Fluorescentie

Fluorescentie is een luminescentie die vooral voorkomt als optisch verschijnsel in koude lichamen, waarbij de moleculaire absorptie van een foton bij een bepaalde golflengte de emissie van een ander foton met een langere golflengte teweegbrengt. De stof die fluoresceert wordt een fluorofoor genoemd. Het energieverschil tussen de geabsorbeerde en uitgezonden fotonen komt terecht in de vorm van moleculaire trillingen of warmte. Gewoonlijk ligt het geabsorbeerde foton in het ultraviolette bereik en het uitgezonden licht in het zichtbare bereik, maar dit hangt af van de gebruikte fluorofoor en andere factoren.

Fluorescentie is genoemd naar het mineraal fluoriet, dat bestaat uit calciumfluoride, en dat dit verschijnsel vaak vertoont. Een verscheidenheid van andere mineralen en organische materialen fluoresceren ook, en zij worden gebruikt voor een aantal verschillende toepassingen. Fluorescentie is bijvoorbeeld nuttig voor het oplichten en markeren van moleculen in de analytische chemie en de biochemie. Fluorophoren zijn gebruikt om cellen, antilichamen en andere biologische structuren te labelen, en om hun structuren en werkingsmechanismen te bepalen.

Voorbeelden van fluorescerende materialen

Gedelstenen, mineralen, vezels, en vele andere materialen die in forensisch onderzoek of in verband met diverse verzamelobjecten worden aangetroffen, kunnen een kenmerkende fluorescentie hebben of verschillend fluoresceren onder korte golf ultraviolet, lange golf ultraviolet, of röntgenstraling.

Veel soorten calciet en barnsteen zullen fluoresceren onder korte golf UV. Robijnen, smaragden en de Hope Diamond vertonen rode fluorescentie onder korte golf UV-licht; diamanten zenden ook licht uit onder röntgenstraling.

Crude oil (petroleum) fluoresceert in een reeks van kleuren, van dof bruin voor zware oliën en teer tot helder geelachtig en blauwachtig wit voor zeer lichte oliën en condensaten. Dit verschijnsel wordt gebruikt bij olie-exploratieboringen om zeer kleine hoeveelheden olie in boorgruis en boorkernmonsters te identificeren.

Organische vloeistoffen zoals mengsels van antraceen in benzeen of tolueen, of stilbenen in dezelfde oplosmiddelen, fluoresceren bij bestraling met ultraviolet- of gammastralen. De vervaltijd van deze fluorescentie is van de orde van nanoseconden aangezien de duur van het licht afhangt van de levensduur van de aangeslagen toestanden van het fluorescerende materiaal, in dit geval antraceen of stilbeen.

Toepassingen

Er zijn vele natuurlijke en synthetische verbindingen die fluorescentie vertonen, en zij hebben een aantal toepassingen. Sommige diepzeedieren, zoals de Greeneye, maken gebruik van fluorescentie.

Verlichting

De gewone fluorescentiebuis berust op fluorescentie. In de glazen buis bevindt zich een gedeeltelijk vacuüm en een kleine hoeveelheid kwik. Een elektrische ontlading in de buis zorgt ervoor dat de kwikatomen licht uitstralen. Het uitgestraalde licht ligt in het ultraviolette (UV) gebied, is onzichtbaar en schadelijk voor de meeste levende organismen. De buis is bekleed met een coating van een fluorescerend materiaal, fosfor genaamd, dat het ultraviolet absorbeert en weer zichtbaar licht uitstraalt. Fluorescentieverlichting is zeer energie-efficiënt in vergelijking met gloeilamptechnologie, maar de geproduceerde spectra kunnen bepaalde kleuren onnatuurlijk doen lijken.

In het midden van de jaren negentig kwamen witte lichtemitterende diodes (LED’s) beschikbaar, die werken via een soortgelijk proces. Gewoonlijk produceert de eigenlijke lichtgevende halfgeleider licht in het blauwe deel van het spectrum, dat een op de chip afgezette fosforverbinding treft; de fosfor fluoresceert van het groene tot het rode deel van het spectrum. De combinatie van het blauwe licht dat door de fosfor gaat en het licht dat door de fosfor wordt uitgestraald, produceert een netto emissie van wit licht.

De moderne kwikdampstraatlantaarn zou zijn geëvolueerd uit de fluorescentielamp.

Glowsticks oxideren fenyloxalaat ester om licht te produceren.

Compacte fluorescentieverlichting (CFL) is hetzelfde als elke typische fluorescentielamp met voordelen. Het is zelf-geballast en wordt gebruikt om gloeilampen te vervangen in de meeste toepassingen. Zij produceren een kwart van de warmte per lumen als gloeilampen en gaan ongeveer vijf keer zo lang mee. Deze lampen bevatten kwik en moeten met zorg worden behandeld en verwijderd.

Analytische chemie

Fluorescentie in verschillende golflengten kan worden gedetecteerd door een array-detector, om verbindingen van HPLC-stroom te detecteren. Ook kunnen dunne laag chromatografie (TLC) platen worden gevisualiseerd als de verbindingen of een kleurend reagens fluorescerend is.

Vingerafdrukken kunnen worden gevisualiseerd met fluorescerende verbindingen zoals ninhydrine.

Biochemie en geneeskunde

Biologische moleculen kunnen worden getagd met een fluorescerende chemische groep (fluorofoor) door een eenvoudige chemische reactie, en de fluorescentie van de tag maakt gevoelige en kwantitatieve detectie van de molecule mogelijk. Voorbeelden zijn:

• Fluorescentiemicroscopie van weefsels, cellen of subcellulaire structuren wordt bereikt door een antilichaam te labelen met een fluorofoor en het antilichaam in staat te stellen zijn doelantigeen in het monster te vinden. Door meerdere antilichamen met verschillende fluoroforen te labelen, kunnen meerdere doelwitten in één beeld worden gevisualiseerd.
• Geautomatiseerde sequenering van DNA door middel van de “chain termination”-methode; elk van de vier verschillende basen die de keten afsluiten, heeft zijn eigen specifieke fluorescerende label. Wanneer de gelabelde DNA-moleculen worden gescheiden, wordt het fluorescerende label geëxciteerd door een UV-bron, en de identiteit van de base die het molecuul afsluit, wordt geïdentificeerd aan de hand van de golflengte van het uitgezonden licht.
• DNA-detectie: de verbinding ethidiumbromide heeft, wanneer het vrij is om in oplossing van conformatie te veranderen, een zeer geringe fluorescentie. De fluorescentie van ethidiumbromide wordt sterk versterkt wanneer het zich aan DNA bindt, zodat deze verbinding zeer nuttig is voor het zichtbaar maken van de plaats van DNA-fragmenten in agarosegelelektroforese. Ethidiumbromide kan giftig zijn; een veiliger alternatief is de kleurstof SYBR Green.
• De DNA-microarray
• Immunologie: Aan een antilichaam is een fluorescerende chemische groep gehecht, en de plaatsen (b.v. op een microscopisch preparaat) waar het antilichaam zich heeft gebonden, kunnen worden gezien, en zelfs gekwantificeerd, door de fluorescentie.
• FACS (fluorescent-activated cell sorting)
• Fluorescentie is gebruikt om de structuur en conformatie van DNA en eiwitten te bestuderen met technieken zoals Fluorescentieresonantie-energieoverdracht, die afstand op angstrom-niveau meet. Dit is vooral van belang bij complexen van meerdere biomoleculen.
• Aequorine, afkomstig van de kwal Aequorea victoria, produceert een blauwe gloed in de aanwezigheid van Ca2+ ionen (door een chemische reactie). Het is gebruikt om de calciumstroom in cellen in real time in beeld te brengen. Het succes met aequorine zette aan tot verder onderzoek van A. victoria en leidde tot de ontdekking van Groen Fluorescerend Eiwit (GFP), dat een uiterst belangrijk onderzoekinstrument is geworden. GFP en verwante proteïnen worden gebruikt als reporters voor een aantal biologische gebeurtenissen, waaronder subcellulaire lokalisatie. Niveaus van genexpressie worden soms gemeten door een gen voor GFP-productie te koppelen aan een ander gen.

Ook hebben veel biologische moleculen een intrinsieke fluorescentie die soms kan worden gebruikt zonder dat er een chemisch label aan moet worden gehecht. Soms verandert deze intrinsieke fluorescentie wanneer het molecuul zich in een specifieke omgeving bevindt, zodat de distributie of de binding van het molecuul kan worden gemeten. Bilirubine bijvoorbeeld is sterk fluorescerend wanneer het gebonden is aan een specifieke plaats op serumalbumine. Zinkprotoporfyrine, dat in de zich ontwikkelende rode bloedcellen wordt gevormd in plaats van hemoglobine wanneer ijzer niet beschikbaar is of lood aanwezig is, heeft een heldere fluorescentie en kan worden gebruikt om deze problemen op te sporen.

Tegen 2006 neemt het aantal fluorescentietoepassingen toe in de biomedische biologische en aanverwante wetenschappen. Ook de analysemethoden op deze gebieden nemen toe, zij het met een steeds ongelukkigere nomenclatuur in de vorm van acroniemen als: FLIM, FLI, FLIP, CALI, FLIE, FRET, FRAP, FCS, PFRAP, smFRET, FIONA, FRIPS, SHREK, SHRIMP, TIRF. De meeste van deze technieken berusten op fluorescentiemicroscopen. Deze microscopen maken gebruik van lichtbronnen met hoge intensiteit, gewoonlijk kwik- of xenonlampen, LED’s of lasers, om fluorescentie te exciteren in de monsters die worden geobserveerd. Optische filters scheiden vervolgens het excitatielicht van de uitgezonden fluorescentie, die met het oog of met een (CCD-)camera of andere lichtdetectoren (fotomultiplicatorbuizen, spectrografen, enz.) kan worden waargenomen. Er wordt veel onderzoek verricht om de mogelijkheden van dergelijke microscopen, de gebruikte fluorescentie-sondes en de toepassingen ervan te verbeteren. Van bijzonder belang zijn confocale microscopen, die gebruik maken van een pinhole om optische doorsnijding te bereiken – waardoor een kwantitatief, 3D beeld van het monster wordt verkregen.

Veiligheid

Fluorescentielampen produceren veel minder afvalwarmte dan gloei- en halogeenlampen. Halogeenlampen zijn betrokken bij een groot aantal branden, en gloeilampen hebben ook een hoger brandrisico dan fluorescentielampen, als gevolg van afvalwarmte. Lampen kunnen per ongeluk omvallen, of soms door gebeurtenissen zoals aardbevingen. Het gebruik van fluorescentielampen kan dus een middel zijn om accidentele branden te voorkomen. Fluorescentielampen kunnen echter kwik bevatten, en het breken van zo’n lamp zou kunnen leiden tot een kostbare kwikverspilling.

Theoretische overwegingen

Photochemie

Fluorescentie treedt op wanneer een molecuul of kwantumstip zich ontspant tot zijn grondtoestand nadat het elektronisch is geëxciteerd.

Excitatie: S 0 + h ν → S 1 {Displaystyle S_{0}+h \nu \tot S_{1}}

Fluorescentie (emissie): S 1 → S 0 + h ν {S_{1}+h_{0}+h\nu}} , waarbij h ν {\displaystyle h\nu } een algemene term voor fotonenergie, waarbij: h = de constante van Planck en ν {\displaystyle \nu } = frequentie van licht. (De specifieke frequenties van opgewekt en uitgezonden licht zijn afhankelijk van het specifieke systeem.)

De toestand S0 wordt de grondtoestand van de fluorofoor (fluorescerend molecuul) genoemd en S1 is zijn eerste (elektronisch) aangeslagen toestand.

Een molecuul in zijn aangeslagen toestand, S1, kan via verschillende concurrerende paden ontspannen. Het kan ‘niet-radiatieve relaxatie’ ondergaan, waarbij de excitatie-energie als warmte (trillingen) aan het oplosmiddel wordt afgestaan. Geëxciteerde organische moleculen kunnen ook ontspannen door omzetting in een triplet toestand die vervolgens kan ontspannen via fosforescentie of door een secundaire niet-stralingsrelaxatiestap.

Relaxatie van een S1 toestand kan ook plaatsvinden door interactie met een tweede molecuul via fluorescentie-quenching. Moleculaire zuurstof (O2) is een uiterst efficiënte demper van fluorescentie vanwege zijn ongebruikelijke triplet grondtoestand.

Moleculen die worden geëxciteerd door lichtabsorptie of via een ander proces (b.v. als het product van een reactie) kunnen energie overdragen aan een tweede ‘gesensibiliseerd’ molecuul, dat wordt omgezet in zijn geëxciteerde toestand en dan kan fluoresceren. Dit proces wordt gebruikt in lichtstaafjes.

Fluorescentie-kwantumopbrengst

De fluorescentie-kwantumopbrengst geeft de efficiëntie van het fluorescentieproces. Het wordt gedefinieerd als de verhouding tussen het aantal uitgezonden fotonen en het aantal geabsorbeerde fotonen.

Φ = # p h o t o n s e m i t t e d # p h o t o n s a b s o r b e d {\displaystyle \Phi ={\frac {\rm {\# fotonen uitgezonden}}{\rm {\# fotonen geabsorbeerd}}}}

De maximale fluorescentie-kwantumopbrengst is 1,0 (100 procent); elk geabsorbeerd foton resulteert in een uitgezonden foton. Verbindingen met een quantumopbrengst van 0,10 worden nog steeds als behoorlijk fluorescent beschouwd. Een andere manier om de quantumopbrengst van fluorescentie te definiëren, is door de snelheid waarmee de aangeslagen toestand vervalt:

k f ∑ i k i {\displaystyle {\frac {{k}_{f}}{\sum _{i}{k}_{i}}}}

waarbij k f {\displaystyle {k}_{f}} de snelheid van spontane emissie van straling is en

∑ i k i {\displaystyle \sum _{i}{k}_{i}}

is de som van alle snelheden van het verval van aangeslagen toestanden. Andere snelheden van geëxciteerd toestandsverval worden veroorzaakt door andere mechanismen dan fotonemissie en worden daarom vaak “niet-radiatieve snelheden” genoemd, die kunnen omvatten: dynamische botsingsafkoeling, dipool-dipool interactie in het nabije veld (of resonantie-energieoverdracht), interne omzetting en intersysteemkruising. Als dus de snelheid van een bepaalde route verandert, zal dit zowel de levensduur van de aangeslagen toestand als de fluorescentie-kwantumopbrengst beïnvloeden.

Fluorescentie-kwantumopbrengst wordt gemeten door vergelijking met een standaard met bekende kwantologie; het kininezout, kininesulfaat, in een zwavelzuuroplossing is een gebruikelijke fluorescentiestandaard.

Fluorescentielevensduur

De fluorescentielevensduur verwijst naar de gemiddelde tijd die het molecuul in zijn aangeslagen toestand blijft alvorens een foton uit te zenden. Fluorescentie volgt gewoonlijk een eerste-orde kinetiek:

= 0 e – Γ t , {Displaystyle \left=0}e^{-\Gamma t},}

waarbij {{Displaystyle \left} de concentratie is van moleculen in de aangeslagen toestand op tijdstip t , 0 {\displaystyle \left_{0}} is de beginconcentratie en Γ {\displaystyle \Gamma } is de vervalsnelheid of de inverse van de fluorescentielevensduur. Dit is een voorbeeld van exponentieel verval. Verschillende radiatieve en niet-stralingsprocessen kunnen de uitgeputte toestand ontlasten. In dat geval is de totale vervalsnelheid de som van alle snelheden:

Γ t o t = Γ r a d + Γ n r a d {Displaystyle \Gamma _{tot}=\Gamma _{rad}+\Gamma _{nrad}}

waar Γ t o t {\Gamma _{tot}} de totale vervalsnelheid is, Γ r a d {\displaystyle \Gamma _{rad}} de stralingsverliessnelheid en Γ n r a d {\displaystyle \Gamma _{nrad}} de niet-stralingsafnamesnelheid. Dit is vergelijkbaar met een chemische reactie van de eerste orde, waarbij de eerste-ordesnelheidsconstante de som is van alle snelheden (een parallel kinetisch model). Als de spontane emissiesnelheid of een van de andere snelheden snel is, is de levensduur kort. Voor veelgebruikte fluorescente verbindingen liggen de typische vervaltijden van de aangeslagen toestand voor fluorescente verbindingen die fotonen uitzenden met energieën van UV tot nabij infrarood, tussen 0,5 en 20 nanoseconden. De fluorescentieelevensduur is een belangrijke parameter voor praktische toepassingen van fluorescentie zoals fluorescentieresonantie-energieoverdracht.

Regels

Er zijn verschillende regels die betrekking hebben op fluorescentie. De regel van Kasha-Vavilov schrijft voor dat de quantumopbrengst van luminescentie onafhankelijk is van de golflengte van de opwindende straling.

Deze regel is niet altijd geldig en wordt in veel eenvoudige moleculen ernstig geschonden. Een iets betrouwbaarder verklaring, hoewel nog steeds met uitzonderingen, is dat het fluorescentiespectrum zeer weinig afhankelijkheid vertoont van de golflengte van de opwindende straling.

Zie ook

• Fluoresceïne
• Fluorescentielamp
• Licht
• Fosforescentie
• Röntgenstraling

• Lakowicz, Joseph R. 2006. Principles of Fluorescence Spectroscopy, 3rd ed. New York: Springer. ISBN 978-0387312781
• Turro, Nicholas J. 1991. Modern Molecular Photochemistry. Mill Valley, CA: University Science Books. ISBN 0935702717
• Valeur, Bernard. 2002. Moleculaire Fluorescentie: Principles and Applications. Weinheim: Wiley-VCH. ISBN 352729919X

Alle links opgehaald op 14 april 2017.

• Fluorophores.org De database van fluorescerende kleurstoffen
• Fluorescentie op Scienceworld
• Basic Concepts in Fluorescence