The cnidosac in Cladobranchia
Comparative anatomy of the cnidosac
Vóór de huidige studie zijn talrijke veronderstellingen gemaakt over de uniformiteit van de morfologie van de cnidosac bij cladobranchia die kleptocniden herbergen. Met name Edmunds geeft tekeningen die opmerkelijk consistent zijn over soorten van Fionidae, Favorinidae, Facelinidae en Aeolidiidae, hoewel cnidosac beschrijvingen niet het hoofddoel van die publicatie waren. Alle soorten die in dat werk zijn afgebeeld hebben een duidelijke ingang die de spijsverteringsklier met de cnidosac verbindt (hoewel in sommige gevallen een lichte verlenging van de ingang is afgebeeld, vergelijkbaar met een kanaal) en een duidelijke uitgang aan de punt van de ceras die de cnidosac met de buitenkant verbindt. Bovendien bezitten alle cnidosacs kleptocniden, en ook de manier waarop de musculatuur wordt voorgesteld is zeer uniform. De meest gedetailleerde studie over aeoliden cnidosacs, tot nu toe, werd geschreven door Kälker en Schmekel , maar het beschreef niet voldoende de variatie die kan worden gevonden in deze structuur over de ruwweg 600 soorten van aeoliden . Bovendien is het werk aan de cnidosac-achtige structuren bij Hancockia spp. pas onlangs begonnen.
In deze studie vinden we dat de lengte, grootte en structuur van de ingang van de cnidosac meer varieert dan verwacht op basis van eerder werk, net als de structuur van de uitgang, of cnidopore, de musculatuur rond de cnidosac, en de positie en oriëntatie van de kleptocniden. Het is belangrijk op te merken dat, hoewel we een brede taxonsteekproef van morfologische kenmerken van de cnidosac hebben gegeven, voor veel soorten slechts één specimen beschikbaar was voor analyse. Als zodanig moeten de waarnemingen van afwezigheid in bepaalde gevallen met de nodige voorzichtigheid worden gehanteerd. Wij bespreken deze taxa in het bijzonder hieronder.
Vorig werk presenteert slechts een korte en eenvoudige ingang tot de cnidosac (d.w.z. een directe opening), waarschijnlijk als gevolg van de selectie van taxa die deze conditie bezitten louter door toeval. Ons werk suggereert dat dit de meest voorkomende overgang is tussen de spijsverteringsklier en de cnidosac. Hancock en Embleton vermelden echter de aanwezigheid van een kanaal met trilharen bij Aeolidia (= Eolis) papillosa en Herdman en Clubb noteren de aanwezigheid van een “lang, gebogen verbindingskanaal” bij wat nu Facelina bostoniensis (= Facelina drummondi) is. Enkele taxa bezitten een kanaal met trilharen, waaronder Aeolidia papillosa, Cerberilla amboinensis, Cratena peregrina, Pteraeolidia ianthina, en Paraflabellina ischitana. Deze taxa zijn niet nauw verwant, en daarom is het kanaal niet homoloog bij de taxa die het bezitten, wat een functionele verklaring voor zijn aanwezigheid suggereert. Aanvankelijk vermoedden wij dat de aanwezigheid van dit langwerpige kanaal verband hield met de grootte van de kleptocniden, aangezien A. papillosa, C. amboinensis, en P. ianthina alle grotere kleptocniden sequestreren (> 20 μm in lengte). Dit wordt echter niet ondersteund door C. peregrina en P. ischitana, aangezien deze soorten kleinere nematocysten sekwestreren. In deze gevallen kan het gecilieerde kanaal een overblijfsel zijn van een voorouderlijke verschuiving in het dieet, maar de mogelijke functionele betekenis van het gecilieerde kanaal blijft speculatief.
Ook is er geen consistent patroon tussen de taxa die een proliferatiezone bezitten en die welke dat niet doen. De enige uitzondering is de afwezigheid van een proliferatiezone bij taxa die geen nematocysten sekwestreren uit het geslacht Phyllodesmium. De enige soort binnen Phyllodesmium waarin we een proliferatiezone hebben gevonden is P. jakobsenae, de enige soort van Phyllodesmium waarvan bekend is dat ze kleptocniden bevat. Het is nog steeds onduidelijk waarom sommige taxa een proliferatiezone lijken te hebben en andere niet, maar we vermoeden dat in een klein aantal gevallen artefacten bij het snijden van sommige monsters hebben geleid tot de vernietiging van deze regio (waarschijnlijk als gevolg van moeilijkheden bij de conservering), wat leidt tot membraanfragmenten en vrij zwevende kleptocniden in de cnidosacs van sommige soorten a (b.v. Cratena peregrina; Fig. 4d). Om dit punt op te lossen moeten meer individuen van deze soorten worden onderzocht. De schijnbare afwezigheid van een proliferatiezone kan ook te wijten zijn aan verschillen in het groeistadium van de onderzochte individuen, of van de cerata als die zich al in het regeneratieproces bevonden, maar wij vonden geen bewijs dat een van deze hypothesen expliciet ondersteunt. Voorts vermeldde ten minste één eerdere studie de aanwezigheid van dit gebied, maar het werd niet in detail besproken. In dit gebied worden de nematocysten door de cnidofagen opgenomen voordat zij naar het distale einde van de cnidosac migreren. De precieze omvang van de proliferatiezone blijft echter onduidelijk. Bij sommige soorten lijkt ze beperkt tot de cnidosac (b.v. Pteraeolidia ianthina; Fig. 4a), maar bij andere lijkt deze zone zich uit te strekken tot in de aangrenzende delen van de spijsverteringsklier (b.v. Dondice occidentalis; Fig. 4b). Bij de meeste taxa die nematocysten sekwestreren, vonden we slechts zeer eenvoudige uitgangen uit de cnidosac, die in sommige gevallen bedekt is met een dun epitheel. Deze bedekking bevat cellen die lijken op die van de epidermis van de cerata, die bestaat uit langwerpige zuilvormige cellen met wat veel gespecialiseerde vacuolen lijken te zijn. Eenvoudige uitgangen komen het meest voor, zowel in onze studie als naar het schijnt ook in andere. Bij enkele geselecteerde taxa binnen de Aeolidiidae, waaronder Aeolidia papillosa, Anteaeolidiella chromosoma, en Cerberilla amboinensis, is echter een complexe cnidopore aanwezig (Fig. 4c). Deze heeft een epitheliale bekleding die doorlopend lijkt met die van de epidermis. Deze structuur is reeds eerder geïdentificeerd, maar werd eenvoudigweg beschouwd als een zone van ongedifferentieerde cellen waarvan werd aangenomen dat ze diende als reserve voor verloren cnidofagen. Gezien de ligging aan het distale einde van de cnidosac, en als onderdeel van de cnidopore, vermoeden wij echter dat dit niet het geval is. In plaats daarvan veronderstellen wij dat deze cellaag een speciale aanpassing is voor het vrijmaken van de uitzonderlijk lange en smalle nematocysten die door anemonen worden afgezet (tot 50-60 μm lang, maar < 5 μm in breedte). De term cnidopore is eerder onkritisch gebruikt om te verwijzen naar alle uitgangen van de cnidosac , maar we nu de term cnidopore hier herdefiniëren om te verwijzen naar de structuur tot nu toe alleen gevonden in Aeolidiidae.
Hoewel de musculatuur rond de cnidosac ook varieert in Aeolidida, de betekenis van deze variatie is onduidelijk. De spieren rond de cnidosac zijn zeer dun of ontbreken geheel bij slechts enkele soorten, waaronder Embletonia gracilis, Embletonia pulchra en Bulbaeolidia alba. De dikte van de spieren, wanneer aanwezig, varieert van soort tot soort, van één tot meerdere lagen. Deze variatie in de dikte van de musculatuur wordt geïllustreerd in een eerdere studie, zij het niet zo nauwkeurig als wij hier aangeven (Tabel 3). Er is geen duidelijke evolutionaire verklaring voor de variatie in spierdikte of aantal spierlagen tussen taxa, maar een dikkere spierlaag zou waarschijnlijk resulteren in een krachtiger uitdrijving van de kleptocnides. Een grotere spiermassa zou verband kunnen houden met predatiedruk, grootte van de opgenomen kleptocniden, of ontwikkelingsstadium. Het opnemen van meer individuen van elke soort, en in verschillende stadia van ontwikkeling, alsmede metingen van kleptocnidegrootte en spierdikte zou nuttig zijn voor het beoordelen van deze hypothesen.
De differentiatie van cnidofagen van een functionele, actieve cel in een “container of voorraadkast” van kleptocniden aan de punt van de cnidosac weerspiegelt de rijping van de kleptocniden via protonentransport, die onrijp en niet-functioneel zijn wanneer ze voor het eerst worden afgezonderd . Na de rijping blijken de cellen niet meer te functioneren door de vermindering van de celcomplexiteit. Eerdere onderzoekers hebben getracht de oorsprong van het membraan van de cnidofaag te achterhalen en zijn onlangs tot de conclusie gekomen dat het een fagosoom is, een gespecialiseerd blaasje gevormd door het celmembraan. Binnen cnidofagen kan het aantal kleptocniden zowel binnen als tussen taxa verschillen. Dit lijkt samen te hangen met de grootte van de kleptocniden; er zijn meestal minder grote kleptocniden (> 20 μm lang) binnen een bepaalde cnidofaag vergeleken met die met kleinere kleptocniden (gewoonlijk 10 μm of minder). Een voorbeeld is te vinden bij Pteraeolidia ianthina (Fig. 4a), die nematocysten van meerdere grootteklassen sequestreert.
Afwijkingen van het algemene thema
De in deze studie beoordeelde morfologische kenmerken blijken binnen families nogal variabel te zijn, maar de meeste cnidosacillen variëren over het algemeen op een thema dat over de Aeolidida geconserveerd is. Er zijn echter nog andere families die bepaalde cnidosac structuren hebben verloren of die de cnidosac helemaal hebben verloren. Men zou kunnen veronderstellen dat de cnidosacs de verbinding met de spijsverteringsklier of de musculatuur rond de cnidosac verliezen wanneer er geen nematocysten zijn afgezet. Zo bezitten soorten uit het geslacht Phyllodesmium (met uitzondering van P. jakobsenae) spiergebonden cnidosacs die vrij lijken te zijn van kleptocniden, maar er zijn geen duidelijke ingangen naar het digestieve divertikel of uitgangen naar het externe milieu. Deze soorten sekwestreren chemische stoffen ter verdediging, en hebben dus niet noodzakelijk een gestructureerde ingang nodig. Op deze manier zijn de cnidosacs bij Phyllodesmium wellicht vergelijkbaar met de huidformaties van de mantel bij Charcotiidae, die geen uitgang hebben maar inhoud vrijgeven wanneer ze worden samengedrukt. Bij soorten uit het geslacht Favorinus blijft de algemene structuur van de cnidosac (met inbegrip van de opening van de spijsverteringsklier en de spieren rond de cnidosac) dezelfde, maar zijn er geen kleptocniden aanwezig wegens de neiging van deze soorten om zich te voeden met de eieren van andere buikpotigen . Hoewel het mogelijk is dat het ontbreken van kleptocniden voortkomt uit een hypothetische neiging bij Phyllodesmium en Favorinus om nematocysten te lozen tijdens het fixatieproces, suggereren wij dat dit onwaarschijnlijk is. Ten eerste lijken leden van Phyllodesmium een intact epitheel te hebben waar men zou verwachten dat de kleptocniden worden uitgeworpen. Als de kleptocniden tijdens de fixatie zouden worden uitgeworpen, zouden de cera’s worden gefixeerd met een opening in de top. Bovendien is de afwezigheid van kleptocniden in Phyllodesmium in het bijzonder ook goed gedocumenteerd (met uitzondering van P. jakobsenae). Bij Favorinus is dit mogelijk het geval, gezien het open epitheel aan de top van de cerata (b.v. Fig. 2c), maar de afwezigheid van kleptocniden is consistent met de gewoonte van leden van dit genus om gastropodeneieren te eten.
Even meer variaties op dit thema worden gevonden bij Bulbaeolidia alba, Embletonia spp., en soorten binnen het genus Fiona. Bulbaeolidia alba heeft een zakje aan het distale einde van de spijsverteringsklier dat slechts incidenteel zooxanthellen (Symbiodinium) bevat. Bovendien konden we geen duidelijke in- of uitgang van de zak vinden, en de structuur lijkt te zijn omgeven door een paar dunne spiervezels. Wij stellen de hypothese voorop dat het ontbreken van kleptocniden te wijten kan zijn aan de zeer geringe afmetingen van B. alba, die daardoor wellicht minder afweer nodig heeft, maar zelfs kleinere taxa binnen de genera Embletonia en Pseudovermis bezitten kleptocniden. Een andere mogelijkheid is dat het gebrek aan sekwestratie verband houdt met de grootte of de bruikbaarheid van de nematocysten die worden aangetroffen in de anemonen waarmee deze soort zich voedt. Een derde mogelijkheid is dat B. alba in plaats daarvan andere natuurlijke verbindingen in deze zak opslaat, hetzij afkomstig van zijn prooi zoals bij Phyllodesmium, hetzij de novo geproduceerd. Ook hier is het mogelijk dat het ontbreken van kleptocniden bij B. alba een artefact is van een kleine steekproefgrootte, maar net als bij Phyllodesmium kon geen bewijs van extrusie worden gevonden. Leden van de Embletoniidae lijken de musculatuur rond de cnidosac evolutionair geheel te hebben verloren of vertegenwoordigen een tussenstap in de evolutie van de cnidosac, zoals besproken in het onderdeel evolutie van de cnidosac hieronder. Er is ook geen duidelijke in- of uitgang van de cnidosac bij deze taxa. Tenslotte hebben sommige soorten Fionidae binnen het genus Fiona (deze studie) de cnidosacs geheel verloren, ogenschijnlijk omdat soorten in dit genus een voorkeur hebben voor niet-cnidarian prooien.
Gesekwestreerde nematocysten zijn ook gevonden in één andere familie binnen Cladobranchia, Hancockiidae. We zien bij Hancockia californica structuren die sterk lijken op cnidosacs (die we cnidosac-achtige noemen), met kleptocniden die zijn ondergebracht in cnidofaag-achtige cellen in meervoudige gespierde zakjes aan de top van elke ceras. Deze structuren zijn ook aangetroffen bij Hancockia uncinata en H. schoeferti , en in sommige gevallen werden cnidosac-achtige structuren aangetroffen in zowel de cerata als de rhinophorale scheden. Homologie conclusies met betrekking tot de structuren gevonden in Hancockiidae en die in Aeolidida worden besproken in de volgende paragraaf.
Phylogenie van Cladobranchia en evolutie van de cnidosac
Phylogenetische conclusies
Gezien het feit dat veel van de moleculaire gegevens die hier zijn opgenomen zijn afgeleid van eerder gepubliceerde studies, is de topologie die wordt afgeleid in onze fylogenetische analyse (figuur 5) consistent met die gevonden in beide recente fylogenomische studies . Dit werk breidt echter eerdere bevindingen uit door taxa op te nemen die niet in recente fylogenomische studies zijn geanalyseerd, namelijk taxa uit de genera Phyllodesmium, Caloria, Pruvotfolia, Pteraeolidia, Cratena, Facelina, Glaucus, Calmella, Piseinotecus, Tergipes, Notaeolidia, Embletonia, en Charcotia. De meeste hiervan vallen binnen de clades die we op basis van eerder moleculair werk zouden verwachten: Phyllodesmium is nauw verwant met Dondice binnen de facelinide clade die zuster is van de Aeolidiidae ; Caloria wordt ondersteund binnen de tweede facelinide clade en is nauw verwant met soorten van Pruvotfolia ; Facelina, Glaucus en Cratena zijn nauw verwant binnen de tweede facelinide clade ; Calmella is nauw verwant met Flabellina en Paraflabellina ; en Tergipes valt binnen wat nu Fionidae is. De plaatsing van Pteraeolidia als nauw verwant aan Palisa en Austraeolis binnen de tweede facelinide clade is echter nieuw voor deze studie, en de moleculaire gegevens die hier gepresenteerd worden ondersteunen de positie van Charcotia binnen de zustergroep van Aeolidida, zoals eerder gesuggereerd door morfologisch werk.
Ondanks de toevoeging van alle nieuwe gegevens die hier gepresenteerd worden, blijft de positie van Notaeolidia en Embletonia onduidelijk. Steun voor de exacte posities van deze twee genera is gering, en deze taxa lijken bij te dragen aan de lage bootstrap waarden aan de basis van Aeolidida. Dit kan te wijten zijn aan de aantrekking van lange takken tussen Notaeolidia en Flabellinopsis iodinea , en tussen Embletonia en Unidentia. Morfologische analyses ondersteunen echter ook ten minste de eerdere divergentie van Notaeolidia binnen Aeolidida . De onzekerheid rond de verwantschappen van deze vier taxa heeft implicaties voor ons begrip van de evolutie van de cnidosac.
We vinden ook dat individuele gen boomanalyses (en de drie genen analyse) consistent zijn met eerdere grootschalige PCR-gebaseerde sequentie analyses . Deze topologieën en posterior waarschijnlijkheden ondersteunen het idee dat PCR-gebaseerde sequentiegegevens voor de gebruikte genen (COI, 16S, en 18S) enig nut bieden voor het afleiden van recente divergenties, maar dat high-throughput sequentiegegevens nodig zijn voor het afleiden van diepere divergenties.
Cnidosac evolutie
De sekwestratie van cnidarian nematocysts is ontstaan ten minste tweemaal binnen Cladobranchia op basis van de hier gepresenteerde fylogenie (Fig. 6). Dit resultaat geeft ook aan dat soorten binnen de Aeolidida die geen nematocysten sekwestreren, dit vermogen hebben verloren, hetgeen ten minste drie keer lijkt te zijn voorgekomen. Bovendien is de vroege divergentie van Embletoniidae binnen de aeolididae fylogenie suggestief; het wijst erop dat de structuur binnen Embletoniidae een cnidosac is, en dat het ontbreken van musculatuur rond de cnidosac een tussenstap kan zijn in de evolutie van kleptocnide-sequestratie. Een sterkere ondersteuning van verwantschappen aan de basis van de Aeolidida is echter nodig voordat verdere conclusies kunnen worden getrokken. Onze resultaten ondersteunen ook verschillende onafhankelijke verliezen van de cnidosac, ook bij leden van Fiona en Tergipes. Dit lijkt te wijten te zijn aan een omschakeling naar de prooi van voornamelijk Crustacea bij Fiona. Een prooi voorkeur overgang van hydroïden naar andere soorten organismen kan ook hebben geleid tot het verlies van cnidosacs in sommige soorten van Tergipes .
De aanwezigheid van een zak aan het distale einde van de spijsverteringsklier is verondersteld te zijn ontstaan vóór het vermogen om nematocysten te sekwestreren (figuur 6; grijs kader), hoewel dit resultaat berust op de hypothese dat de eindzakken gevonden bij Charcotiidae en Proctonotidae homoloog zijn met die bij Aeolidida. De steun voor deze hypothese is zeer gering, en lijkt dus onwaarschijnlijk op basis van onze reconstructie. De eindzakken van Charcotiidae en Proctonotidae worden echter beschouwd als uitscheidingsstructuren, en sommigen hebben de hypothese geopperd dat de cnidosac van de Aeolidida een aanpassing is van deze zak voor de verdediging. Hoewel de homologie onzeker blijft, wijst onze reconstructie van de voorouderlijke toestand deze modificatie-hypothese, waarbij de distale zak werd geëxporteerd om nematocysten op te sluiten, niet volledig af. Meer morfologische en moleculaire gegevens van andere soorten in de Charcotiidae + Proctonotidae + Dironidae clade zijn nodig om deze hypothese verder te testen, omdat deze clade niet goed vertegenwoordigd is in onze analyse, wat evolutionaire gevolgtrekkingen kan belemmeren.
De cnidosac-achtige structuren in Hancockiidae lijken onafhankelijk van de distale zak te zijn geëvolueerd in zowel Aeolidida als zijn zusterclade. Dit wordt ondersteund door de hier gepresenteerde fylogenetische analyses en door verschillen in het sequestratieproces tussen Hancockia en soorten van de aeoliden. Zo blijkt dat Hancockia soorten nematocysten inkapselen in het lumen van het spijsverteringskanaal alvorens ze te transporteren, in tegenstelling tot aeoliden.