Observation of fertilized embryos to cleavage embryos
Since the first rabbit embryo culture was described in 1912 and mouse zygote could be cultured in vitro to form blastocyst stage embryos , is de kwaliteit van het embryo een belangrijke factor geworden voor zwangerschap na de overbrenging van in vitro embryo naar de baarmoeder omdat de kwaliteit van het embryo nauw samenhangt met de innesteling van het overgebrachte embryo in de baarmoeder. Sinds de geboorte van de eerste “reageerbuisbaby”, Louise Brown in juli 1978, waarvoor de Nobelprijs voor fysiologie of geneeskunde 2010 werd toegekend aan Robert Edwards voor de ontwikkeling van in-vitrofertilisatie (IVF) en embryotransplantatie (ET) voor de behandeling van onvruchtbaarheid bij vrouwen met niet-gepatenteerde eileiders, is de productie van in-vitroembryo’s (IVP) op grote schaal gebruikt voor de behandeling van onvruchtbaarheid bij de mens en voor de voortplanting en uitbreiding van de dierenpopulatie. Het succes van geassisteerde voortplantingstechnologie hangt echter voornamelijk af van de productie van levensvatbare embryo’s met een hoog implantatiepotentieel. Belangrijker nog, het kiezen van het beste embryo voor overbrenging is de grootste uitdaging geworden in IVF. In de vroege embryokweek was de beoordeling van de embryokwaliteit voornamelijk gebaseerd op de morfologische criteria van het overgeplaatste embryo. Seriële observatie van de morfologie van het embryo is dus een gebruikelijke techniek voor embryologen om embryo’s te evalueren en wordt beschouwd als een belangrijke voorspeller van implantatie en zwangerschap. Gedurende lange tijd voerden embryologen kwaliteits- en morfologiebeoordelingen van embryo’s uit door de embryo’s uit de incubator te halen en onder een microscoop te leggen. Naast morfologische observatie zijn de onderzoekers geïnteresseerd in een reeks studies over celkernverandering, genactivering en -expressie, cytoplasmatische eiwitexpressie, blastomeerdifferentiatie, enzovoort. Deze studies leiden echter vaak tot de dood van embryo’s. Bijvoorbeeld, in onze vroege studie die microspindel verandering waargenomen na de sperma-ingang in het ei of de activering van de eicel, de bevruchte zygotes of geactiveerde eieren moesten worden gefixeerd op de dia en gekleurd met immunocytochemische fluoresceïne en laser confocale microscopie . Ons onderzoek toonde duidelijk de verandering van microtubule en chromatine aan na activering van de runderocyt en introcytoplasmatische sperma injectie (ICSI; figuur 1). Het sperma in de oöcyt of calciumionofoor en ethanol kan de oöcyt activeren en extrusie van het tweede polaire lichaam veroorzaken. Om het tijdstip van het tweede polaire lichaam te observeren, kleurden we verschillende stadia van oöcyten na activering. Het resultaat toonde aan dat na 5 uur postactivering, het tweede polaire lichaam volledig kan worden geëxtrudeerd (figuur 2).
Laser-scanning confocale microscopie van spindel- en chromatineveranderingen op verschillende tijdstippen na de activering en de intracytoplasmatische sperma-injectie (ICSI) bij runderen. Hoofdletters (links) geven de verandering na de activering aan en kleine letters (rechts) geven aan na ICSI. A/a is 0,5 uur, B/b is 2 uur, C/c is 3 uur, en D/d is 7 uur na activering of ICSI. De prenucleus in het geactiveerde ei en de prenuclei in het ICSI-ei zijn rood gekleurd.
Figuur 2.
Laser-scanning confocale microscopie van spindel- en chromatineveranderingen op de verschillende tijdstippen na activering bij runderen. Om 0,5 uur na activering beginnen de chromosomen van de spindel zich te delen, en de voltooiing van de spindeldeling duurt ongeveer 3 uur en het tweede polaire lichaam kan na ongeveer 5 uur worden geëxtrudeerd. De rode en groene punten samen geven de spindel aan, en de rode punt geeft het eerste polaire lichaam aan.
Om genexpressie te bestuderen moet vaak mRNA of eiwit uit embryo’s worden geïsoleerd; vandaar dat embryo’s moeten worden gelyseerd en geen enkel embryo zou overleven. Om de celdifferentiatie bij morele en blastocyststadiumembryo’s te bestuderen, is een methode van dubbele kleuring met fluoresceïnemicroscopie gebruikt om de binnenste celmassa (ICM) te onderscheiden van het trofoectoderm (TE). De aantallen van twee verschillende cellen kunnen worden geteld op basis van verschillende kleuren (ICM als blauw en TE als roze, figuur 3).
Figuur 3.
Het onderscheiden van verschillende cellen in runder blastocyst embryo’s met dubbele kleuring. Bovenste figuur toont een blastocyst embryo met gemarkeerde binnenste celmassa (ICM) en rond trophectoderm cellen (TE). Onderste figuur toont dubbelgekleurde runder blastocyst embryo met blauw als ICM en roze als TE cellen. De bovenste foto is afkomstig van een zoekactie op een webpagina, en de auteur stelt de hoffelijkheid van Prof. Fuliang Du voor de ongepubliceerde onderste foto zeer op prijs.
Deze onderzoeksmethoden beschadigen uiteindelijk alle embryo’s, en het is onmogelijk om deze methoden in de klinische praktijk toe te passen. Daarom is de huidige beoordeling van de embryokwaliteit voornamelijk gebaseerd op de morfologische criteria van overgebrachte embryo’s, die drie belangrijke parameters omvatten, zoals de regelmatigheid van de blastomeren, de fragmentatie en de cytoplasmakorreligheid. Ook het aantal embryocellen op verschillende kweekdagen en de multinucleariteit kunnen in aanmerking worden genomen om de embryokwaliteit te evalueren. Verschillende rapporten hebben het verband aangetoond tussen de morfologische kenmerken van embryo’s in het splitsingsstadium en zwangerschapssucces. Dit is momenteel dan ook de basismethode voor de beoordeling van de embryokwaliteit bij IVF bij de mens en bij de productie van in vitro embryo’s bij dieren. Hoewel deze methode gemakkelijk kan worden toegepast, moeten de embryo’s vaak uit de incubator worden gehaald, wat tot bezorgdheid leidt over de veiligheid en de stabiliteit van de kweekomstandigheden. Ook is het mogelijk dat bij de observatie enkele belangrijke punten van de embryonale ontwikkeling worden gemist. De evaluatie van gekliefde embryo’s tijdens de kweek en vóór de embryotransfer is een belangrijke klinische praktijk. Momenteel bestaat de belangrijkste evaluatie van in vitro bevruchte embryo’s uit visuele observatie met behulp van microscopie. De laatste jaren worden verschillende incubators met time-lapse microscopie gebruikt in IVF klinieken om alle stappen van de groei en ontwikkeling van embryo’s te volgen. Hoewel pre-implantatie embryo diagnose en screening (PGD/PGS) technologieën zijn toegepast in de menselijke embryo selectie praktijk om het zwangerschapspercentage te verbeteren, zijn deze technieken invasief voor embryo’s. Het vinden van een andere niet-invasieve methode om een goed embryo te selecteren zal zeer nuttig zijn in de menselijke ART praktijk. Sallam et al. hebben de niet-invasieve methoden voor embryoselectie onder de loep genomen en deze methoden geëvalueerd in het licht van het beste momenteel beschikbare bewijsmateriaal om na te gaan of een van deze methoden rijp is om de aloude methode van morfologische beoordeling te vervangen of aan te vullen. Er zijn dus krachtigere hulpmiddelen nodig om de morfokinetische merkers van embryo’s te schatten.
2.1. Embryo splitsing morfokinetiek op basis van time-lapse beeldvorming
Tientallen jaren hebben onderzoekers geprobeerd om de ontwikkeling van meercellige organismen van bevruchte eieren tot volwassenen te volgen. Terwijl wetenschappers hadden onderzocht individuele stappen van dit proces, geen methode bestond om hen in staat stellen om het hele proces van ontwikkeling model live. Dankzij de vooruitgang op het gebied van de lichtmicroscopie, waarvan in twee Nature Methodspapers verslag is gedaan, kunnen onderzoekers de vroege ontwikkeling nu zeer gedetailleerd in beeld brengen. Recente lichtplaatmicroscopen gebruiken een vel laserlicht om een dunne doorsnede van een monster te verlichten en het hele vlak in één momentopname vast te leggen. Hierdoor kunnen ze veel minder licht gebruiken dan confocale of twee-fotonmicroscopen. De microscoop is zeer snel maar ook zeer zacht en kan op meerdere kritische punten tegelijk zeer goed presteren. Voor de beeldvorming van de ontwikkeling van hele embryo’s zoals die van Drosophila, zebravis, en muizen, deze nieuwe multiview imaging techniek is fantastisch.
Time-lapse imaging is een andere niet-invasieve, opkomende technologie die het mogelijk maakt 24 uur per dag toezicht op de ontwikkeling van embryo’s, biedt de mogelijkheid van een grotere kwantiteit en kwaliteit van de morfologische informatie zonder verstoring van de cultuur voorwaarde . De time-lapse microscoop is zeer nuttig voor de observatie van de embryonale ontwikkeling. In het laatste decennium zijn veel IVF-klinieken en -centra begonnen met het gebruik van time-lapse beeldvorming om de groei en deling van embryo’s tijdens de in vitro cultuur te volgen en uiteindelijk op basis van de geregistreerde gegevens en foto’s embryo’s van goede kwaliteit te selecteren voor overdracht. Deze techniek is gemeld te kunnen overgebrachte embryo implantatie en zwangerschap te verbeteren. Op basis van time-lapse opnamen van embryo splitsing kan de normale snelheid van embryo splitsing worden bepaald. Zo is in het tweede hoofdstuk van dit boek de timing van de embryosplitsing geschetst op basis van morfokinetische markers door de time-lapse monitor. Aan de hand van dit tijdschema voor de splitsing van embryo’s kunnen embryologen duidelijk weten in welk stadium een embryo zich op verschillende tijdstippen moet bevinden. Zo kan een embryo van optimale kwaliteit of een embryo met een hoog implantatiepotentieel worden geselecteerd voor overbrenging om een hoger zwangerschapspercentage te verkrijgen. Met behulp van time lapse continu en frequent opnamesysteem, kunnen sommige morfokinetische markers worden onthuld in time-lapse systeem. Zo leidt een snelle deling van embryocellen op een bepaald moment vaak tot een lager implantatiepercentage. In de normale situatie neemt de deling van zygote in 2-3 cellen ongeveer 10-11 uur in beslag, maar Rubio et al. ontdekten dat sommige embryo’s slechts ongeveer 5 uur nodig hebben om deze deling te voltooien, en deze embryo’s hebben een veel lager implantatiepercentage dan embryo’s met een normale deling (1,2% vs 20%). Ook ongelijke splitsing van embryo’s, gedefinieerd als een abruptie van één blastomeer in drie dochterblastomeren of een interval van de celcyclus van minder dan 5 uur, leidt vaak tot een aanzienlijk lager implantatiepotentieel. We kunnen dus deze meer precieze morfokinetische merkers gebruiken om de embryokwaliteit te onderscheiden.
In het derde hoofdstuk wordt verder onderzocht en geverifieerd of time-lapse beeldvormingstechnologie nuttig is voor de selectie van embryo’s van “topkwaliteit” voor overbrenging om het ART-resultaat te verbeteren, in plaats van de conventionele morfologische evaluatie. Interessant is dat de mogelijke correlaties tussen het geslacht van het embryo, fragmentatie van het embryo, behandelingsprotocollen, verschillende kweekmedia en morfokinetiek van het embryo zijn geëvalueerd op basis van enkele nieuwe onderzoeken naar time-lapse beeldvormingsfaciliteiten. Verder worden ook verschillende algoritmen en voorspellende modellen besproken die zijn ontworpen in ART-cycli met time-lapse beeldvorming. Bijvoorbeeld, veel onderzoek naar de snelheid van de embryonale ontwikkeling bij dieren en mensen door gewone morfologische observatie toonde aan dat mannelijke embryo’s sneller groeien dan vrouwelijke embryo’s . Echter, de huidige time-lapse beeldvorming observatie kan meer detail en exacte informatie over het verschil in mannelijke en vrouwelijke embryo’s tijdens de vroege divisies. Hoewel vrouwelijke embryo’s vertoonden late splitsing (t8), morula (tM), en blastocyst stadium morfokinetische parameters, presenteerden ze eerder uitbreiding dan mannetjes. De belangrijkste tijdstippen van observatie zijn dus gerelateerd aan de ontwikkeling van het geslacht van het embryo. Interessant is dat de auteurs een model ontwierpen op basis van het tijdstip van tweede synchronie en morula vorming met vier subgroepen om de waarschijnlijkheid te voorspellen dat een embryo vrouwelijk is.
Om de morfokinetiek van embryo splitsing verder te bestuderen en te verkennen, bespreekt het vierde hoofdstuk enkele methoden voor spatiotemporele analyse van embryo splitsing in vitro.Geautomatiseerde of semi-geautomatiseerde time-lapse analyse van beelden van embryo’s in het vroege stadium van de splitsing kan inzicht geven in de timing van mitose, de regelmatigheid van zowel delingstijdstip en -patroon, als in de cellijn. Gelijktijdige monitoring van moleculaire processen maakt het mogelijk verbanden te bestuderen tussen genetische expressie en celfysiologie en -ontwikkeling. Met behulp van time-lapse beeldvormingsgegevens en analytische software kan op eenvoudige wijze een vierdimensionale videosequencing van embryo’s worden gemaakt, zodat groeiende embryo’s nieuwe inzichten geven in de temporele ontwikkeling van embryo’s. In dit hoofdstuk beschrijven de auteurs drie methoden met variaties in hardware en software analyse door het geven van enkele voorbeelden van de uitkomsten om een venster te openen naar nieuwe informatie in de ontwikkelingsembryologie, zoals embryo divisie patroon en lineage worden bestudeerd in vivo.
2.2. Genexpressie van cleavage embryo en niet-invasieve beoordeling van embryo levensvatbaarheid via kweekmedia analyse
Preimplantatie embryo ontwikkeling ervaart een reeks van kritische gebeurtenissen en opmerkelijke epigenetische modificaties, en herprogrammering van genexpressie optreedt om het embryonale genoom te activeren. In de vroege stadia van de preimplantatie embryonale ontwikkeling, maternale mRNAs sturen embryonale ontwikkeling. Tijdens de vroege embryonale ontwikkeling wordt een differentieel methyleringspatroon gehandhaafd, hoewel sommige fase-specifieke veranderingen vertonen. Recente studies hebben aangetoond dat een differentieel demethyleringsproces resulteert in een differentiële ouderlijke genexpressie in de vroeg ontwikkelende embryo’s, die een impact kan hebben op de correcte ontwikkeling. Ook is aangetoond dat niet-coderende RNA’s, lange niet-coderende RNA’s (lncRNA), en korte niet-coderende RNA’s, microRNA’s (miRNA’s) een belangrijke rol spelen bij de regulatie van mRNA’s, en daarom heeft hun rol in de preimplantatie ontwikkeling aan betekenis gewonnen. Hoofdstuk vijf bespreekt de verschillende factoren die de genexpressie tijdens de ontwikkeling van preimplantatie-embryo’s beïnvloeden, waaronder epigenetische factoren, met de nadruk op methylatieprofielen, van gameten en preimplantatie-embryo’s. De effecten van niet-coderende RNA’s op de genexpressie werden grondig geëvalueerd.
Omdat de genexpressie tijdens de ontwikkeling van het embryo in een in vitro cultuur verschijnt, hebben preimplantatie-embryo’s vaak rijke voedingscultuurmedia nodig. Het embryo moet tijdens zijn groei en ontwikkeling enkele belangrijke voedingscomponenten uit het kweekmedium opnemen en metabolisch enkele bijproducten als genexpressieresultaten produceren. Vanuit dit oogpunt biedt het in vitro kweken van embryo’s ook een zeer belangrijk materiaal voor verdere niet-invasieve embryo-evaluatie door middel van het onderzoeken van biomarkers in het gebruikte embryocultuurmedium. De thans ontwikkelde methoden zijn toegespitst op de meting van metabolische verbindingen die door zich ontwikkelende embryo’s worden afgescheiden. Bij deze studies wordt vooral gebruik gemaakt van de instrumenten van de moderne analytica en proteomica. Sommige studies suggereren dat metabole profilering van embryo kweekmedia met behulp van optische en niet-optische spectroscopieën een nuttige aanvulling kan vormen op de huidige embryo beoordelingsstrategieën en inzicht kan verschaffen in het fenotype van embryo’s met een toenemend reproductief potentieel .
In het zesde hoofdstuk beschrijven de auteurs hun nieuwe ontdekking, de alpha-1 keten van het menselijke haptoglobine molecuul als een kwantitatieve biomarker van embryo levensvatbaarheid. In een reeks retrospectieve, blinde experimenten werd een succespercentage van meer dan 50% bereikt. Dit hoofdstuk geeft een overzicht van de momenteel beschikbare metabole en proteomische benaderingen voor de niet-invasieve moleculaire beoordeling van de levensvatbaarheid van embryo’s. Recente studies hebben aangetoond dat de beoordeling van de moleculaire componenten van voedingsbodems een veelbelovend gebied is in de zoektocht naar de markers van succesvolle embryo implantatie met de daaropvolgende ontwikkeling van een klinische zwangerschap en de geboorte van een gezonde baby om de efficiëntie van de behandeling met behulp van ART technieken te verbeteren . Als de moleculaire samenstelling van kweekmedia kan worden gebruikt als een aanvullende niet-invasieve procedure om een embryo te kiezen voor selectieve overdracht, zal het zeer nuttig zijn om de menselijke IVF zwangerschapsuitkomst te verbeteren.