Het recente redactioneel van Dayan en Wraith in dit tijdschrift benadrukte de uitdagingen voor de ontwikkeling van nieuwe immunotherapieën na de rampzalige proef met TGN1412. In dit overzicht wordt een deel van de kennis gepresenteerd die is opgedaan in vele klinische proeven met anti-D en die relevant kan zijn voor translationele immunologie.
Preventie van hydrops foetalis of Rhesus hemolytische ziekte van de foetus en de pasgeborene (HDFN) door profylactische anti-D is de meest succesvolle klinische toepassing van antilichaam-gemedieerde immunosuppressie. HDFN ontstaat nadat een D-negatieve vrouw geïmmuniseerd wordt tegen foetale D-positieve rode bloedcellen na een foetomaternale bloeding (FMH); het geproduceerde IgG anti-D wordt via de placenta overgedragen en veroorzaakt vernietiging van foetale rode cellen door splenische macrofagen. In de jaren 1940, toen de oorzaak van deze ziekte voor het eerst werd onderkend, werd 1% van de baby’s met HDFN geboren en stierven 40% van hen. Anti-D is het meest voorkomende antilichaam dat hierbij betrokken is. Het RhD polypeptide op rode cellen is het meest immunogene van de bloedgroepantigenen omdat het afwezig is in cellen van D-negatieve personen die het RHD gen missen.
HDFN is nu zeldzaam, gedeeltelijk door verbeterde foetale en neonatale zorg maar hoofdzakelijk door preventie van primaire immunisatie van vatbare D-negatieve vrouwen door profylactisch IgG anti-D . Sinds 1968 wordt, na succesvolle klinische proeven in het VK en de VS, aan 10% van alle vrouwen postnataal anti-D toegediend, waardoor de incidentie van de ziekte met ongeveer 95% is gedaald. Minder dan 30 perinatale sterfgevallen per jaar worden nu veroorzaakt door HDFN. In 2002 heeft het National Institute of Health and Clinical Excellence (NICE) aanbevolen routinematig antenatale anti-D-profylaxe te geven aan alle D-negatieve vrouwen, naast postnatale profylaxe, om het immunisatiepercentage nog verder te verlagen. Intraveneus (IV) anti-D wordt nu ook therapeutisch gebruikt voor de behandeling van sommige D-positieve patiënten met immuun trombocytopenische purpura (ITP) . De vraag naar anti-D neemt dus toe.
Anti-D immunoglobuline wordt bereid uit samengevoegd hyperimmuun menselijk plasma. Jarenlang hebben problemen met de virologische veiligheid en, meer recentelijk, de variant van de ziekte van Creutzfeld-Jakob (vCJD) de zoektocht naar alternatieve leveringen gestimuleerd. In het VK is het plasma voor fractionering nu afkomstig van Noord-Amerikaanse donoren omdat men vreest dat Britse donoren latente dragers van vCJD zijn. Om de polyklonale anti-D-antilichamen uit menselijk plasma te vervangen door biotechnologische versies voor zowel diagnostisch als klinisch gebruik, zijn honderden monoklonale (mAb) of recombinante (rAb) anti-D-antilichamen geproduceerd. Zij zijn alle afgeleid van menselijke immunoglobulinegenen of B-cellen omdat muizen het RhD-antigeen niet herkennen. Er zijn verschillende expressiesystemen gebruikt, waaronder menselijke B-cellijnen, Chinese hamster ovarium (CHO) cellen, muis-mens heterohybridomas en rat myelomas.
Hoewel het exacte mechanisme van onderdrukking van D immunisatie door toediening van passieve IgG anti-D nog moet worden opgehelderd, is het bekend dat D-positieve rode cellen snel door macrofagen naar de milt worden afgevoerd via IgG Fc receptor (FcγR) interacties en niet-immunogeen worden gemaakt. Om er zeker van te zijn dat profylactische anti-D waarschijnlijk effectief is om D-immunisatie tot een grote FMH te voorkomen, worden vrouwen 2-3 dagen later getest om te controleren of foetale cellen uit de circulatie zijn geruimd . Anders hebben allogene rode cellen een lange overleving na FMH of transfusie. De ontwikkeling van alloimmuunreacties verloopt traag, gewoonlijk 5-15 weken voor anti-D . Dit is waarschijnlijk te wijten aan hun gebrek aan gevaarsignalen (van vreemde moleculen) zodat zij niet door het immuunsysteem worden herkend totdat zij senescent worden, wat dan hun fagocytose stimuleert via fosfatidylserinereceptoren . Zonder Rhesus-D-profylaxe wordt ongeveer 17% van de D-negatieve vrouwen geïmmuniseerd na een zwangerschap met een D-positieve foetus . Deze incidentie is lager dan voor doelbewust geïmmuniseerde normale proefpersonen (tot ongeveer 85% reageert ) omdat voor de meeste vrouwen de volumes FMH te klein zijn voor de rode cellen om immunogeen te zijn . Zwangere vrouwen kunnen robuuste alloimmuunreacties ontwikkelen terwijl ze hun semi-allogene foetus verdragen.
In de afgelopen 20 jaar zijn 19 anti-D mAbs en rAbs getest in 15 “first-in-man” studies. Deze werden onlangs herzien en worden hier samengevat. Er hebben zich geen ernstige bijwerkingen voorgedaan. In vitro biologische assays van FcγR-gemedieerde fagocytose en hemolyse met gebruikmaking van menselijke effectorcellen zijn goed ingeburgerd en werden gebruikt voor screening. In de klinische proeven werd het vermogen van de antilichamen beoordeeld om kleine volumes (minder dan 1%) D-positieve rode cellen uit de circulatie te verwijderen en in sommige studies werd vervolgens ook het vermogen van het anti-D om D-immunisatie te voorkomen bepaald. Veel van de mAbs en rAbs werden rechtstreeks vergeleken met polyklonale anti-D.
Er werd een grote heterogeniteit in de werkzaamheid van de antilichamen waargenomen (tabel 1). Twee mAbs afgeleid van menselijke B-lymfoblastoïde cellijnen, BRAD-3 en BRAD-5, bewerkstelligden een snelle klaring van de rode bloedcellen en verhinderden D-immunisatie bijna even effectief als polyklonaal anti-D, hoewel een drie- tot viermaal hogere dosis werd gebruikt. De plasmahalfwaardetijden van BRAD-3 en BRAD-5 waren normaal, maar de biologische beschikbaarheid was de helft van die van polyklonale anti-D . Wanneer deze antilichamen werden uitgedrukt als rAbs in CHO-cellen, was de klaring van autologe D-positieve rode cellen langzamer dan de oorspronkelijke mAbs . Een grote studie met een ander van CHO afgeleid anti-D rAb, MonoRho, gaf teleurstellende resultaten, waarbij de klaring van rode cellen uiterst variabel was, gewoonlijk zeer traag en zonder correlatie met de dosis van anti-D . De zeer lage biologische beschikbaarheid van MonoRho zou dit gedeeltelijk kunnen verklaren. De proefpersonen produceerden echter geen anti-D, hoewel zij geen challenge-injecties van D-positieve rode cellen kregen om hun D-immunisatiestatus te bepalen. MAbs geproduceerd door muriene myeloma cellijnen (als muis-mens heterohybridomas) vertoonden ook grote variabiliteit in rode cel klaring, maar onverwacht werd meer dan de helft van de ontvangers snel D geïmmuniseerd , tweemaal zoveel als zou gebeuren met rode cellen alleen . Deze anti-D’s hadden dus een adjuvante werking, waardoor de immuunrespons op D-positieve rode cellen werd versterkt in plaats van verhinderd, zoals de bedoeling was. Latere studies met anti-D rAbs, geproduceerd door myeloma cellen van ratten, toonden aan dat zij een zeer snelle klaring van autologe rode cellen bevorderden, sneller dan polyklonale anti-D . Het effect van het veranderen van de cellijn die FOG-1 tot expressie brengt van muis naar rat was opvallend, waarbij de klaring veranderde van zeer langzaam en onvolledig naar zeer snel. In de laatste studie ging dit gepaard met hemolyse, enige klaring naar de lever en koortsachtige reacties . Deze reacties treden niet op na profylaxe met polyklonale anti-D. Onverwacht was dat mutanten van FOG-1 rAb, die in vitro geen FcγR interacties hadden, ook een snelle klaring van rode cellen bewerkstelligden, hoewel een normale overleving was verwacht. Deze IgG anti-D’s moeten zich hebben gebonden aan andere receptoren dan IgG FcγR.
Tabel 1
Samenvatting van gegevens uit klinische proeven met polyklonale anti-D en anti-D mAbs en rAbs.
| Cel gebruikt voor expressie | Kloon | Snelheid van klaring van rode cel (nul tot snel: – tot +++++) | Effect op RhD-immunisatie | Reference |
|---|---|---|---|---|
| Human B | Polyclonal | Rapid, weinig variatie tussen proefpersonen (++++) | Voorkomen | |
| Humane B lymfoblastoïde cellijn | BRAD-3, BRAD-5 (mAbs) BRAD-3+BRAD-5 (mengsel) (mAbs) | Rapid, weinig variatie tussen proefpersonen, maar 3x hogere dosis dan polyklonale anti-D gebruikt (+++) | Voorkwam bij 90% van de proefpersonen | |
| CHO | BRAD-3+BRAD-5 (mengsel) (rAbs) | Lager dan mengsel van mAbs BRAD-3+BRAD-5 (++) | (Niet gedaan) | |
| CHO | MonoRho (rAb) | Zeer variabel tussen proefpersonen (+ tot +++) | Voorkomen? | |
| Muis myeloom | G7, G12, G17, G48 (mAbs) | Zeer variabel tussen proefpersonen (- tot ++++) | Verhoogd, snelle anti-D-respons | |
| Muis myeloom | AD1+AD3 (mAbs) | Snel en variabel (+) | Toename, snelle anti-D-respons | |
| Muis myeloom | FOG-1 (mAb) | Veeleer traag en variabel (+ tot ++) | (Niet gedaan) | |
| Rattenmyeloom | FOG-1 & mutanten (rAbs) | Extreem snel, zelfs bij afwezigheid van FcγR binding (+++++) | (Niet gedaan) | |
| Rattenmyeloom | R297 (rAb) | Extreem snel (+++++) | (Niet gedaan) |
Alle klinische trials varieerden, waardoor directe vergelijking moeilijk is.
Er werden onderzoeken uitgevoerd bij D-positieve (autologe) of D-negatieve personen, waarbij de rode cellen voor of na anti-D werden geïnjecteerd. De volumes rode cellen varieerden van 0-5 tot 15 ml. De doses anti-D verschilden (tussen 100 en 1800 µg) en anti-D werd toegediend op voorgecoate cellen of geïnjecteerd i.v. of i.m. Onderzoek naar de klaring werd uitgevoerd gedurende 1 uur tot 7 dagen, met verschillende tijdstippen voor het verzamelen van de monsters. Er werden één tot 94 proefpersonen ingeschreven. In sommige studies werden de klaringspercentages berekend.
Detectie van anti-D-reacties werd bepaald in monsters die om de 2 of 4 weken werden genomen of in één monster van 3 of 6 maanden; slechts in twee studies werden challenge-injecties met rode bloedcellen gegeven (secundaire immunisatie).
Veel van de anti-D mAbs en rAbs gedroegen zich niet als polyklonale anti-D. Geen enkele was even effectief en sommige van knaagdiercellijnen resulteerden zelfs in ongewenste immuunreacties. De in vivo reacties werden hoofdzakelijk bepaald door de soort cellijn die de antilichamen produceerde en niet door de eiwitsequenties. De oorzaak van deze onverwachte en mogelijk schadelijke reacties kan zijn dat de IgG anti-D geproduceerd uit dierlijke cellen interageerden met componenten van het aangeboren immuunsysteem. De meest waarschijnlijke verklaring is variatie in hun oligosaccharidesamenstelling.
Het type glycosylering van IgG hangt af van de cel waarin het wordt geproduceerd en is soortspecifiek. Structuren zoals N-glycolyl neuraminezuur en oligosachariden met een hoog mannosegehalte op IgG van knaagdieren kunnen als vreemd worden herkend door aangeboren immuunpatroonherkenningsreceptoren (PRR’s) met daaropvolgende pro-inflammatoire reacties. PRR’s omvatten cellulaire asialoglycoproteïne- en mannose-receptoren. Na binding van anti-D op D-positieve rode cellen hebben zij mogelijk antilichaamresponsen tegen het D-antigeen gestimuleerd. In plasma kan mannaanbindend lectine complementgemedieerde hemolyse veroorzaken wanneer het zich bindt aan mannoseresiduen van anti-D op een rode cel. Endogene IgG-antilichamen die galactose-α1,3-galactose op murine IgG herkennen, kunnen anti-D binden dat deze oligosaccharide tot expressie brengt. Recentelijk heeft endogeen IgE anti-galactose-α1,3-galactose overgevoeligheidsreacties veroorzaakt bij sommige patiënten die cetuximab (een immunotherapeuticum tegen kanker) toegediend kregen, geproduceerd in myeloom SP2/0-cellen van muizen. Het ontbreken van siaalzuur op veel anti-D mAbs en rAbs zou het IgG pro-inflammatoir maken wanneer het FcγR bindt.
Polyklonaal anti-D kan zowel gunstig als dodelijk zijn in verschillende klinische settings. De dosis rode bloedcellen die als doelwit dient, is een belangrijke factor. Het verwijderen van kleine volumes rode cellen, zoals bij FMH, is een “stil”, niet-inflammatoir, niet-hemolytisch proces. Indien echter een D-positieve persoon grote doses anti-D toegediend krijgt, zoals bij een foetus met RhD-hemolytische ziekte of, in zeldzame gevallen, ITP-patiënten die met IV anti-D behandeld worden, kan ernstige hemolyse optreden. In deze soms fatale gevallen zijn de bijkomende symptomen meestal hydrops (oedeem) bij HDFN en acute hemoglobinaemie, hemoglobinurie en gedissemineerde intravasculaire stolling bij ITP-patiënten. De meeste gevallen van acute hemolyse werden eerder te wijten geacht aan robuuste extravasculaire hemolyse (macrofaag gemedieerd) dan aan intravasculaire hemolyse. Zelfs zonder dergelijke ernstige bijwerkingen hebben ITP-patiënten niet zelden koorts en koude rillingen na infusie van IV anti-D, wat wijst op ontstekingsreacties. Indien ITP-patiënten dus zouden worden behandeld met ontstekingsbevorderende anti-D mAbs of rAbs in plaats van de huidige polyklonale anti-D, zou een complexe reeks van onbedoelde en potentieel gevaarlijke reacties kunnen volgen.
In de nasleep van de TGN1412 fase 1 studie kunnen sommige aspecten van de klinische proeven met anti-D nuttig zijn voor de toekomstige ontwikkeling en regulering van first-in-man studies van andere immunotherapeutica , vooral die welke gericht zijn tegen cellen in het bloed (tabel 2). De keuze van de startdosis is bijzonder belangrijk. In al het onderzoek bij mensen werden lage doses rode bloedcellen en anti-D gebruikt. In sommige studies, bijvoorbeeld voor BRAD-3 , werden autologe rode cellen (0-5 ml) ex vivo gecoat met anti-D, vervolgens gewassen en geïnjecteerd, waardoor de dosis antilichaam tot een minimum werd beperkt en de kans op bijwerkingen werd verkleind. De klaring van dergelijke kleine hoeveelheden rode cellen kon nauwkeurig worden gevolgd wanneer zij isotopisch werden gelabeld. Toen dit antilichaam veilig en doeltreffend bleek, werden anti-D en rode bloedcellen afzonderlijk geïnjecteerd om de klinische situatie beter na te bootsen. Aanwijzingen voor ontstekingsreacties met lage doses anti-D en rode bloedcellen moeten leiden tot voorzichtigheid bij opschalingsstudies.
Tabel 2
Opzet van klinische proeven van fase 1 met anti-D.
| Tests en analyses | Details en opmerkingen | Punten ter overweging voor toekomstige ontwikkeling |
|---|---|---|
| Preklinische diermodellen | Niet geschikt voor anti-D aangezien het RhD-antigeen beperkt is tot de mens | |
| In vitro bioassays | De selectie van kandidaat anti-D mAbs en rAbs is uitgevoerd met behulp van gevestigde tests van de functionele activiteit van FcγR. Bij de ontwikkeling van deze bioassays is uitgebreid samengewerkt in vier internationale workshops | Analyse van de proefgegevens wijst erop dat het nuttig zou zijn aanvullende bioassays te ontwikkelen om interacties van antilichamen (of met antilichamen gecoate cellen) met componenten van het aangeboren immuunsysteem te bestuderen, zowel voor anti-DD en voor andere geneesmiddelen die zich richten op het immuunsysteem |
| Dosis | De doses van zowel anti-D als D-positieve rode bloedcellen waren laag, zowel in de oorspronkelijke klinische experimenten die meer dan 40 jaar geleden werden uitgevoerd als in de recente proeven. Het was de bedoeling dat het anti-D de door FMH verworven rode cellen zou opruimen | In de fase 1-studie met TGN1412 was de toegediende hoeveelheid antilichaam veel te hoog en waren alle T-cellen doelwit, wat leidde tot de cytokinestorm. De dosis antilichaam en antigeen kon worden geminimaliseerd indien een monster cellen in vitro met het testantilichaam werd gecoat, gewassen en geïnjecteerd |
| Tracers | Het gebruik van 51chroom om rode doelcellen ex vivo te labelen maakte een zeer gevoelige bepaling van hun overleving mogelijk, weefselverdeling en hemolyse in vivo | 51chromium of andere radionucliden of fluorochromen zouden moeten worden overwogen in toekomstige studies van immunotherapeutica om zowel de doses te minimaliseren als de kwaliteit van de informatie uit trials te verbeteren |
| Doseringsinterval | In een anti-D studie uitgevoerd voordat economische overwegingen belangrijk waren, was het doseringsinterval tussen proefpersonen 1 week, zodat er tijd was om proefpersonen op bijwerkingen te controleren | De tijd tussen de toediening van proefstoffen aan vrijwilligers moet aanzienlijk langer zijn dan de paar minuten tussen proefpersonen in de TGN1412 proef |
| Antigeen-negatieve proefpersonen | Een mogelijk uniek voordeel van anti-D is dat nauwkeurige bepaling van de biologische beschikbaarheid, farmacokinetiek en de halfwaardetijd mogelijk is omdat D-negatieve personen het antigeen missen | |
| Glycosylering van IgG | Het is waarschijnlijk dat de niet-menselijke glycosylering van anti-D het eerder pro- dan anti-inflammatoir heeft gemaakt. Biologische effecten werden zelfs bij zeer lage doses waargenomen | De glycosylering van TGN1412 kan zijn activiteit in vivo hebben beïnvloed |
| Het delen van informatie | Het combineren van de resultaten van alle klinische trials was informatiever voor het analyseren van de immunologische activiteit van de anti-D antilichamen dan afzonderlijke studies alleen | Publicatie bevordert kennis |
In conclusie, de uitgebreide gegevens van humane studies van anti-D mAbs en rAbs suggereren dat hun glycosylering een krachtig effect zou kunnen hebben gehad bij het moduleren van hun in vivo activiteiten. Sommige rAbs verhoogden in plaats van te verlagen de incidentie van D-immunisatie, één veroorzaakte schadelijke hemolytische reacties en één had een extreem lage biologische beschikbaarheid. Deze effecten waren niet voorspeld op grond van de uitgevoerde in vitro-studies. Bij de ontwikkeling van recombinante glycoproteïnen voor humane therapie moet in de toekomst rekening worden gehouden met de mogelijkheid dat interacties tussen niet-menselijke oligosacchariden en andere cellen of moleculen dan het beoogde ligand kunnen optreden.