Fluorescencja

Fluorescencja to luminescencja występująca najczęściej jako zjawisko optyczne w ciałach zimnych, w której molekularna absorpcja fotonu o określonej długości fali wywołuje emisję innego fotonu o dłuższej długości fali. Substancja, która fluoryzuje nazywana jest fluoroforem. Różnica energii pomiędzy zaabsorbowanymi i wyemitowanymi fotonami kończy się jako wibracje molekularne lub ciepło. Zazwyczaj zaabsorbowany foton znajduje się w zakresie ultrafioletu, a wyemitowane światło w zakresie widzialnym, ale zależy to od użytego fluoroforu i innych czynników.

Nazwa fluorescencji pochodzi od minerału fluorytu, składającego się z fluorku wapnia, który często wykazuje to zjawisko. Wiele innych minerałów i materiałów organicznych również fluoryzuje i są one wykorzystywane do wielu różnych zastosowań. Na przykład, fluorescencja jest przydatna do oświetlania i znakowania cząsteczek w chemii analitycznej i biochemii. Fluorofory są używane do znakowania komórek, przeciwciał i innych struktur biologicznych, a także do określania ich struktury i sposobu działania.

Przykłady materiałów fluorescencyjnych

Kamienie szlachetne, minerały, włókna i wiele innych materiałów, które można napotkać w kryminalistyce lub w związku z różnymi przedmiotami kolekcjonerskimi mogą mieć charakterystyczną fluorescencję lub mogą fluoryzować inaczej pod krótkofalowym ultrafioletem, długofalowym ultrafioletem lub promieniami X.

Wiele rodzajów kalcytu i bursztynu będzie fluoryzować pod krótkofalowym UV. Rubiny, szmaragdy i diament Hope Diamond wykazują czerwoną fluorescencję pod wpływem krótkofalowego promieniowania UV; diamenty emitują również światło pod wpływem promieniowania rentgenowskiego.

Ropa naftowa (ropa naftowa) fluoryzuje w szerokim zakresie kolorów, od matowego brązu dla ciężkich olejów i smoły do jasnego żółtawego i niebieskawego dla bardzo lekkich olejów i kondensatów. Zjawisko to jest wykorzystywane w wierceniach poszukiwawczych do identyfikacji bardzo małych ilości ropy w ścinkach wiertniczych i próbkach rdzeniowych.

Płyny organiczne, takie jak mieszaniny antracenu w benzenie lub toluenie, lub stilbenu w tych samych rozpuszczalnikach, fluoryzują pod wpływem promieniowania ultrafioletowego lub gamma. Czasy zaniku tej fluorescencji są rzędu nanosekund, ponieważ czas świecenia zależy od czasu życia stanów wzbudzonych materiału fluorescencyjnego, w tym przypadku antracenu lub stilbenu.

Zastosowania

Istnieje wiele naturalnych i syntetycznych związków, które wykazują fluorescencję, i mają one szereg zastosowań. Niektóre zwierzęta głębinowe, takie jak gągoł, wykorzystują fluorescencję.

Oświetlenie

Wspólna lampa fluorescencyjna opiera się na fluorescencji. Wewnątrz szklanej rurki znajduje się częściowa próżnia i niewielka ilość rtęci. Wyładowanie elektryczne w rurze powoduje, że atomy rtęci emitują światło. Emitowane światło jest w zakresie ultrafioletu (UV), jest niewidoczne i szkodliwe dla większości organizmów żywych. Rurka jest pokryta warstwą materiału fluorescencyjnego, zwanego luminoforem, który pochłania ultrafiolet i ponownie emituje światło widzialne. Oświetlenie fluorescencyjne jest bardzo energooszczędne w porównaniu do technologii żarowych, ale widmo produkowane może spowodować, że niektóre kolory pojawiają się nienaturalne.

W połowie lat 90-tych, białe diody emitujące światło (LED) stały się dostępne, które działają przez podobny proces. Zazwyczaj rzeczywisty półprzewodnik emitujący światło wytwarza światło w niebieskiej części widma, które uderza w związek luminoforu osadzony na chipie; luminofor fluoryzuje od zielonej do czerwonej części widma. Połączenie światła niebieskiego, które przechodzi przez luminofor i światła emitowanego przez luminofor wytwarza emisję netto światła białego.

Mówi się, że nowoczesne lampy uliczne z parami rtęci zostały wyewoluowane z lampy fluorescencyjnej.

Lampy jarzeniowe utleniają ester szczawianu fenylu do produkcji światła.

Kompaktowe oświetlenie fluorescencyjne (CFL) jest takie samo jak każda typowa lampa fluorescencyjna z zaletami. Jest samostateczny i używany do zastąpienia żarników w większości zastosowań. Wytwarzają one jedną czwartą ciepła na lumen jak żarówki i trwają około pięć razy dłużej. Żarówki te zawierają rtęć i muszą być traktowane i usuwane z ostrożnością.

Chemia analityczna

Fluorescencja w kilku długościach fali może być wykryta przez detektor matrycowy, do wykrywania związków z przepływu HPLC. Również płytki do chromatografii cienkowarstwowej (TLC) mogą być wizualizowane, jeśli związki lub odczynnik barwiący są fluorescencyjne.

Odciski palców mogą być wizualizowane za pomocą związków fluorescencyjnych, takich jak ninhydryna.

Biochemia i medycyna

Cząsteczki biologiczne mogą być znakowane fluorescencyjną grupą chemiczną (fluoroforem) za pomocą prostej reakcji chemicznej, a fluorescencja znacznika umożliwia czułe i ilościowe wykrywanie cząsteczki. Przykłady obejmują:

• Mikroskopię fluorescencyjną tkanek, komórek lub struktur subkomórkowych uzyskuje się przez znakowanie przeciwciała fluoroforem i umożliwienie przeciwciału znalezienia docelowego antygenu w próbce. Znakowanie wielu przeciwciał różnymi fluoroforami pozwala na wizualizację wielu celów w ramach jednego obrazu.
• Automatyzowane sekwencjonowanie DNA metodą terminacji łańcucha; każda z czterech różnych baz kończących łańcuch ma swój własny specyficzny znacznik fluorescencyjny. Gdy znakowane cząsteczki DNA są rozdzielane, etykieta fluorescencyjna jest wzbudzana przez źródło UV, a tożsamość zasady kończącej cząsteczkę jest identyfikowana na podstawie długości fali emitowanego światła.
• Detekcja DNA: związek bromek etydyny, gdy może swobodnie zmieniać swoją konformację w roztworze, ma bardzo małą fluorescencję. Fluorescencja bromku etydyny jest znacznie wzmocniona, gdy wiąże się on z DNA, dlatego związek ten jest bardzo przydatny do wizualizacji lokalizacji fragmentów DNA w elektroforezie w żelu agarozowym. Bromek etydyny może być toksyczny; bezpieczniejszą alternatywą jest barwnik SYBR Green.
• Mikromacierz DNA
• Immunologia: Przeciwciało ma dołączoną fluorescencyjną grupę chemiczną, a miejsca (np. na próbce mikroskopowej), w których przeciwciało się związało, można zobaczyć, a nawet określić ilościowo, dzięki fluorescencji.
• FACS (fluorescencyjnie aktywowane sortowanie komórek)
• Fluorescencja została wykorzystana do badania struktury i konformacji DNA i białek za pomocą technik takich jak rezonansowy transfer energii fluorescencji, który mierzy odległość na poziomie angstremów. Jest to szczególnie ważne w kompleksach wielu biomolekuł.
• Aequorin, z meduzy Aequorea victoria, wytwarza niebieską poświatę w obecności jonów Ca2+ (w wyniku reakcji chemicznej). Została ona wykorzystana do obrazowania przepływu wapnia w komórkach w czasie rzeczywistym. Sukces aequoryny zachęcił do dalszych badań nad A. victoria i doprowadził do odkrycia zielonego białka fluorescencyjnego (GFP), które stało się niezwykle ważnym narzędziem badawczym. GFP i pokrewne białka są używane jako reporter dla dowolnej liczby zdarzeń biologicznych, włączając w to takie rzeczy jak lokalizacja subkomórkowa. Poziomy ekspresji genów są czasami mierzone poprzez powiązanie genu do produkcji GFP z innym genem.

Również wiele cząsteczek biologicznych ma wewnętrzną fluorescencję, która może być czasami wykorzystywana bez potrzeby dołączania znacznika chemicznego. Czasami ta wewnętrzna fluorescencja zmienia się, gdy cząsteczka znajduje się w określonym środowisku, więc dystrybucja lub wiązanie cząsteczki może być mierzone. Bilirubina, na przykład, jest wysoce fluorescencyjna, gdy wiąże się ze specyficznym miejscem na albuminie surowicy. Protoporfiryna cynkowa, tworzona w rozwijających się czerwonych krwinkach zamiast hemoglobiny, gdy żelazo jest niedostępne lub obecny jest ołów, ma jasną fluorescencję i może być wykorzystywana do wykrywania tych problemów.

Od 2006 roku liczba zastosowań fluorescencji rośnie w biomedycynie biologicznej i naukach pokrewnych. Metody analizy w tych dziedzinach również się rozwijają, aczkolwiek z coraz bardziej niefortunnym nazewnictwem w postaci akronimów takich jak: FLIM, FLI, FLIP, CALI, FLIE, FRET, FRAP, FCS, PFRAP, smFRET, FIONA, FRIPS, SHREK, SHRIMP, TIRF. Większość z tych technik opiera się na mikroskopach fluorescencyjnych. Mikroskopy te wykorzystują źródła światła o dużej intensywności, zwykle lampy rtęciowe lub ksenonowe, diody LED lub lasery, do wzbudzenia fluorescencji w obserwowanych próbkach. Następnie filtry optyczne oddzielają światło wzbudzające od emitowanej fluorescencji, która jest wykrywana wzrokowo, za pomocą kamery (CCD) lub innych detektorów światła (rur fotopowielaczy, spektrografów, itp.). Prowadzonych jest wiele badań mających na celu poprawę możliwości takich mikroskopów, używanych sond fluorescencyjnych oraz zastosowań, w których są one wykorzystywane. Na szczególną uwagę zasługują mikroskopy konfokalne, które używają otworków w celu uzyskania przekroju optycznego – zapewniając ilościowy, trójwymiarowy widok próbki.

Bezpieczeństwo

Żarówki fluorescencyjne wytwarzają znacznie mniej ciepła odpadowego niż żarówki żarowe i halogenowe. Żarówki halogenowe są zamieszane w dużą liczbę pożarów, a żarówki żarowe również niosą większe ryzyko pożaru niż świetlówki, ze względu na ciepło odpadowe. Lampy mogą się przewrócić przypadkowo, a czasami w wyniku zdarzeń takich jak trzęsienia ziemi. Stosowanie żarówek fluorescencyjnych może być zatem środkiem zapobiegającym przypadkowym pożarom. Jednak żarówki fluorescencyjne mogą zawierać rtęć, a stłuczenie takiej żarówki mogłoby spowodować kosztowny wyciek rtęci.

Rozważania teoretyczne

Fotochemia

Fluorescencja występuje, gdy cząsteczka lub kropka kwantowa odpręża się do stanu podstawowego po elektronicznym wzbudzeniu.

Wzbudzenie: S 0 + h ν → S 1 {dla S_{0}+h ν → S_{1}}

Fluorescencja (emisja): S 1 → S 0 + h ν {displaystyle S_{1}+hnu do S_{0}} , gdzie h ν {displaystyle h} jest ogólnym terminem dla energii fotonu, gdzie: h = stała Plancka i ν {displaystyle \nu } = częstotliwość światła. (Konkretne częstotliwości światła wzbudzonego i emitowanego zależą od konkretnego układu.)

Stan S0 jest nazywany stanem podstawowym fluoroforu (cząsteczki fluorescencyjnej), a S1 jest jego pierwszym (elektronicznie) stanem wzbudzonym.

Cząsteczka w swoim stanie wzbudzonym, S1, może odprężyć się różnymi konkurencyjnymi drogami. Może przechodzić „nieradiacyjną relaksację”, w której energia wzbudzenia jest rozpraszana jako ciepło (wibracje) do rozpuszczalnika. Wzbudzone cząsteczki organiczne mogą również zrelaksować się poprzez konwersję do stanu trypletowego, który może następnie zrelaksować się poprzez fosforescencję lub przez wtórny krok relaksacji nieradiacyjnej.

Relaksacja stanu S1 może również wystąpić poprzez interakcję z drugą cząsteczką poprzez wygaszanie fluorescencji. Tlen molekularny (O2) jest niezwykle wydajnym wygaszaczem fluorescencji z powodu swojego niezwykłego trypletowego stanu podstawowego.

Molekuły, które są wzbudzone poprzez absorpcję światła lub poprzez inny proces (np. jako produkt reakcji) mogą przekazywać energię do drugiej „uwrażliwionej” molekuły, która jest przekształcana do swojego stanu wzbudzonego i może wtedy fluoryzować. Proces ten jest wykorzystywany w laskach świetlnych.

Wydajność kwantowa fluorescencji

Wydajność kwantowa fluorescencji podaje wydajność procesu fluorescencji. Definiuje się go jako stosunek liczby fotonów wyemitowanych do liczby fotonów zaabsorbowanych.

Φ = # p h o t o n s e m i t e d # p h o t o n s a b s o r b e d {{displaystyle \Phi ={frac {{rm {{ fotony wyemitowane}}{{rm {{ fotony zaabsorbowane}}}}

Maksymalna wydajność kwantowa fluorescencji wynosi 1,0 (100 procent); każdy foton zaabsorbowany powoduje emisję jednego fotonu. Związki o wydajności kwantowej 0,10 są nadal uważane za dość fluorescencyjne. Innym sposobem na określenie wydajności kwantowej fluorescencji jest określenie szybkości rozpadu stanu wzbudzonego:

k f ∑ i k i {frac {{k}_{f}}{{sum _{i}{k}_{i}}}}

gdzie k f {{displaystyle {k}_{f}} jest szybkością spontanicznej emisji promieniowania i

∑ i k i {displaystyle ∑sum _{i}{k}_{i}}

jest sumą wszystkich szybkości rozpadu stanów wzbudzonych. Inne szybkości rozpadu stanu wzbudzonego są powodowane przez mechanizmy inne niż emisja fotonów i dlatego często nazywane są „szybkościami nieradiacyjnymi”, które mogą obejmować: dynamiczne wygaszanie kolizyjne, oddziaływanie dipol-dipol w polu bliskim (lub rezonansowy transfer energii), konwersję wewnętrzną i krzyżowanie międzysystemowe. Tak więc, jeśli szybkość jakiejkolwiek ścieżki ulegnie zmianie, wpłynie to zarówno na czas życia stanu wzbudzonego, jak i na wydajność kwantową fluorescencji.

Wydajność kwantową fluorescencji mierzy się przez porównanie ze standardem o znanej kwantologii; sól chininy, siarczan chininy, w roztworze kwasu siarkowego jest powszechnym standardem fluorescencji.

Czas życia fluorescencji

Czas życia fluorescencji odnosi się do średniego czasu pozostawania cząsteczki w stanie wzbudzonym przed wyemitowaniem fotonu. Fluorescencja zwykle jest zgodna z kinetyką pierwszego rzędu:

= 0 e – Γ t , {displaystyle \left= \left_{0}e^{-\Gamma t},}

gdzie {displaystyle \left} jest stężeniem molekuł stanu wzbudzonego w czasie t {displaystyle t} , 0 {displaystyle \left_{0}} jest stężeniem początkowym, a Γ {{displaystyle \Gamma } jest szybkością rozpadu lub odwrotnością czasu życia fluorescencji. Jest to przykład rozkładu wykładniczego. Różne procesy radiacyjne i niepromieniotwórcze mogą spowodować zasiedlenie stanu wyjściowego. W takim przypadku całkowita szybkość rozpadu jest sumą wszystkich szybkości:

Γ t o t = Γ r a d + Γ n r a d {{tot}= Γ r a d + Γ n r a d {{nrad}}}

gdzie Γ t o t {displaystyle \Gamma _{tot}} jest całkowitą szybkością rozpadu, Γ r a d {{displaystyle \Gamma _{rad}} to szybkość rozpadu radiacyjnego, a Γ n r a d {{displaystyle \Gamma _{nrad}} szybkość rozpadu nieradiacyjnego. Jest to podobne do reakcji chemicznej pierwszego rzędu, w której stała szybkości pierwszego rzędu jest sumą wszystkich szybkości (model kinetyczny równoległy). Jeśli szybkość emisji spontanicznej lub którakolwiek z pozostałych szybkości jest duża, czas życia jest krótki. Dla powszechnie stosowanych związków fluorescencyjnych typowe czasy zaniku stanu wzbudzonego dla związków fluorescencyjnych emitujących fotony o energiach od UV do bliskiej podczerwieni mieszczą się w zakresie od 0,5 do 20 nanosekund. Czas życia fluorescencji jest ważnym parametrem dla praktycznych zastosowań fluorescencji, takich jak rezonansowy transfer energii.

Reguły

Istnieje kilka reguł, które dotyczą fluorescencji. Reguła Kashy-Vavilova mówi, że wydajność kwantowa luminescencji jest niezależna od długości fali promieniowania wzbudzającego.

Reguła ta nie zawsze obowiązuje i jest poważnie naruszana w wielu prostych cząsteczkach. Nieco bardziej wiarygodnym stwierdzeniem, choć nadal z wyjątkami, jest to, że widmo fluorescencji wykazuje bardzo małą zależność od długości fali promieniowania wzbudzającego.

Zobacz także

• Fluoresceina
• Lampa fluorescencyjna
• Światło
• Fosforescencja
• Promieniowanie X

• Lakowicz, Joseph R. 2006. Principles of Fluorescence Spectroscopy, 3rd ed. New York: Springer. ISBN 978-0387312781
• Turro, Nicholas J. 1991. Nowoczesna fotochemia molekularna. Mill Valley, CA: University Science Books. ISBN 0935702717
• Valeur, Bernard. 2002. Molecular Fluorescence: Principles and Applications. Weinheim: Wiley-VCH. ISBN 352729919X

All links retrieved April 14, 2017.

• Fluorophores.org The database of fluorescent dyes
• Fluorescence on Scienceworld
• Basic Concepts in Fluorescence

.