o wysokim potencjale implantacyjnym, aby uzyskać wyższy wskaźnik ciąż. Stosując system ciągłej i częstej rejestracji w systemie poklatkowym, można ujawnić pewne markery morfokinetyczne. Na przykład, szybki podział komórek zarodka w danym czasie często skutkuje niższym wskaźnikiem implantacji. W normalnej sytuacji, podział z zygoty na 2-3 komórki wymaga około 10-11 godzin czasu, ale Rubio i wsp. stwierdzili, że niektóre zarodki potrzebują tylko około 5 godzin, aby zakończyć ten podział, i te zarodki mają znacznie niższy wskaźnik implantacji niż zarodki z normalnym podziałem (1.2% vs 20%). Również nierównomierne rozszczepienie zarodka, które definiuje się jako przerwanie jednego blastomeru na trzy blastomery lub przerwę w cyklu komórkowym krótszą niż 5 godzin, często powoduje znaczne obniżenie potencjału implantacyjnego. Tak więc, możemy użyć tych bardziej precyzyjnych markerów morfokinetycznych, aby odróżnić jakość zarodków.
Trzeci rozdział dalej bada i weryfikuje, czy technologia obrazowania poklatkowego jest przydatna do wyboru zarodków „najwyższej jakości” do transferu w celu poprawy wyników ART, zamiast konwencjonalnej oceny morfologicznej. Co ciekawe, na podstawie nowych badań nad urządzeniami do obrazowania poklatkowego oceniono możliwe korelacje pomiędzy płcią zarodka, fragmentacją zarodka, protokołami leczenia, różnymi mediami hodowlanymi i morfokinetyką zarodka. Ponadto, omówiono również różne algorytmy i modele predykcyjne zaprojektowane dla cykli ART z obrazowaniem poklatkowym. Na przykład, wiele badań nad szybkością rozwoju embrionów zwierzęcych i ludzkich poprzez zwykłą obserwację morfologii wykazało, że embriony męskie rosną szybciej niż żeńskie. Jednakże, obecna obserwacja poklatkowa może dostarczyć bardziej szczegółowych i dokładnych informacji na temat różnic w rozwoju embrionów męskich i żeńskich podczas wczesnych podziałów. Chociaż zarodki żeńskie wykazywały późne parametry morfokinetyczne w stadium rozszczepienia (t8), moruli (tM) i blastocysty, to jednak prezentowały wcześniejszą ekspansję niż samce. Tak więc kluczowe punkty czasowe obserwacji związane są z rozwojem płci zarodka. Co ciekawe, autorzy zaprojektowali model w zależności od czasu drugiej synchronii i formowania moruli z czterema podgrupami, aby przewidzieć prawdopodobieństwo, że zarodek jest żeński.
W celu dalszych badań i eksploracji morfokinetyki rozszczepiania zarodków, w czwartym rozdziale omówiono niektóre metody analizy przestrzenno-czasowej rozszczepiania zarodków in vitro.Zautomatyzowana lub półautomatyczna analiza poklatkowa obrazów wczesnych stadiów embrionów w fazie rozszczepienia może dać wgląd w czas mitozy, regularność zarówno czasu podziału, jak i jego wzorca, a także w linię komórkową. Równoczesne monitorowanie procesów molekularnych umożliwia badanie powiązań między ekspresją genetyczną a fizjologią i rozwojem komórek. Dzięki poklatkowym danym obrazowym i oprogramowaniu analitycznemu, można łatwo stworzyć czterowymiarowe sekwencjonowanie wideo embrionów, dzięki czemu rosnące embriony wykazują nowy wgląd w czasowy rozwój embrionu. W tym rozdziale autorzy opisują trzy metody z różnicami w analizie sprzętu i oprogramowania, podając kilka przykładów wyników, aby otworzyć okno na nowe informacje w embriologii rozwojowej, ponieważ wzór podziału zarodka i linia rozwojowa są badane in vivo.
2.2. Ekspresja genów w rozszczepionym zarodku i nieinwazyjna ocena żywotności zarodka poprzez analizę podłoża hodowlanego
Rozwój zarodka preimplantacyjnego doświadcza serii krytycznych wydarzeń i niezwykłych modyfikacji epigenetycznych, a przeprogramowanie ekspresji genów następuje w celu aktywacji genomu zarodka. We wczesnych etapach rozwoju zarodka preimplantacyjnego, matczyne mRNA kieruje rozwojem zarodka. Przez cały okres wczesnego rozwoju zarodka utrzymywany jest zróżnicowany wzór metylacji, chociaż niektóre z nich wykazują zmiany specyficzne dla danego etapu. Ostatnie badania wykazały, że zróżnicowany proces demetylacji powoduje zróżnicowanie ekspresji genów rodzicielskich we wczesnym rozwoju zarodka, co może mieć wpływ na prawidłowy rozwój. Wykazano również, że niekodujące RNA, długie niekodujące RNA (lncRNA) i krótkie niekodujące RNA, mikroRNA (miRNA), odgrywają ważną rolę w regulacji mRNA, a zatem ich rola w rozwoju preimplantacyjnym nabrała znaczenia. W rozdziale piątym dokonano przeglądu różnych czynników wpływających na ekspresję genów podczas rozwoju zarodka preimplantacyjnego, w tym czynników epigenetycznych, skupiając się na profilach metylacji, gamet i zarodków preimplantacyjnych. Wpływ niekodującego RNA na ekspresję genów został dokładnie oceniony.
Ponieważ ekspresja genów pojawia się podczas rozwoju zarodka w kulturze in vitro, zarodki preimplantacyjne często wymagają bogatych pożywek hodowlanych. Zarodek podczas swojego wzrostu i rozwoju musi wchłonąć pewne ważne składniki odżywcze z podłoża hodowlanego i metabolicznie wytworzyć pewne produkty uboczne jako wyniki ekspresji genów. Z tego punktu widzenia hodowla zarodków in vitro dostarcza również bardzo ważnego materiału do dalszej nieinwazyjnej oceny zarodków poprzez badanie biomarkerów w zużytej pożywce hodowlanej. Obecnie rozwijane metody koncentrują się na pomiarze związków metabolicznych wydzielanych przez rozwijające się zarodki. Badania te wykorzystują głównie narzędzia nowoczesnej analityki i proteomiki. Niektóre badania sugerują, że profilowanie metaboliczne pożywki hodowlanej zarodków przy użyciu spektroskopii optycznej i nieoptycznej może stanowić użyteczne uzupełnienie obecnych strategii oceny zarodków i zapewnić wgląd w fenotyp zarodków o rosnącym potencjale reprodukcyjnym .
W szóstym rozdziale autorzy opisują swoje nowe odkrycie, łańcuch alfa-1 ludzkiej cząsteczki haptoglobiny jako ilościowy biomarker żywotności zarodków. W serii retrospektywnych, ślepych eksperymentów osiągnęli ponad 50% wskaźnik sukcesu. Niniejszy rozdział podsumowuje obecnie dostępne metody metaboliczne i proteomiczne jako nieinwazyjne molekularne metody oceny żywotności zarodków. Ostatnie badania wykazały, że ocena molekularnych składników pożywek jest obiecującym obszarem w poszukiwaniu markerów udanej implantacji zarodka z późniejszym rozwojem ciąży klinicznej i urodzeniem zdrowego dziecka w celu zwiększenia efektywności leczenia technikami ART. Jeśli molekularny skład pożywek może być wykorzystany jako dodatkowa nieinwazyjna procedura wyboru zarodka do selektywnego transferu, będzie to bardzo przydatne dla poprawy wyników ciąż IVF u ludzi.