DNA-synthese uit difosfaatsubstraten door DNA-polymerasen

Resultaten en discussie

We zijn begonnen met het testen van Taq (uit Thermus aquaticus), high-fidelity Vent (exo, uit Thermococcus litoralis), Pfu (exo+, uit Pyrococcus furiosus), Deep Vent (exo+, uit Pyrococcus sp. GB-D), en Q5 (exo+) DNA polymerasen in traditionele polymerase kettingreacties (PCR) met een desoxyribonucleoside monofosfaat (dGMP), dNDPs, en dNTPs als substraten (Fig. 1 A en B). Substitutie van een van de dNTPs voor dNDPs ondersteunde robuuste DNA synthese, en verdere experimenten met twee, drie, of alle vier dNDPs in plaats van dNTPs ondersteunden PCR. Om te verzekeren dat de producten niet het resultaat waren van verontreinigende dNTPs en dat de reacties niet versterkt werden door stabilisatoren aanwezig in commerciële buffers of enzymvoorraden, testten we DNA synthese van gezuiverde dNDPs met gebruik van zelfgemaakte buffers en enzymen. We hebben ook bacteriële replicatieve enzymen gebruikt, zoals de bacteriële replicatieve DNA-polymerasen van de thermofiele Bacillus stearothermophilus (Bst) en de mesofiele Bacillus subtilis (Bsu, groot fragment). Deze, samen met archaeale polymerasen van Thermococcus kodakensis (KOD), Thermococcus sp. 9°N (9°N), en Thermococcus gorganarius (Tgo), vertoonden robuuste primer-extensies met gebruikmaking van slechts 100 µM gezuiverde dNDP’s bij 60 °C (behalve Bsu, dat in alle gevallen bij 37 °C werd getest) (Fig. 1C). De primer-extensiereacties waren efficiënt voor al deze enzymen, in het bijzonder voor Deep Vent, KOD, en 9°N. Pauzes werden waargenomen vóór incorporatie van dA en dC in het nascente oligonucleotide (Fig. 1 C en D), wat suggereert dat de KM’s voor dADP en dCDP hoog genoeg zijn om de primerextensie te vertragen bij een substraatconcentratie van 100 µM.

Om een mechanistisch inzicht in de reactie te krijgen, bestudeerden we eerst de efficiëntie met behulp van het Taq-enzym. Het variëren van de extensie temperatuur van 50 ° C tot 72 ° C resulteerde in geen waarneembaar verschil in de hoeveelheid full-length product. Om de kinetische analyses te vereenvoudigen, werden alle PCR-reacties uitgevoerd met behulp van een tweestaps temperatuurcyclus protocol, waarbij de primer in de eerste stap bij 72 °C werd geannealed en verlengd en de duplex in de tweede stap bij 95 °C werd gesmolten (Fig. S1A). Om de snelheid van dNDP-gebruik te vergelijken met de canonieke dNTPs, werd de verlengingstijd gevarieerd van 15 tot 120 s. Voor een verlengingstijd van 15 s produceerde de dNTP-reactie ongeveer vier keer zoveel product als de 2-min verlengingstijdreactie die de dNDPs bevatte (Fig. S1B). Deze gegevens suggereren dat de snelheid van incorporatie voor de difosfaten trager is dan die van de traditionele trifosfaten, zoals verwacht zou worden gezien de lagere grondstoatenergie van de dNDPs. Vervolgens vroegen we ons af of één of alle vier de dNDPs verantwoordelijk zijn voor de tragere incorporatiesnelheid. Kwantitatieve PCR (qPCR) werd gebruikt voor een nauwkeurige meting van de productvorming. Elk difosfaat werd onafhankelijk ondervraagd door het te combineren met 0.2 mM van de andere drie dNTPs om een lang DNA sjabloon te amplificeren. Deze reacties werden genormaliseerd naar een controlereactie, die 0,2 mM van alle vier dNTPs bevatte (Fig. S1C). Een waarde van 1 geeft aan dat een difosfaat even efficiënt wordt opgenomen als zijn trifosfaat-analoog. Deze resultaten suggereren dat dADP het minst efficiënt wordt opgenomen (1 mM dADP leverde ∼60% van 0,2 mM dATP op), gevolgd door desoxythymidine difosfaat (dTDP) en desoxycytidine difosfaat (dCDP). Anderzijds is slechts een tweevoudige verhoging van de concentratie van dGDP nodig om dezelfde PCR-efficiëntie te bereiken als de dGTP-controlereactie.

Om de DNA-polymerisatie direct te analyseren, voerden we een primerextensiereactie uit van een 32P gelabelde primer en een lang (706 nt) sjabloon. De difosfaatconcentratie werd gevarieerd van 0,1 tot 1,0 mM en gecombineerd met 0,2 mM van de andere drie dNTPs, vergelijkbaar met de hierboven beschreven qPCR-reacties. Zoals verwacht, verminderde toenemende concentraties van dADP de tijd die nodig was om een full-length product te produceren (Fig. 1E). Pauzeren langs de lengte van het template DNA werd alleen waargenomen in het geval van dADP, wat suggereert dat de polymerase stagneert tijdens de incorporatie van dADP substraten (Fig. 1E). Aan de andere kant suggereerde het gebrek aan pauze in de dTDP reactie dat dTDP efficiënter werd gebruikt dan dADP (Fig. S2A), zoals gesuggereerd door de qPCR analyse (Fig. S1A). Analyse van productvorming suggereerde dat dADP concentratie die nodig is om de half-maximum snelheid te bereiken ∼420 µM is (Fig. S2B), meer dan een orde van grootte boven KM voor dNTPs eerder gemeten (16 en 24 µM) (5, 6). Bij een verzadigende concentratie van dADP wordt het volledige DNA in ongeveer 30 s gesynthetiseerd en, gegeven het feit dat de 706-nt sequentie 182 adenosines bevat, is de gemiddelde snelheid van het gebruik van dADP ten minste ∼6 s-1. Dit is ongeveer een orde van grootte langzamer dan de gemiddelde snelheid van het gebruik van dNTPs door het Taq polymerase (kcat = 47 s-1) en is binnen 1,5-voud van de kcat van Pfu (7).

Om de kinetiek van DNA synthese op lange templates van dNDPs en dNTPs verder te vergelijken, gebruikten we een singe-stranded DNA (ssDNA) M13mp18 plasmide template van 7.249 nt (8). Bsu (bij 37 °C), Bst, en Taq (bij 60 °C) polymerases vertoonden een robuuste DNA synthese van dNDPs (Fig. S2C). We maten de snelheid van DNA synthese met behulp van de fluorescentie van de SYTO9 intercalator, waargenomen door een real-time thermische cycler bij variërende dNDP en dNTP concentraties (Fig. S2D) (9). Een plot van deze snelheden versus nucleotideconcentratie liet een KM zien van ∼0,4 mM voor dNDPs en een maximale snelheid van synthese die ongeveer 17 keer lager is voor dNDPs dan voor dNTPs (Fig. S2E). Deze resultaten tonen aan, in een directe vergelijking onder identieke omstandigheden, dat de snelheid van DNA synthese uit dNDPs iets meer dan een orde van grootte lager is dan uit dNTPs en dat Vmax/KM dus ongeveer 400 keer lager is voor dNDPs dan voor dNTPs.

Een polymerisatiereactie met canonieke trifosfaatsubstraten verlengt de lengte van de ontluikende DNA streng met één nucleotide, waarbij een PPi vrijkomt (3). Tijdens de omgekeerde reactie, pyrofosforolyse, wordt de primer met één nucleotide verkort en komt een dNTP vrij. Op analoge wijze komen bij gebruik van dNDP’s als substraat fosfaten vrij en is de omgekeerde reactie de fosforolyse van DNA (Fig. 2A). Om te bevestigen dat de polymerasen rechtstreeks dNDPs gebruiken en geen gebruik maken van een tot nu toe onbekende enzymatische activiteit (of gecopurificeerd nucleotide difosfaat kinase) die twee dNDPs omzet in een dNTP en een dNMP, gebruikten we gezuiverde dNDPs en analyseerden we de producten van een primer-extensiereactie. Wij hebben de productie van fosfaat gemeten met behulp van een fluorescerende sensor, die is afgeleid van het bacteriële fosfaatbindende eiwit en een hoge specificiteit voor fosfaat vertoont (10). Wij vonden dat, in aanwezigheid van gezuiverde dNDPs en Taq DNA polymerase, fosfaat opbouwt (Fig. 2B), maar in experimenten zonder het polymerase, doet het dat niet. In controle-experimenten met dNTPs werd wel fosfaatproductie waargenomen, maar de snelheid daarvan was langzamer en onafhankelijk van het enzym, wat suggereert dat het waargenomen fosfaat het gevolg was van dNTP-afbraak tot dNDP en fosfaat en niet gerelateerd was aan DNA-synthese. Deze resultaten bevestigden dat Taq rechtstreeks dNDP’s gebruikt als substraat, waarbij fosfaat vrijkomt als nevenproduct van de DNA synthese. Toen we de hoeveelheid fosfaat maten die geproduceerd werd in primer extensies op het 7.249-nt M13 ssDNA dat hierboven beschreven werd, vonden we dat ∼1-11 µM fosfaat geproduceerd werd bij gebruik van een 1.6-nM template over achtergrondfosfaatproductie door dNDP degradatie (Fig. S3A). Deze fosfaatconcentratie komt overeen met ∼2-6.000 moleculen per DNA, of ongeveer 0,1-0,9 van de sjabloon gekopieerd met behulp van dNDP’s. Het grote bereik is het gevolg van een relatief grote fosfaatachtergrond in het uitgangsmateriaal en de achtergrondreactie die van het signaal in de primer-extensiereactie wordt afgetrokken.

Om te verifiëren dat de reacties geen dNTPs van dNDPs produceren, incubeerden we de Taq polymerase met 250 µM van dCDP en dTDP en opgelost de reacties door ion-exchange chromatografie (Fig. S3B). Deze analyse bracht geen nieuwe moleculaire species aan het licht die overeenkwamen met mono- of trifosforyleerde nucleotiden in de enzym-bevattende reactie, vergeleken met de enzym-vrije reactie, wat wijst op een gebrek aan fosforyltransferase-activiteit in het enzympreparaat en verder het directe gebruik van dNDPs in DNA-synthese ondersteunt.

Zoals hierboven beschreven, komt bij reacties met dNDP-substraten een anorganisch fosfaat (Pi) vrij, en de omgekeerde reactie is dus fosforolyse van DNA (Fig. 2A). Om de efficiëntie van deze omgekeerde reactie te testen, onderzochten we de fosforolyse van een 5′ 32P gelabelde primer geanneed aan een template streng door deze te incuberen met het enzym en 10 mM Pi. Fig. 2C toont de verwijdering van de terminale 3′ nucleotide van de primerstreng door Taq DNA polymerase in aanwezigheid van Pi en PPi, wat aantoont dat Taq DNA polymerase de omgekeerde reactie van DNA polymerisatie kan ondergaan van zowel dNTPs als dNDPs. Analyse van de thermofiele Bst, Deep Vent, KOD (Fig. S4A), 9°N, Tgo, en de mesofiele Bsu polymerasen toonde ook fosfolyse van DNA (Fig. S4B), zij het in mindere mate. Een controlereactie met het Klenow fragment van het Escherichia coli DNA polymerase I, dat geen dNDPs als substraat accepteert, werd ook onderzocht (Fig. S4C) en toonde aan dat de aanwezigheid van PPi, maar niet Pi, resulteert in de verkorting van de primer.

Om de omgekeerde reactie verder te analyseren, bereidden we dsDNA dat intern gelabeld is met 32P-phosphaat door een primer extensie reactie uit te voeren met α-32P-dATP, gevolgd door PAGE zuivering. We analyseerden de producten van de omgekeerde reactie met anion exchange (polyethyleenimine) TLC. Zoals verwacht leverde incubatie van het intern gelabelde DNA met Taq-polymerase en pyrofosfaat producten op die met dATP comigreerden. Reacties in aanwezigheid van fosfaat produceerden sneller migrerende soorten, overeenkomend met dADP, en reacties zonder fosfaat of pyrofosfaat produceerden geen migrerende soorten, wat aangeeft dat in aanwezigheid van Taq polymerase alleen het DNA intact bleef (Fig. 2D) en bevestigt dat de omgekeerde reactie fosforolyse van DNA is.

Ten slotte bleek uit analyse van de substraat-afhankelijke kinetiek van de terugreactie een KM van ∼10 ± 5 mM (n = 9) en 57 ± 5 µM (n = 5) voor respectievelijk fosfaat en pyrofosfaat, hoewel de lage oplosbaarheid van magnesiumfosfaat boven 10 mM ons belette nauwkeurige metingen te verrichten (Fig. 2E). Kristalstructuren van DNA-polymerasen met pyrofosfaat of fosfonoforminezuur in de actieve sites tonen een coulombische interactie met het eiwit (11⇓-13). De 200-voudige verhouding tussen de KM’s van de twee substraten komt overeen met ∼15 kJ/mol (3.6 kcal/mol) bij 72 °C, een bindingsenergie die ongeveer gelijk is aan een ionische interactie tussen het extra fosfaat en een compenserend kation op het eiwit en die een model ondersteunt waarin het fosfaat/pyrofosfaat voornamelijk wordt herkend via een lading-lading interactie. Schattingen van de maximumsnelheden van de omgekeerde reactie volgden een soortgelijke trend: onder deze omstandigheden was Vmax 0,0010 ± 0,0005 s-1 en 0,205 ± 0,005 s-1 voor respectievelijk fosfaat en pyrofosfaat, wat opnieuw een ongeveer 200-voudige verhouding tussen de twee activiteiten laat zien. Alles bij elkaar genomen is de fosfaatreactie onder verzadigende concentraties van de twee substraten ongeveer 4 × 104 keer minder efficiënt, wat suggereert dat fosforylering van DNA geen significante bedreiging vormt voor de stabiliteit van het genoom.

Om verder inzicht te krijgen in DNA synthese uit de laagenergetische substraten (dNDPs en Pi), hebben we de activeringsenergieën gemeten met behulp van de Arrhenius analyse van de voorwaartse en terugwaartse reacties. Omdat single-molecule metingen van conformatieveranderingen geassocieerd met herkenning en incorporatie van de juiste dNTPs een snellere beweging van het eiwit aan het licht brachten dan de waargenomen reactiekinetiek (14), is de snelheidslimiterende stap van de voorwaartse reactie in het Taq polymerase waarschijnlijk gerelateerd aan de chemiestap of een pre-katalytische actieve-site herschikking die afhangt van de interactie met de substraatfosfaten. We hebben waargenomen dat de Vmax van zowel de voorwaartse als de omgekeerde reactie lager is voor dNDP en fosfaat dan voor dNTP en pyrofosfaat, wat suggereert dat de snelheidslimiterende stap gevoelig is voor de fosforyleringstoestand van de substraten. Echter, zowel de pre-katalytische herschikking (zoals uitlijning van active-site residuen en binding van een katalytisch Mg2+ ion) als de chemische stap kunnen beïnvloed worden door de fosforylering van het substraat; daarom kunnen beide stappen snelheidsbeperkend zijn in aanwezigheid van dNDPs, ervan uitgaande dat ze geen nieuwe trage conformatiestap in het mechanisme introduceren. In Pol β is eerder voorgesteld dat deze twee stappen vergelijkbare snelheidsconstanten hebben (15), en de berekende activeringsenergieën voor de voorwaartse en terugwaartse reacties die gebruik maken van de hoogenergetische substraten (dNTPs en pyrofosfaat) verschillen zo weinig als 15 kJ/mol (4). In het geval van de thermofiele Taq en Klentaq1 enzymen varieert de activeringsenergie van de voorwaartse reactie sterk, van 90 tot 125 kJ/mol, afhankelijk van de experimentele omstandigheden en waarschijnlijk de identiteit van de reagerende nucleotiden (8, 16), terwijl de activeringsenergie van pyrofosforolyse, voor zover ons bekend, niet experimenteel is bepaald.

We analyseerden single-nucleotide incorporatiesnelheden van 50 µM van dCDP, dADP, en dTDP, stapelen op dA, dC, en dA, respectievelijk, tijdens de primer-extensiereactie. Arrheniusanalyse toonde een lineaire afhankelijkheid van ln(kobs) van 1/T voor experimenten beneden 60 °C, waarbij activeringsenergieën van 85 ± 14, 108 ± 11, en 112 ± 15 kJ/mol voor de drie nucleotiden werden gevonden (Fig. 3 A en B; n = 6 voor elke nucleotide). Arrheniusanalyse van de omgekeerde reactie met 0,4 mM fosfaat, waarbij een molecuul dADP wordt geproduceerd, onthulde een grote activeringsenergie van 138 ± 10 kJ/mol (n = 5), in overeenstemming met de waargenomen langzame snelheid van DNA-fosforolyse door Taq (Fig. 3 A en B), en een aanzienlijke toename vertegenwoordigend van de berekende activeringsenergie van pyrofosforolyse (92 kJ/mol in Pol β) (4). De activeringsenergie van de voorwaartse en omgekeerde reacties voor dADP verschilt dus ∼30 kJ/mol, wat een sterke bias oplevert voor DNA-synthese. Deze bias voor de voorwaartse reactie resulteert in een lagere vereiste voor sekwestratie van het fosfaatproduct door een stroomafwaartse metabole route, in tegenstelling tot de op dNTP gebaseerde DNA-synthese en pyrofosfaathydrolyse door anorganische pyrofosfatases. Bovendien, als de pre-katalytische conformatieveranderingen in het Taq polymerase niet worden beïnvloed door de laag-energetische substraten en de chemiestap snelheidslimiterend is, kan het gebruik van dNDPs en fosfaten nieuw experimenteel inzicht verschaffen in de enzymatische katalyse van DNA synthese.