Abstract
Oceniany był wpływ Arnica montana 6cH na indywidualną modulację kinetyki ostrego zapalenia u szczurów. Dorosłym samcom szczurów rasy Wistar wszczepiono 1% karagen na poduszkę stopy i podawano Arnica montana 6cH, deksametazon (4,0 mg/kg; kontrola pozytywna) lub 5% roztwór hydroalkoholowy (kontrola negatywna), per os, co 15 minut, pomiędzy 30 a 180 minutą po inokulacji substancji drażniącej. Procedury histopatologiczne i immunohistochemiczne zostały wykonane w celu uzyskania panelu komórek zapalnych pozytywnych dla CD3 (limfocyty T), CD45RA (limfocyty B), CD18 (integryna beta 2), CD163 (białko ED2), CD54 (ICAM-1) i MAC 387 (monocyty i makrofagi). Statystyczna obróbka danych obejmowała klasyfikację a posteriori zwierząt z każdej grupy () do dwóch podgrup prezentujących spontanicznie obrzęk przedwczesny lub późny. Zwierzęta, które prezentowały przedwczesny obrzęk były mniej odpowiedzialne na Arnica montana 6cH w odniesieniu do zmian hemodynamicznych. Natomiast szczury, które wykazywały późny obrzęk, prezentowały mniej intensywny obrzęk (), niższy odsetek degranulacji komórek tucznych () i wzrost średnicy naczyń limfatycznych (). Dane te sugerują indywidualną jakościową regulację zapalnych zdarzeń naczyniowych przez Arnica montana 6cH.
1. Wstęp
Jedną z najbardziej dyskutowanych kontrowersji dotyczących skuteczności leków homeopatycznych jest konieczność określenia idealnej analogii objawowej pomiędzy patogenezą pacjenta i leku, czyli konieczność indywidualnego przepisywania leków zgodnie z zasadą similia. Ta szczególna cecha jest jednym z najtrudniejszych wyzwań dla badań naukowych w tej dziedzinie ze względu na techniczną trudność jej eksperymentalnego wykazania. W istocie w literaturze można znaleźć niewiele badań eksperymentalnych na ten temat. Tak więc, eksperymentalne wykazanie tej cechy i zrozumienie jej mechanizmów może być użytecznym narzędziem do rozwiązania chronicznych kontrowersji dotyczących skuteczności homeopatii, często obserwowanych w badaniach klinicznych. Niedawno, eleganckie badanie in vitro wykazało znaczenie regulacyjnych i adaptacyjnych mechanizmów komórkowych w wielkości homeopatycznych środków wywołujących cytotoksyczne efekty na komórkach nowotworowych. Od 1997 do 2008 roku, rozwinęliśmy krok po kroku badania nad biologicznymi efektami homeopatycznej Arnica montana, szczególnie Arnica montana 6cH, używając modeli zwierzęcych. W skrócie, wyniki uzyskane w tych badaniach pokazują, że Arnica montana 6cH jest w stanie modulować ostry proces zapalny u szczurów, ponieważ może zwiększyć absorpcję obrzęku limfatycznego i miejscowy przepływ krwi, jak również promować migrację komórek wielojądrowych. Wszystkie te eksperymenty są chronologicznie opisane w .
Arnica montana jest rośliną należącą do rodziny Compositae, która rośnie na wzgórzach wschodniej i środkowej Europy. W jej liściach, kwiatach i korzeniach zidentyfikowano kilka aktywnych związków, takich jak alkohole, tanina, flawonoidy i laktony seskwirterpenowe, zwłaszcza helenalinę. Głównym działaniem helenaliny jest hamowanie czynnika transkrypcyjnego NFκβ, podobnie jak w przypadku steroidów kortykoidowych. Przypadkowe spożycie rośliny może powodować rozszerzenie naczyń krwionośnych, zastój krwi, krwotok, obrzęk i ból. Efekty te są główne tematy opisane w Arnica montana materia medica . Z tego powodu ból po urazach i wchłanianie obrzęków są głównymi wskazaniami do klinicznego i eksperymentalnego stosowania homeopatycznych preparatów Arnica montana. Ostatnio zaproponowano inne zastosowania wysoko rozcieńczonej Arnica montana, jak agronomiczne wykorzystanie Arnica w potencjach 3, 6, i 12cH do poprawy wzrostu roślin .
Celem obecnego badania było sprawdzenie dwóch hipotez: (a) putative modulacja naczyniowych i komórkowych wydarzeń w ostrym zapaleniu przez Arnikę, skupiając się na szybkości neutrofilów, monocytów, limfocytów T i B obecnych w miejscu zapalnym, oraz intensywności ekspresji cząsteczek adhezyjnych w zapalonej tkance łącznej, przy użyciu technik immunohistochemicznych i histomorfometrycznych; (b) putative ingerencja na wyjściach naturalnych indywidualnych wariacji kinetyki zapalenia.
2. Materiał i metody
2.1. Zwierzęta
Użyto dorosłych samców szczurów rasy Wistar, ważących od 250 do 300 g. Szczury były utrzymywane w konwencjonalnych laboratoryjnych klatkach polipropylenowych (5 do 7 zwierząt w klatce), z kontrolowaną temperaturą (25 ± 3°C) i cyklem oświetlenia (światła włączone od 06:00 AM do 06:00 PM). Wodę i pokarm podawano ad libitum. Przed rozpoczęciem eksperymentu, zwierzęta były losowo ważone, oddzielone i zidentyfikowane w trzech grupach po 20 szczurów każda.
2.2. Indukcja ostrego zapalenia
Ostry proces zapalny był indukowany przez podskórną inokulację 1% kappa karagenu (SIGMA) rozcieńczonego w sterylnej soli fizjologicznej do poduszki stopy, której grubość była uprzednio mierzona mikrometrem (MYTUTOYO).
Po 30 i 180 minutach dokonywano nowych pomiarów, w celu oceny ewolucji obrzęku przed i po leczeniu w funkcji czasu. Tak więc, pierwsze 30 minut mierzyło spontaniczne tworzenie się obrzęku, a pozostałe 150 minut mierzyło działanie leku, ponieważ leczenie było wykonywane po 30-minutowym pomiarze. Po 180 minutach zwierzęta poddawano eutanazji poprzez trakcję szyjną w głębokim znieczuleniu, a opuszki stóp pobierano i utrwalano w buforowanym 10% formaldehydzie przez 24 godziny – maksymalnie – przed obróbką przy użyciu konwencjonalnych technik histologicznych, w tym embedowania parafiny, barwienia hematoksyliną-eozyną i błękitem toluidyny. Te same bloczki parafinowe zostały użyte do przeprowadzenia procedur immunohistochemicznych. Dla każdego podnóżka wykonano jeden pojedynczy preparat.
2.3. Grupy i leczenie
Każda grupa szczurów była leczona określoną substancją, zgodnie z tabelą 1. Szczury, którym podawano Arnica montana 6cH (doświadczalne) i nie poddany działaniu 5% roztwór hydroalkoholowy (kontrola negatywna) uzyskany od tego samego dostawcy, były identyfikowane za pomocą kodów, w taki sposób, że wszystkie zabiegi i pomiary były wykonywane na ślepo. Kody te zostały stworzone przez technika laboratoryjnego, który nie brał udziału w badaniu i były przechowywane w zapieczętowanym arkuszu aż do analizy statystycznej, kiedy to zostały ujawnione.
|
|||||||||||||||||||||
Szczury leczone deksametazonem (kontrola pozytywna) zostały wykonane w sposób jawny, ze względu na cechy fizyczne użytego preparatu; był on zupełnie inny od homeopatycznego, a przez to łatwo rozpoznawalny. Leczenie i analizę mikroskopową próbek przeprowadzały dwie niezależne osoby, zawsze w ciemno. Całkowita dawka deksametazonu używana do wywołania efektów przeciwzapalnych wynosiła 4 mg/kg, zgodnie ze standardami określonymi wcześniej. Ten frakcjonowany protokół został zaprojektowany w celu odtworzenia zwykłego homeopatycznego warunku klinicznego leczenia ostrego zapalenia i był również stosowany w poprzednich badaniach przeprowadzonych przez naszą grupę. Deksametazon został wybrany jako pozytywna grupa kontrolna, ponieważ jego mechanizm działania naśladuje mechanizm działania helenaliny, głównej zasady aktywnej Arnica montana .
Komercyjna Arnica montana 6cH została przygotowana w 5% roztworze hydroalkoholowym przez aptekę certyfikowaną przez regulacyjną brazylijską Narodową Agencję Nadzoru Sanitarnego (ANVISA), Farmácia Sensitiva, São Paulo. Techniki stosowane w preparacie były zgodne z Brazilian Homeopathic Pharmacopea, 2nd Edition, 1997.
2.4. Analiza danych
Po pierwszym wykreśleniu intensywności obrzęku uzyskanego w okresie leczenia wstępnego (od zera do 30 minut), dane zostały sklasyfikowane w porządku półksiężycowym przy użyciu oprogramowania Excel 2003, w taki sposób, aby możliwe było podzielenie, dla każdej grupy, 10 szczurów (50%), które przedstawiły spontanicznie niższą intensywność obrzęku i 10 szczurów (50%), które przedstawiły wyższą intensywność obrzęku. W ten sposób utworzono dwie podgrupy po 10 zwierząt dla każdej grupy doświadczalnej, charakteryzujące dwie różne subpopulacje szczurów według wzorca kinetyki zapalenia (Tabela 2). Cały projekt eksperymentalny jest wyjaśniony na schemacie blokowym (rysunek 7).
|
|||||||||||||||||||||||||||
Ponieważ klasyczna krzywa obrzęku wywołanego karagenem kończy się do 6 godzin po inokulacji, wybór obu czasów (30 i 180 minut) był oparty na jego znanym plateau. Co więcej, wcześniejsze badania nad wpływem Arniki 6cH na obrzęk wywołany karagenem nie wykazują już żadnych efektów po tym okresie. Kinetyka oceny procesu zapalnego po wstrzyknięciu karagenu jest klasycznym modelem doświadczalnym opracowanym w latach 70. Jest to zatem godne zaufania kryterium, które należy zastosować w tym przypadku.
Po wykreśleniu danych (ryc. 1(a) i 1(b)), oba wzorce kinetyczne stały się łatwe do zidentyfikowania: (a) zwierzęta, które prezentowały mniej intensywny obrzęk podczas pierwszych wstępnych 30 minut miały szczyt pomiędzy 30 a 180 minutą (nazwane późnym obrzękiem) i (b) te, które prezentowały bardziej intensywny obrzęk w pierwszych 30 minutach zmniejszyły się po tym okresie (nazwane wczesnym obrzękiem).
(a)
(b)
(c)
(d)
(a)
(b)
(c)
(d)
Obrzęk (mm) w różnych grupach i podgrupach. (a) ewolucja obrzęku w funkcji czasu w podgrupie z obrzękiem wczesnym; (b) ewolucja obrzęku w funkcji czasu w podgrupie z obrzękiem późnym; (c) intensywność obrzęku na koniec eksperymentu w podgrupie z obrzękiem wczesnym; (d) intensywność obrzęku na koniec eksperymentu w podgrupie z obrzękiem późnym ; ANOVA, Tuckey-Krammer, w odniesieniu do kontroli. Wartości przedstawiają średnią ± odchylenie standardowe.
Wszystkie wyniki zostały porównane pomiędzy sześcioma podgrupami. Ten wybór a posteriori został dokonany w celu sprawdzenia roli indywidualnej idiosynkrazji w działaniu Arniki zgodnie z zasadą similii, ponieważ szybkość remisji obrzęków jest jednym z najbardziej znanych objawów Arnica montana opisanych w materia medica .
2.5. Analiza immunohistochemiczna
Wszystkie szkiełka przemywano 1 : 1 roztworem alkoholowo-eterowym w ciągu pięciu minut, a następnie suszono miękką kartką papieru i traktowano 1 : 10 poli-L-lizyną (SIGMA). Następnie na ich powierzchnię przenoszono 5 mikronowe, zatopione w parafinie plastry tkanek, używając łaźni histologicznej o temperaturze 40°C. Następnie poddawano je deparafinacji poprzez dwukrotną kąpiel w absolutnym ksylenie przez 2 minuty i dwukrotną kąpiel w absolutnym alkoholu przez 3 minuty. Następnie preparaty płukano w bieżącej wodzie wodociągowej.
W procedurach immunohistochemicznych pierwszy etap pobierania antygenów wykonywano poprzez obróbkę cieplną próbek. Szkiełka umieszczano w kąpieli buforowej cytrynianowej (SIGMA), pH = 6,0, zawierającej 0,5% tween 20 (DAKO), i ogrzewano w elektrycznym garnku w temperaturze 80°C (PANASONIC) przez 20 minut. Następnie szkiełka płukano w PBS, pH = 7,2 (SIGMA), przez 6 minut i osuszano miękką bibułą chłonną, a próbkę tkanki obrysowywano odpowiednim pisakiem (Pap-pen, AbCam).
Aktywność endogennej peroksydazy blokowano poprzez inkubację tkanek w 3% roztworze H2O2 rozcieńczonym w metanolu (ISOFAR), przez 15 minut w temperaturze pokojowej. Następnie płukano je w PBS (SIGMA) przez 6 minut i poddawano działaniu 2,5% normalnej surowicy końskiej (VECTOR) przez 20 minut w temperaturze 25°C, w celu zablokowania niespecyficznych miejsc wiążących białka. Natychmiast po tym etapie tkanki poddawano działaniu przeciwciał pierwotnych (patrz rozcieńczenia i specyfikacje w Tabeli 3) i pozostawiano na noc w temperaturze 4°C w wilgotnej komorze. Wszystkie rozcieńczenia przeciwciał pierwotnych zostały wykonane w 1% albuminie surowicy bydlęcej (BSA).
|
||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Następnego dnia skrawki płukano w PBS (sigma) przez 6 minut i poddawano działaniu przeciwciała drugorzędowego sprzężonego z polimerowo-peroksydazą (IMPRESS UNIVERSAL, VECTOR), w temperaturze 25°C przez 30 minut. Po ponownym płukaniu w PBS (6 minut), poddawano je działaniu DAB (DAKO) przez 3 sekundy, płukano ponownie w wodzie z kranu, barwiono hematoksyliną Harrisa (01 minuta) i montowano.
2.6. Histomorfometria
Do oceny odsetka degranulacji mastocytów liczono po dwieście komórek na szkiełku barwionym metodą błękitu toluidyny, stosując sąsiadujące pola, różnicując komórki zdegranulowane od niezdegranulowanych. W celu oceny średnicy naczyń limfatycznych, pięć przypadkowo wybranych pól oceniano przy użyciu obiektywu 200 x. Wykonywano fotomikrografy każdego pola (CANNON), a odsetek powierzchni naczyń limfatycznych w każdym polu określano za pomocą cyfrowego systemu analizy obrazu (Image Tool 3.0). Średnica naczyń limfatycznych może być uważana za dobry parametr do oceny absorpcji obrzęku limfatycznego, zgodnie z wcześniejszymi obserwacjami . Ponieważ protokół dotyczył ostrych zdarzeń, hipoteza limfangiogenezy nie była brana pod uwagę.
Dla markerów anty-CD45RA, CD3, CD18, CD163 i MAC 387 obserwowano dziesięć pól mikroskopowych wybranych przypadkowo na szkiełko, używając obiektywu immersyjnego (wielkość 1000 x). Obejmowały one prawie całą podskórną naczyniową tkankę łączną opuszki, a liczba komórek dodatnich w każdym polu była rejestrowana. W przypadku Anti-MAC 387 brano pod uwagę tylko jednojądrowe komórki dodatnie. Szkiełka barwione hematoksyliną-eozyną zostały wykorzystane do policzenia liczby komórek PMN na pole. W tym przypadku, rozpoznanie komórek zostało dokonane jedynie na podstawie kryteriów morfologicznych. Ekspresja CD163 jest proporcjonalna do dojrzewania makrofagów, z tego powodu wyniki te wyrażono jako stosunek CD163/MAC 387 komórek jednojądrowych dodatnich na pole.
Dla Anti-CD54, intensywność pozytywności na powierzchni komórek śródbłonka oceniano za pomocą systemu punktowego, wahającego się od 1 do 4. Pięć pól wybranych przypadkowo oceniano na slajdzie, używając obiektywu immersyjnego (wielkość 1000 x), a oceny dokonywało dwóch niezależnych obserwatorów, w sposób zaślepiony, aby uniknąć subiektywnej interpretacji w analizie. Ostateczny wynik dla każdego slajdu był równy sumie wyników cząstkowych. Kryteria oceny punktowej przedstawiono w tabeli 4.
|
||||||||||||||||||||||||
2.7. Analiza statystyczna
W pierwszej kolejności zastosowano test Bartletta w celu określenia rozkładu gaussowskiego większości punktów danych. Następnie przeprowadzono ANOVA/Tuckey-Krammer lub Kruskall-Wallis/Dunn, zgodnie z wynikami testu Bartletta. Ocenę degranulacji komórek tucznych oceniano natomiast za pomocą testu. Za istotne uznawano wartości równe. Wszystkie analizy statystyczne przeprowadzono przy użyciu oprogramowania INSTAT 3.
W odniesieniu do obrzęku przeprowadzono również dodatkową wewnątrzgrupową analizę statystyczną, a porównanie intensywności obrzęku pomiędzy podgrupami w 30 minucie (obrzęk spontaniczny) wykazało istotne różnice (Tuckey-Krammer, ), walidując zaproponowany projekt eksperymentu.
2.8. Kryteria bioetyczne
Protokół został zatwierdzony przez Komitet Bioetyczny Universidade Paulista (protokół 011/07), zgodnie z prawem stanu São Paulo nr 11.977/05 (kodeks ochrony zwierząt stanu São Paulo, Brazylia). Procedura ta jest zgodna z Europejską konwencją o ochronie zwierząt kręgowych wykorzystywanych do celów doświadczalnych i innych celów naukowych oraz z jej załącznikiem.
3. Wyniki
Aspekt histopatologiczny zapalonych poduszek stóp ujawnił klasyczne ramy typowego wczesnego ostrego zapalenia: obrzęk i naciek komórkowy odpowiadający 2/3 komórek PMN i 1/3 komórek jednojądrzastych. Biorąc jednak pod uwagę wewnątrzgrupową obróbkę statystyczną, można było stwierdzić istnienie różnych wzorców rozwoju procesu zapalnego w funkcji czasu (tab. 5 i 6). W związku z tym zaistniała konieczność usystematyzowania i sklasyfikowania tych wzorców przed analizą działania Arnica montana 6cH.
|
||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| amean ± odchylenie standardowe; milimetry. bmean ± odchylenie standardowe; piksele na pole. cmedian and interval; wyniki przypisane przez dwóch niezależnych obserwatorów. średnia ± odchylenie standardowe; komórki na pole. |
||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
|
||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| amean ± odchylenie standardowe; milimetry. bmean ± odchylenie standardowe; piksele na pole. cmediana i przedział; wyniki przypisane przez dwóch niezależnych obserwatorów. dmean ± odchylenie standardowe; komórki na pole. |
||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Zgodnie z tym, istotny efekt przeciwobrzękowy Arnica montana 6cH można było zaobserwować (ANOVA, ) tylko w podgrupie szczurów, u których szczyt obrzęku wystąpił pomiędzy 30 a 180 minutą po wstrzyknięciu karagenu do poduszki stopy (tzw. podgrupa późna) (Rycina 1). Również analiza histomorfometryczna preparatów barwionych błękitem toluidyny wykazała, że w podgrupie późnej obserwowano również mniej intensywną degranulację komórek tucznych (, ) oraz większą średnią średnicę naczyń limfatycznych (Kruskal-Wallis, ). Natomiast w podgrupie wczesnej (szczyt obrzęku przed 30 minutą) obserwowano jedynie dyskretny, ale istotny wzrost degranulacji komórek tucznych (, ), jak również wzrost punktacji ekspresji CD54 przez komórki śródbłonka (Kruskal-Wallis, ) (tabele 5 i 6, ryciny 2 i 5).
(a)
(b)
(a)
(b)
.
Histogram przedstawiający odsetek zdegranulowanych komórek tucznych i obszar limfatyczny (piksele) na pole. (a) podgrupa, która rozwinęła wcześniejszy obrzęk; (b) podgrupa, która rozwinęła późniejszy obrzęk. w stosunku do kontroli. **Kruskala-Wallisa, w odniesieniu do grupy deksametazonu.
Nie zaobserwowano różnic między grupami i podgrupami w zakresie migracji komórek, biorąc pod uwagę komórki PMN i wszystkie markery użyte w analizie immunohistochemicznej, w tym stosunek komórek CD 163+/MAC 387+ (tabele 5 i 6, ryciny 3, 4 i 5).
(a)
(b)
(a)
(b)
Histogram przedstawiający liczbę komórek MAC387 dodatnich na pole, stosunek CD163/MAC387 i liczbę komórek wielojądrowych na pole. (a) Podgrupa, która rozwinęła wcześniejszy obrzęk; (b) podgrupa, która rozwinęła późniejszy obrzęk. ANOVA, bez znaczenia.
(a)
(b)
(a)
(b)
Histogram przedstawiający liczbę komórek CD3 i CD45R dodatnich na pole. (a) podgrupa, w której obrzęk wystąpił wcześniej; (b) podgrupa, w której obrzęk wystąpił później. ANOVA, bez istotności.
(a)
(b)
(a)
(b)
Histogram przedstawiający liczbę komórek CD18 (integryna beta 2) dodatnich na pole oraz medianę (przedział) wyników znakowania CD54 (ICAM). (a) podgrupa, która rozwinęła wcześniejszy obrzęk; (b) podgrupa, która rozwinęła późniejszy obrzęk. ANOVA, bez istotności; *Kruskal-Wallis/Dunn, w odniesieniu do kontroli.
Zbierając wszystkie dane razem, można zilustrować główny wniosek wykresem rozproszenia intensywności obrzęku, na którym widać różne tendencje między grupami i podgrupami, po leczeniu Arnica montana 6cH (rysunek 6). Należy zauważyć, że zwierzęta leczone Arniką i wykazujące późny obrzęk (podgrupa późna) są przesunięte do linii podstawowej w stosunku do pozostałych grup.
(a)
(b)
(a)
(b)
.
Wykresy rozproszenia pokazujące różne tendencje ewolucji czasowej obrzęku pomiędzy obiema podgrupami. Białe punkty reprezentują kontrolę, czarne punkty reprezentują Arnica montana 6cH, a szare punkty reprezentują deksametazon. W każdej grafice oś – pokazuje obrzęk na 30 minut przed wstrzyknięciem karagenu, a oś – pokazuje obrzęk na koniec eksperymentu. LATE = podgrupa z późnym obrzękiem; EARLY = podgrupa z wczesnym obrzękiem. Należy zauważyć, że zwierzęta, które prezentowały późny szczyt obrzęku i były leczone Arnica montana 6cH są przesunięte do linii podstawowej w stosunku do innych grup.
Flowchart kroków doświadczalnych, określający dwie podgrupy szczurów zgodnie z kinetyką obrzęku.
4. Dyskusja
Wśród leków homeopatycznych, które mają szczególne znaczenie w zwalczaniu stanów zapalnych, Arnica montana jest jednym z najczęściej badanych. Niemniej jednak, w najnowszej literaturze naukowej na temat homeopatii, istnieje wiele badań mających na celu wykazanie skuteczności jej działania, ale niewiele prac poświęconych jest zrozumieniu fizjopatologicznych zmian w tkankach po ekspozycji zwierząt na te leki. Z tego punktu widzenia zbudowana została niniejsza praca; poprzez szczegółowe badanie tkanki łącznej objętej stanem zapalnym, z uwzględnieniem podzbiorów komórek, które do niej migrują, zachowania się naczyń oraz zależnej od czasu dynamiki tego procesu pod wpływem działania Arnica montana 6cH. Co ciekawe, niektóre zaobserwowane efekty są zgodne z wcześniejszymi obserwacjami, takimi jak udrożnienie naczyń limfatycznych i w konsekwencji zmniejszenie obrzęku. Pierwsze uzyskane tutaj wyniki wskazują na interesujący fakt: indywidualna analiza każdej podgrupy pokazuje znaczenie czasowości w działaniu Arnica montana 6cH; zwierzęta, które spontanicznie prezentowały późny szczyt obrzęku (po 30 minutach od wstrzyknięcia środka drażniącego) były bardziej wrażliwe na Arnikę niż zwierzęta, które prezentowały wczesny szczyt obrzęku (przed 30 minutami). W tym przypadku obrzęk był jeszcze mniej intensywny niż w grupach kontrolnych i leczonych deksametazonem, czemu towarzyszyło znaczne zmniejszenie degranulacji mastocytów i zwiększenie średnicy naczyń limfatycznych. Oba zjawiska mogą przyczynić się do zmniejszenia makroskopowego obrzęku i różnią się od wzorca deksametazonu, w którym obszar naczyń limfatycznych zmniejsza się biernie wraz ze zmniejszeniem obrzęku, jak pokazano na rycinie 2. Efekt ten potwierdza wyniki obserwowane wcześniej w .
Carrageenan jest polisacharydem otrzymanym z wodorostów Chondrus crispus, który ma zdolność do wywoływania miejscowego stanu zapalnego, bez skutków ogólnoustrojowych . Klasycznie wiadomo, że prostaglandyny są generowane podczas tworzenia obrzęku po podskórnym wstrzyknięciu karagenu przez migrujące neutrofile. Obserwacja efektu przeciwobrzękowego Arnica montana 6cH wyłącznie u zwierząt, które prezentowały późny wzorzec ostrego zapalenia, wskazuje na udział różnych mediatorów chemicznych w szlakach kontrolnych, jak wykazano wcześniej w . W tym sensie histamina i prostaglandyny, mediatory, których szczyt działania przypada na 15-30 minut, prawdopodobnie modulują ten proces w podgrupie z późnym obrzękiem, zamiast mediatorów o bardzo wczesnym działaniu, takich jak bradykinina, której szczyt działania przypada na około 10 minut po uwolnieniu .
Modele doświadczalne zaprojektowane specjalnie w celu wykazania znaczenia indywidualnej zmienności w działaniu leku homeopatycznego zostały opisane już wcześniej, ale nigdy w protokole zapalenia. Indywidualność oznacza specyficzność w medycynie homeopatycznej; w Rocha 2008 , tylko naturalnie nadpobudliwe szczury były odpowiedzialne za leczenie Rhus toxicodendron 200cH, w odniesieniu do ich zachowania w urządzeniu w otwartym polu. Z drugiej strony, Soares 2007 zaobserwował, że tylko hipoaktywne szczury były odpowiedzialne za Bryonia alba 200cH. Te uzupełniające się badania pokazują wyniki zgodne z odpowiednią materia medica. Systematyczne porównanie obu badań i innych jest postrzegane w .
Regarding do PMN i jednojądrzastych leukocytów podtypów migracji komórkowej, nie było widać różnicy między grupami i podgrup, ani CD163+/MAC387+ stosunek ujawnił żadnych zmian w dynamice dojrzewania makrofagów w miejscu zapalenia. CD 163 jest transmembranową glikoproteiną typu I, o masie 175 kD, znaną również jako białko ED2. Jej obecność została opisana na powierzchni dojrzałych makrofagów, ale także w mniej intensywny sposób w niedojrzałych monocytach i innych komórkach jednojądrzastych u ludzi. Ekspresja ED2 jest związana z metabolizmem żelaza i wzrasta w późniejszych fazach zapalenia, ponieważ komórki pozytywne pełnią rolę modulatora, uwalniając autokrynną IL10 . Obecność limfocytów T i B w miejscu zapalenia może być związana z pewnym działaniem modulującym, które zostało zasugerowane w poprzednich badaniach dotyczących Arnica montana 6cH, ale nie zostało potwierdzone w niniejszym dokumencie.
Wyrażenie cząsteczek adhezyjnych CD 54 (ICAM-1) było większe u zwierząt leczonych Arnica montana 6cH, które prezentowały wczesny wzorzec zapalenia i było związane z większym odsetkiem zdegranulowanych komórek tucznych w tkance zapalnej, ale nie z większą migracją leukocytów. Chociaż na tym etapie badania nie można było dokonać żadnego mechanistycznego wyjaśnienia, wydaje się, że wyniki globalne są podzielone na dwa główne wzorce: te regulujące dynamikę naczyniową, widoczne w podgrupie późnego obrzęku, i te regulujące zdarzenia komórkowe, widoczne w podgrupie wczesnego obrzęku, co sugeruje zależną od jednostki jakościową regulację naczyniowych i komórkowych zdarzeń zapalnych przez Arnica montana 6cH, jak widać na rycinie 6. Te różne wzorce zmienności, oscylujące w zależności od poprzedniego stanu badanego systemu biologicznego, zostały doświadczalnie opisane w innych kontekstach eksperymentalnych z różnymi preparatami homeopatycznymi .
Podsumowując, można podkreślić dwie proponowane hipotezy: (a) nie ma selektywnej modulacji migracji subsetów leukocytów przez leczenie Arnica montana 6cH, ale tylko naczyniowe regulacje, dotyczące absorpcji limfy, ekspresji CD54 i degranulacji histaminy i (b) jest wyraźna interferencja indywidualnej kinetycznej zmienności w naczyniowych wydarzeniach po leczeniu Arnica montana 6cH.
Konflikt interesów
Nie ma żadnego konfliktu interesów związanego z tą pracą.
Podziękowania
Autorzy dziękują CAPES-PROSUP Program i FAPESP Proc. nr 2007/59661-5 za wsparcie finansowe; Marcia Gutierrez z Farmacia Sensitiva za dostarczenie leków; Fernanda Ferrari, Paulo Ailton Valdovato i Lika Osugui za wsparcie techniczne.