Phase 1 Clinical Trial of Trametes versicolor in Women with Breast Cancer

Abstract

Introduction. Doustnie podawane preparaty z grzyba Trametes versicolor (Tv) mają hipotezę poprawy odpowiedzi immunologicznej u kobiet z rakiem piersi po standardowej chemioterapii i radioterapii. Metody. Przeprowadzono dwuośrodkowe badanie fazy I z eskalacją dawki w celu określenia maksymalnej tolerowanej dawki preparatu Tv, przyjmowanego codziennie w dawkach podzielonych przez 6 tygodni po niedawno zakończonej radioterapii. Zrekrutowano 11 uczestniczek, a badanie ukończyło 9 kobiet. Każda kohorta składała się z trzech uczestniczek, którym podawano jedną z trzech dawek Tv (3, 6 lub 9 gramów). Dane immunologiczne były zbierane przed i po napromienianiu, w 3 punktach czasowych leczenia i po 3-tygodniowym okresie odpoczynku. Wyniki. Odnotowano dziewięć zdarzeń niepożądanych (7 łagodnych, 1 umiarkowane i 1 ciężkie), co sugeruje, że Tv była dobrze tolerowana. Wyniki immunologiczne wykazały tendencje do (1) zwiększonej liczby limfocytów przy dawce 6 i 9 gramów/dobę; (2) zwiększonej aktywności funkcjonalnej komórek naturalnych zabójców przy dawce 6 gramów/dobę; (3) zależnego od dawki zwiększenia liczby komórek T CD8+ i komórek B CD19+ , ale nie komórek T CD4+ i komórek NK CD16+56+. Wnioski. Wyniki te wskazują, że podawanie preparatu Tv w dawce do 9 g/dobę jest bezpieczne i tolerowane u kobiet z rakiem piersi w okresie po leczeniu pierwotnym. Ten preparat Tv może poprawić stan immunologiczny u pacjentek z rakiem piersi z obniżoną odpornością po standardowym pierwotnym leczeniu onkologicznym.

1. Wprowadzenie

Trametes versicolor (Tv), znany również jako Coriolus versicolor i potocznie nazywany Indyczym Ogonem, jest gatunkiem grzyba, z którego sporządzono preparaty o długiej historii stosowania w tradycyjnej medycynie azjatyckiej. Dwie frakcje proteoglikanów, polisacharyd-K (PSK) i polisacharyd-peptyd (PSP), są podobnymi ekstraktami gorącej wody z Tv o zgłoszonej aktywności przeciwnowotworowej. W Japonii PSK jest przepisywany pacjentom chorym na raka rutynowo, zarówno w trakcie, jak i po radioterapii i chemioterapii. Jest to również powszechna praktyka wśród wielu lekarzy naturopatów (ND) i onkologów integracyjnych (MD) w USA, aby przepisać cały, liofilizowany Tv do pacjentów z rakiem piersi . Aktywność immunologiczna Tv jest hipotezą, że jest to główny mechanizm odpowiedzialny za jej działanie przeciwnowotworowe, jak również jej wpływ na wskaźniki przeżycia. Mechanizm działania Trametes versicolor obejmuje wzmocnienie zarówno wrodzonej, jak i adaptacyjnej odpowiedzi immunologicznej, przynajmniej częściowo poprzez aktywność agonisty receptora Toll-podobnego 2. Przedkliniczne badania na zwierzętach i wstępne dane kliniczne wspierają hipotezę, że pochodne Tv mogą być korzystne w leczeniu zarówno negatywnych, jak i pozytywnych receptorów estrogenowych nowotworów poprzez łagodzenie immunologicznych efektów depresyjnych leczenia i zwiększanie przeżycia wolnego od choroby poprzez wzmocnienie nadzoru immunologicznego i przezwyciężanie tolerancji na antygen nowotworowy.

Zrozumienie, w jaki sposób czynniki immunologiczne są pod wpływem leczenia w raku piersi, sugeruje obiecujące obszary zainteresowania w opracowywaniu terapii wspomagających w celu wzmocnienia przeciwnowotworowych odpowiedzi immunologicznych. Ostatnie dane pokazują, że niektóre klasy leków chemioterapeutycznych powodują immunogenną śmierć komórek nowotworowych, co prowadzi do wzmocnienia krzyżowej prezentacji antygenów i stymulacji przeciwnowotworowej odpowiedzi immunologicznej. Dowody sugerują, że komórki NK odgrywają ważną rolę w zapobieganiu zarówno wczesnemu, jak i przerzutowemu rakowi piersi. U niektórych pacjentek z rakiem piersi stwierdzono brak aktywności komórek NK wobec komórek docelowych K562. Aktualne dane sugerują, że pacjentki z rakiem piersi, które przeszły operację, chemioterapię i radioterapię mają deficyt immunologiczny. Andersen i wsp. donoszą, że poziom stresu u chorych na raka piersi znacząco przewidywał niższą lizę komórek NK, jak również zmniejszoną odpowiedź proliferacyjną limfocytów krwi obwodowej. Nasze poprzednie badania obserwacyjne potwierdziły, że limfopenia i niska aktywność komórek NK były obecne przez 6 tygodni po zakończeniu radioterapii. Aby lepiej zrozumieć potencjalne korzyści płynące ze stosowania Trametes versicolor u kobiet z rakiem piersi, konieczne było przeprowadzenie badania eskalacji dawki w celu oceny bezpieczeństwa i tolerancji. W tym celu multidyscyplinarny zespół z University of Minnesota i Bastyr University zakończył badanie fazy 1 eskalacji dawki w celu określenia bezpieczeństwa i maksymalnej tolerowanej dawki Tv u kobiet ze zdiagnozowanym rakiem piersi, które przeszły standardowe leczenie raka piersi i były chętne do udziału w dziewięciotygodniowym badaniu po radioterapii.

2. Metody

2.1. Eskalacja dawki w badaniu

Stosowano standardowy projekt fazy 1 z 3 uczestnikami na poziom dawki aż do osiągnięcia MTD (maksymalnej tolerowanej dawki). Schemat eskalacji dawki dla każdej kohorty Tv był następujący: 3 gm (najczęściej stosowana dawka); 6 gm; 9 gm; 12 gm; 18 gm; 24 gm. W tym badaniu prowadzono rekrutację wyłącznie w kohorcie dziewięciu gramów (𝑁=9).

2.2. Uczestnicy badania

Kobiety w wieku od 21 do 75 lat, u których zdiagnozowano raka piersi w stadium I, II lub III, które przeszły operację i chemioterapię oraz były gotowe do rozpoczęcia radioterapii, zostały włączone do badania po wyrażeniu pisemnej zgody. Kwalifikacja obejmowała również gotowość do stosowania stałej diety przez cały czas trwania badania oraz unikania w czasie radioterapii i do czasu zakończenia badania grzybów i innych produktów ziołowych o działaniu immunomodulującym. Przed włączeniem do badania wymagana była podstawowa funkcja hematologiczna, nerkowa i wątrobowa w granicach normy. Badanie zostało przeprowadzone w Cancer Center na Uniwersytecie Minnesoty w Minneapolis, Minnesota i na Uniwersytecie Bastyr w Ken more, Washington. Badanie zostało zatwierdzone przez komisje IRB na Uniwersytecie Minnesoty i Uniwersytecie Bastyr. Między styczniem 2008 a czerwcem 2010 jedenaście kobiet z rakiem piersi w stadium I-III spełniało wąskie kryteria tego badania, wyraziło zgodę na udział i zostało kolejno włączonych do badania z kohorty stosującej najniższą dawkę. Badanie ukończyły trzy uczestniczki w każdej z kohort o dawkach 3 gm, 6 gm i 9 gm. Dwie z uczestniczek wycofały się z badania po drugiej wizycie z powodu trudności z transportem do kliniki. Charakterystyka dziewięciu kobiet, które ukończyły badanie, obejmowała przedział wiekowy od 38 do 68 lat; sześć ER ujemnych i trzy ER dodatnie; trzy raki piersi w stadium I; dwa w stadium II i cztery w stadium III. Jedna z kobiet, które ukończyły badanie, nie została poddana chemioterapii przed napromienianiem, a naruszenie protokołu kwalifikowalności zostało zgłoszone do IRB.

2.3. Pierwszorzędowym celem badania była ocena bezpieczeństwa i tolerancji Trametes versicolor u kobiet z rakiem piersi w warunkach po radioterapii. Dziewięć uczestniczek w badaniu eskalacji dawki było monitorowanych pod kątem zdarzeń niepożądanych (AE) przy użyciu metod klinicznych i laboratoryjnych oraz kryteriów toksyczności ograniczającej dawkę (DLT) zdefiniowanej jako toksyczność stopnia 2 lub większego związana z leczeniem, oceniona przy użyciu Common Terminology Criteria for Adverse Events V 3.0 (CTCAE) NCI. Kobiety były poddawane cotygodniowym badaniom przesiewowym pod kątem zdarzeń niepożądanych w trakcie podawania produktu, podczas wizyty w klinice lub poprzez badania telefoniczne pomiędzy wizytami. Celem drugorzędowym było zebranie wstępnych danych porównujących wartości wyjściowe przed i po leczeniu napromienianiem, wartości immunologiczne podczas leczenia i po leczeniu, w tym pełną morfologię krwi z różnicowaniem, aktywność komórek NK (ang. natural killer), test komórek regulatorowych T, test podzbiorów komórek T/B/NK, indeks fagocytarny i poziomy cytokin. Analiza statystyczna, w tym niezależne testy t i jednoczynnikowe ANOVA z wielokrotnym porównaniem post hoc Turcji, została wykonana przy użyciu GraphPad Prism, wersja 5.04 (GraphPad Software, Inc., La Jolla, CA). W celu zwiększenia mocy i liczebności próby dane z badania obserwacyjnego (𝑁=14) prowadzonego przez nasze ośrodki od 2006 roku połączono z obecnym badaniem eskalacji dawki (𝑁=9). Kryteria kwalifikacji do badania były identyczne dla obu badań (𝑁=23).

2.4. Produkt leczniczy z grzybów

Liofilizowany proszek grzybni Trametes versicolor otrzymano od Paula Stametsa z Fungi Perfecti, Inc, Olympia, WA i został on zamknięty w kapsułce przez Beehive Botanicals (Hayward, WI). Każda kapsułka zawierała 500 mg produktu. Zatwierdzenie FDA IND (# 75,405) uzyskano w 2007 roku.

2.5. Napady immunologiczne

2.5.1. Complete Blood Count with Differential

Kliniczne badania laboratoryjne (CBC, chemia, testy ciążowe w surowicy i badanie moczu) przeprowadzono w Departamencie Medycyny Laboratoryjnej Uniwersytetu Waszyngtońskiego dla uczestników rekrutowanych w ośrodku Bastyr University oraz w Laboratorium Diagnostycznym Uniwersytetu Minnesoty Fairview dla uczestników rekrutowanych w ośrodku U of Minnesota.

2.5.2. Natural Killer Cell Functional Activity

Zestaw komórek odpornościowych mierzony obejmował aktywność komórek NK, badanie komórek regulatorowych T, badanie podzbioru komórek T/B/NK, indeks fagocytarny i poziomy cytokin. Testy immunologiczne przeprowadzono w laboratorium Bastyr University dla uczestników rekrutowanych z obu miejsc. Krew pobrana w University of Minnesota General Clinical Research Center (GCRC) została przesłana w nocy do Bastyr University. Jakość krwi transportowanej z University of Minnesota do Bastyr oceniano według następujących kryteriów. Dla próbek starszych niż 48 godzin w momencie przybycia do laboratorium Bastyr, limfocyty zostały wyizolowane, a żywotność komórek została określona przez barwienie błękitem trypanu. Jeśli żywotność była większa niż 80%, test został przeprowadzony. Jeśli żywotność była mniejsza niż 80%, próbki były odrzucane. Komórki jednojądrowe krwi obwodowej (PBMC) izolowano przy użyciu gradientu Ficoll-Hypaque (gęstość = 1,070 g/mL), przemywano dwukrotnie w PBS i utrzymywano w RPMI 1640, 10% FBS z 2 mM L-Gln i penicyliną-streptomycyną (1000 U/mL; 1 mg/mL). Aktywność komórek NK tych próbek PBMC, mierzona zdolnością do zabijania docelowych komórek nowotworowych K562, była oceniana w trzech egzemplarzach przy stosunku efektora do celu (E : T) 50 : 1, 25 : 1 i 12,5 : 1 zgodnie z opublikowanymi metodami. Komórki docelowe były znakowane nadchloranem 3,3′-dioktadecyloksyakarbocyjaniny (DiOC18) i współkulturowane z komórkami efektorowymi PBMC przez cztery godziny. Próbka kontrolna z samymi komórkami K562 została dołączona w celu określenia spontanicznej śmierci komórek docelowych. Po inkubacji dodano jodek propidium w celu wykrycia martwych komórek. Procent zabitych komórek docelowych został określony przez odjęcie procentu spontanicznej lizy od procentu specyficznej lizy (PSL) odpowiedniego stosunku E : T. Aby przedstawić znormalizowaną aktywność komórek NK, jednostki lityczne obliczono za pomocą wcześniej opublikowanego i zatwierdzonego programu komputerowego przy użyciu następujących parametrów: cel na studzienkę = 10 000; LU na liczbę komórek = 107; maksimum krzywej = 48; procent liz = 20 . Wartości LU20, zdefiniowane jako stosunek E : T, przy którym występuje 20% śmierci komórek docelowych, zostały ekstrapolowane z krzywych zależności dawka-odpowiedź PSL versus log E : T dla każdej badanej próbki krwi .

2.5.3. Immunofenotyping PBMC Subsets

PBMC suspensje (5×105 komórek) umieszczano w 3 probówkach, płukano w PBS, odwirowywano, supernatanty jak pirackie, a osady komórkowe ponownie zawieszano w 100 μL PBS. PBMC w probówce 1 barwiono CD3-PC5, CD4-PE i CD8-FITC; w probówce 2: CD3-PC5, CD16-FITC i CD56-PE; w probówce 3: CD14-PC5. Probówki krótko worteksowano, przykryto i inkubowano na lodzie przez 15 minut, po czym komórki dwukrotnie płukano w zimnym PBS, ponownie zawieszano do 0,5 mL w PBS i określano procentowe podzbiory PBMC za pomocą analizy cytometrycznej przepływu przy użyciu urządzenia Beckman Coulter FC500 i oprogramowania CXP.

2.6. Protokół badania klinicznego

Czas trwania badania wynosił dziewięć tygodni i rozpoczynał się po zakończeniu radioterapii. Obejmował on sześć tygodni stosowania produktu, po których następował trzytygodniowy okres bez stosowania produktu (Rycina 1). Pacjenci byli poddawani badaniom przesiewowym i kwalifikowani do badania po zakończeniu chemioterapii i przed rozpoczęciem radioterapii. Badanie wymagało sześciu wizyt w ośrodkach badań klinicznych. Pierwsza wizyta miała miejsce przed rozpoczęciem radioterapii, podczas której pobierano wyniki badań podstawowych. W ciągu pierwszego tygodnia po zakończeniu radioterapii uczestnicy odbyli drugą wizytę, podczas której pobrano wyniki badań laboratoryjnych i rozpoczęto dziewięciotygodniowe badanie. Uczestnik otrzymywał produkt Tv przez sześć tygodni, po czym wracał do ośrodka badawczego na wizytę trzecią, czwartą i piątą, w odstępie dwóch tygodni, w celu pobrania wyników badań laboratoryjnych oraz oceny tolerancji produktu i działań niepożądanych. Ostatnia (szósta) wizyta miała miejsce w dziewiątym tygodniu, po trzech tygodniach od odstawienia produktu, w celu ostatecznego pobrania próbek laboratoryjnych i oceny pod kątem wszelkich przedłużających się zdarzeń niepożądanych.

Rycina 1

Protokół badania eskalacji dawki w fazie I.

Protokół eskalacji dawki obejmował kohorty minimum trzech uczestników przyjmujących doustnie Tv w dawkach podzielonych codziennie przez sześć tygodni. Pierwsza kohorta dawki wzięła 3 gramy/dzień w dwóch podzielonych dawkach; druga kohorta wzięła 6 gramów/dzień w dwóch podzielonych dawkach; trzecia kohorta wzięła 9 gramów/dzień w trzech podzielonych dawkach. Trzy gramy dziennie to najczęściej stosowana dawka w praktyce medycyny naturopatycznej, a w Japonii stosuje się nawet 9 gramów. Celem badania było określenie maksymalnej tolerowanej dawki (MTD), która wykazała bezpieczeństwo i tolerancję (Tabela 1).

. Kohorta Tv g/dobę Czas eskalacji dawki (z zastosowaniem zasady podejmowania decyzji o eskalacji w następnej ramce) 1 3 Dawka początkowa (dawka stosowana w praktyce klinicznej) 2 6 Rozpocząć po uzyskaniu co najmniej 3 uczestników z grupy 1, którzy ukończyli 2 tygodnie stosowania produktu bez toksyczności ograniczającej dawkę (DLT – zdefiniowanej jako jakakolwiek toksyczność związana z leczeniem > stopnia 1) 3 9 Rozpocząć po minimum 3 uczestników z grupy 2, którzy ukończyli 2 tygodnie stosowania produktu bez DLT

Tabela 1

Eskalacja dawki w fazie I.

3. Wyniki

3.1. Działania niepożądane

Wyniki tego badania eskalacji dawki wykazały, że do 9 gramów/dobę preparatu Tv było dobrze tolerowane u kobiet z rakiem piersi przez sześć tygodni w warunkach leczenia po napromienianiu. Wystąpiło dziewięć zdarzeń niepożądanych; siedem łagodnych, jedno umiarkowane i tylko jedno zdarzenie niepożądane stopnia 3, którym był napad lęku u jednej uczestniczki, który prawdopodobnie nie był związany z lekiem badanym (Tabela 2). Inne zgłaszane łagodne zdarzenia niepożądane obejmowały przemijające oparzenie serca, kołatanie serca, zaparcia, ból w klatce piersiowej, gorączkę, popromienne zapalenie skóry oraz objawy przeziębienia/grypy. Wszystkie trzy dawki były dobrze tolerowane, a uczestnicy nie mieli trudności z połknięciem do 9 kapsułek trzy razy dziennie. Na uwagę zasługuje fakt, że nie zgłaszano ani nudności, ani zaburzeń żołądkowo-jelitowych; te dwa efekty uboczne były zgłaszane w poprzednich badaniach klinicznych innych ekstraktów Tv.

. Gatunek Częstotliwość Dawka Opis Relacja Oczekiwania Łagodny 7 3 g Zgaga Możliwy związek Nieoczekiwany 3 g Palpitacje serca Nieprawdopodobnie związane Nieoczekiwane 6 g Zaparcie Nieprawdopodobne związane Nieoczekiwane 6 g Ból w klatce piersiowej Możliwe związany Nieoczekiwany 6 g Gorączka z towarzyszącym zapaleniem skóry typu R (2) Nieprawdopodobnie związany Nieoczekiwany 9 g Przeziębienie lub grypapodobne objawy Nieprawdopodobnie związane Nieoczekiwane Umiarkowane 1 6 g Zmęczenie; wtórne do zakażenia UT Nieprawdopodobne Nieoczekiwane Szerokie 1 6 g Zdarzenie lękowe Możliwe Related Unexpected Total 9

Tabela 2

Zgłaszanie zdarzeń niepożądanych.

3.2. Odpowiedź immunologiczna

Na przedział krwinek czerwonych nie miała wpływu zarówno radioterapia (RT), jak i podawanie Tv. Bezwzględna liczba czerwonych krwinek, hemoglobina i hematokryt były prawidłowe podczas pierwszej wizyty, która miała miejsce w dniu poprzedzającym rozpoczęcie RT, i nadal mieściły się w granicach normy przez resztę badania. Bezwzględna liczba białych krwinek i liczba neutrofilów była ogólnie w granicach normy u wszystkich kobiet zarówno przed, jak i po RT oraz w ciągu tygodni po RT, gdy przyjmowały Tv (dane nie pokazane). Jednak bezwzględna liczba limfocytów ujawniła inny wzór niż inne podgrupy CBC. Ponieważ kryteria kwalifikacji były identyczne w badaniach prowadzonych przez nasze ośrodki od 2006 roku, w celu zwiększenia mocy połączyliśmy dane z naszego badania obserwacyjnego (𝑁=14), które wykazało, że RT spowodowała defekty immunologiczne u kobiet z rakiem piersi w stadium I-III, z naszym obecnym badaniem eskalacji dawki (𝑁=9). Dla połączonej liczby 23 kobiet w obu badaniach z rakiem piersi w stopniu I-III po operacji piersi i chemioterapii, które następnie otrzymały radioterapię, limfocyty były w granicach normy przed RT, ale spadły do nienormalnie niskich poziomów po RT. Średnia liczba limfocytów dla wszystkich 23 badanych przed RT wynosiła 1,027±0,298 i spadła o 20% po RT do 0,681±0,254, co było różnicą istotną statystycznie. W badaniu eskalacji dawki, dwie wyższe dawki doustne (6 i 9 g) Tv spowodowały wcześniejszy powrót liczby limfocytów do normy (Figura 2). Liczba limfocytów stopniowo wracała do normy w grupie obserwacyjnej, ale średnia liczba limfocytów pozostawała poniżej wartości dla kohorty 6 i 9 gm Tv w 6 tygodniu po RT. Ze względu na małą liczebność każdej kohorty dawek (𝑁=3), istotność statystyczną stwierdzono jedynie pomiędzy grupą obserwacyjną a grupą 9 g w 2-tygodniowym punkcie czasowym po radioterapii. Radioterapia istotnie statystycznie zmniejszyła bezwzględną liczbę limfocytów u kobiet z rakiem piersi w stopniu I-III, które ukończyły operację i chemioterapię (patrz ryc. 2).

Rycina 2

Aktywność funkcjonalna komórek naturalnych zabójców była dramatycznie zmniejszona od pre- do okresu po RT u wszystkich 23 chorych na raka piersi, które ukończyły dwie pierwsze wizyty w ramach badania obserwacyjnego (𝑁=14) lub badania eskalacji dawki (𝑁=9). Rycina 3 pokazuje, że średnia aktywność komórek NK wynosiła 19,941±18,959 przed RT i zmniejszyła się do 9,872±13,454 po RT (𝑁=23). Spadek ten był istotny statystycznie (𝑡(44)=2,077, 𝑃=0,043). Trend w kierunku zwiększonej aktywności komórek NK obserwowano w kohorcie otrzymującej dawkę 6 g Tv.

Rycina 3

Radioterapia statystycznie istotnie obniżyła funkcję komórek NK reprezentowaną przez LU, który jest obliczany przez 107 dawek podzielonych przez LU20. LU20 to liczba komórek efektorowych (NK) wymagana do osiągnięcia 20% specyficznych liz na komórkach docelowych (K562). Zatem im mniejszy LU20, tym większa skuteczność komórek NK. Interpretacja tego wyniku mogła być trudna ze względu na zróżnicowane odpowiedzi poszczególnych osób po suplementacji grzybami. Trend tymczasowego wzrostu aktywności komórek NK zaobserwowano w grupie dawki 6 g (patrz rysunek 3).

Zmierzyliśmy również wpływ radioterapii i podawania Tv na populacje komórek T, B i NK u dziewięciu pacjentów, którzy ukończyli badanie eskalacji dawki fazy I. Z danych immunofenotypowania WBC i cytometrii przepływowej obliczono wartość bezwzględną (mm3). Radioterapia miała nieistotny wpływ na populacje komórek T CD4+ i CD8+, komórek B CD19+ i komórek NK CD16+/56+. Ponieważ w badaniu obserwacyjnym nie wykonywano immunofenotypowania, liczby punktów złożonych (przed i po napromienianiu) pochodziły od osób uczestniczących w badaniu eskalacji dawki (𝑁=9). Liczba komórek T CD8+ nie różniła się statystycznie przed i po radioterapii (ryc. 4). Zaobserwowano jednak wzrost liczby komórek T CD8+ i komórek B CD19+ we krwi obwodowej w grupach suplementowanych Tv. Liczba komórek T CD8+ w ciągu 9-tygodniowego badania eskalacji dawki była zwiększona w kohorcie dawki 9 gm Tv w porównaniu z grupą 3 g lub 6 g. Jednokierunkowa ANOVA została użyta do analizy ogólnej różnicy pomiędzy grupami dawkowania w okresie leczenia (2-4-6 tygodni). Wykazała ona istotny statystycznie wzrost liczby cytotoksycznych komórek T CD8+ w grupie 9 g w porównaniu zarówno z grupą 3 g, jak i 6 g (𝐹(2,6)=42,04, 𝑃=0,0003). Różnica między grupami 3 g i 6 g nie była istotna (patrz Figura 4).

Figura 4

Zgodnie z wynikami złożonymi ośmiu uczestników eskalacji dawki, radioterapia nie zmieniła znacząco liczby komórek B (Figura 5). Jednak podawanie Tv było związane ze wzrostem liczby komórek B CD19+. Jednokierunkowa ANOVA została użyta do analizy ogólnej różnicy między grupami dawkowania w okresie leczenia (2-4-6 tygodni). Wykazała ona statystycznie istotny wzrost liczby komórek B CD19+ w grupie otrzymującej 6 g w porównaniu z grupą otrzymującą 3 g. Różnica między grupami 3 g i 9 g, a także między grupami 6 g i 9 g nie była istotna (patrz Figura 5).

Rysunek 5

W odniesieniu do liczby komórek NK CD16+56+ nie zaobserwowano znaczących zmian spowodowanych ani radioterapią, ani podawaniem Tv (Figura 6). Ponieważ aktywność komórek NK została zarówno zmniejszona przez RT, jak i zwiększona w kohorcie z 6 gramową dawką Tv (Figura 3), ale populacje komórek NK nie wydawały się być znacząco dotknięte tymi zabiegami, dane sugerują, że wzmocnienie aktywności komórek NK nie wynika z wywołanych przez leczenie zmian w liczbie komórek NK. Na populację komórek NK nie miała wpływu ani radioterapia, ani doustne dawki Tv (patrz rysunek 6).

Rysunek 6

4. Dyskusja

Wyniki tego badania wskazują na bezpieczeństwo doustnego podawania preparatu Trametes versicolor (Tv) w dawkach 3, 6 i 9 gramów, bez poważnych działań niepożądanych tej terapii u kobiet po radioterapii w leczeniu raka piersi. Obecne badania potwierdzają nasze wcześniejsze doniesienie, że standardowa radioterapia klatki piersiowej z powodu raka piersi nie wpływa na przedział czerwonych krwinek lub neutrofili, ale wywołuje specyficzne niedobory immunologiczne, w tym limfopenię i obniżoną aktywność funkcjonalną komórek NK. Terapie komórkami NK pojawiają się na całym świecie jako obiecujące metody leczenia przeciwnowotworowego, wykorzystujące szybkie działanie cytolityczne efektorów NK i ich potencjalnie szerokie zastosowanie przeciwko szerokiej gamie nowotworów złośliwych. Naszym nowym odkryciem jest to, że utrata aktywności komórek NK wydaje się być niezależna od liczby komórek NK. Tutaj pokazujemy, że RT zmniejsza aktywność komórek NK na komórkę NK. Wyższe doustne dawki Tv w dawkach 6 i 9 gramów / dzień były związane z szybszym odzyskiwaniem limfocytów i aktywności komórek NK, a także zwiększoną liczbą komórek CD8 + T i komórek B CD19 +. Nie stwierdzono wyraźnego wpływu Tv na liczbę komórek NK CD 16+/56+, a jedynie na ich aktywność funkcjonalną. Chociaż istnieje tendencja, że wyższe dawki Tv mają wyraźniejszą aktywność immunologiczną, to badanie eskalacji dawki I fazy nie zostało zaprojektowane do oceny zależnych od dawki zmian w markerach immunologicznych. Wstępne dane z tych małych prób 3 pacjentów z rakiem piersi na grupę kohorty dawek, pokazujące trendy związane z dawką, prowadzą do testowalnej hipotezy, że 6 gramów Tv może prowadzić do szybszej regeneracji immunologicznej po radioterapii. Wyniki tej fazy I badania uzasadniają i stoją jako platforma, na której II fazy randomizowane kontrolowane badania dawka-odpowiedź mogą postępować.

Chociaż to badanie wykazało bezpieczeństwo Trametes versicolor do 9-gramowej dawki dziennej, badanie eskalacji dawki zostało zaprojektowane w celu oceny maksymalnej tolerowanej dawki (MDT); dlatego to badanie nie określiło bezpieczeństwa i tolerancji przy najwyższej dawce. Rekrutacja kobiet do kohorty 12-gramowej i wyższej nie została przeprowadzona z powodu wielu czynników ograniczających. Po pierwsze, kobiety musiały spełniać bardzo rygorystyczne kryteria kwalifikacji do udziału w badaniu i być poddane operacji, chemioterapii i radioterapii w ramach protokołu leczenia. Obecnie wiele kobiet z rozpoznaniem raka piersi nie otrzymuje schematu potrójnej terapii. Wiele kobiet, u których zdiagnozowano raka piersi w stadium 1, poddaje się lumpektomii i naświetlaniom, a jeśli ich wynik w skali onkotypowej jest niski, nie otrzymują one chemioterapii. Dodatkowo, wiele kobiet zostało zrekrutowanych do innych badań i zostało zasypanych prośbami o zapisanie się do dodatkowych badań. Co najważniejsze, stwierdziliśmy, że kobiety po ukończeniu długiego schematu leczenia chemioterapią i promieniowaniem były niechętne do udziału w dziewięciotygodniowym badaniu, które wymagało sześciu dodatkowych wizyt na uniwersytecie.

Dane fazy I sugerują, że Tv jest bezpieczną immunoterapią dla pacjentów z rakiem piersi, która może korygować defekty immunologiczne związane z radioterapią. W oparciu o nasze wyniki, terapia grzybem Tv podawanym doustnie w okresie po radioterapii może zwiększyć liczbę limfocytów i aktywność nowotworową komórek NK. Nawrót choroby po leczeniu pierwotnego raka piersi może być związany z defektami wrodzonego i adaptacyjnego układu odpornościowego. Badania prowadzone przez nasz ośrodek nadal wskazują, że Trametes versicolor stanowi nową terapię immunologiczną o znaczących zastosowaniach w leczeniu nowotworów.

Zatwierdzenie etyczne

Wszystkie przeprowadzane eksperymenty są zgodne z obowiązującym prawem w USA.

Konflikt interesów

Autorzy oświadczają, że nie mają konfliktu interesów.

Podziękowania

Praca ta była wspierana finansowo przez National Institutes of Health/National Center for Complementary and Alternative Medicine (U19 AT 1998) oraz Gateway for Cancer Research Grant no. G-04-002. Autorzy dziękują również za wsparcie edytorskie Rebekah Pratt z wydziału medycyny rodzinnej na U of MN oraz Danielowi Strenge za jego wkład.

.