Modos de Separación en HPLC

En general, se pueden utilizar tres características primarias de los compuestos químicos para crear separaciones en HPLC. Son:

– Polaridad
– Carga eléctrica
– Tamaño molecular

En primer lugar, consideremos la polaridad y los dos modos de separación primarios que explotan esta característica: la cromatografía de fase normal y la de fase inversa.

Separaciones basadas en la polaridad

La estructura, la actividad y las características fisicoquímicas de una molécula están determinadas por la disposición de sus átomos constituyentes y los enlaces entre ellos. Dentro de una molécula, una disposición específica de ciertos átomos que es responsable de propiedades especiales y reacciones químicas predecibles se denomina grupo funcional. Esta estructura suele determinar si la molécula es polar o no polar. Las moléculas orgánicas se clasifican en clases según el grupo o grupos funcionales principales que contiene cada una. Utilizando un modo de separación basado en la polaridad, la retención cromatográfica relativa de las diferentes clases de moléculas viene determinada en gran medida por la naturaleza y la ubicación de estos grupos funcionales. Como se muestra en la Figura P, las clases de moléculas pueden ordenarse por su retención relativa en un rango o espectro de polaridad cromatográfica que va de muy polar a muy apolar.

Figura P: Espectro de polaridad cromatográfica por grupo funcional del analito

El agua es un compuesto polar. El benceno es un compuesto no polar. Las moléculas con una polaridad cromatográfica similar tienden a atraerse entre sí; las que tienen una polaridad diferente muestran una atracción mucho más débil, si es que la tienen, e incluso pueden repelerse. Esto se convierte en la base de los modos de separación cromatográfica basados en la polaridad.

Otra forma de pensar en esto es mediante la conocida analogía: el aceite y el agua no se mezclan. A diferencia del magnetismo, donde los polos opuestos se atraen, las separaciones cromatográficas basadas en la polaridad dependen de la atracción más fuerte entre los semejantes y la atracción más débil entre los opuestos. Recuerde que «lo semejante atrae a lo semejante» en la cromatografía basada en la polaridad.

Figura Q: La combinación adecuada de las fases móvil y estacionaria afecta a la separación basada en la polaridad

Para diseñar un sistema de separación cromatográfica, creamos una competencia para los diversos compuestos contenidos en la muestra eligiendo una fase móvil y una fase estacionaria con diferentes polaridades. Entonces, los compuestos de la muestra que tienen una polaridad similar a la de la fase estacionaria se retrasarán porque son atraídos más fuertemente por las partículas. Los compuestos cuya polaridad es similar a la de la fase móvil serán atraídos preferentemente por ella y se moverán más rápido.

De este modo, basándose en las diferencias en la atracción relativa de cada compuesto por cada fase, se crea una separación cambiando las velocidades de los analitos.

Las figuras R-1, R-2 y R-3 muestran rangos típicos de polaridad cromatográfica para las fases móviles, las fases estacionarias y los analitos de la muestra, respectivamente. Consideremos cada una de ellas para ver cómo un cromatógrafo elige las fases apropiadas para desarrollar la competencia de atracción necesaria para lograr una separación por HPLC basada en la polaridad.

Figura R-1: Espectro de polaridad cromatográfica de la fase móvil

Una escala, como la que se muestra en la Figura R-1, en la que algunos disolventes comunes se colocan en orden de polaridad cromatográfica relativa se denomina serie eluotrópica. Las moléculas de la fase móvil que compiten eficazmente con las moléculas del analito por los sitios atractivos de la fase estacionaria desplazan a estos analitos, haciendo que se muevan más rápidamente a través de la columna . El agua está en el extremo polar de la escala fase móvil-disolvente, mientras que el hexano, un hidrocarburo alifático, está en el extremo no polar. En medio, los disolventes individuales, así como las mezclas de disolventes miscibles, pueden colocarse en orden de fuerza de elución. El extremo de la escala que representa la fase móvil «más fuerte» depende de la naturaleza de la superficie de la fase estacionaria en la que se produce la competencia por las moléculas del analito.

Figura R-2: Espectro de polaridad cromatográfica de partículas de la fase estacionaria

La sílice tiene una superficie activa e hidrófila que contiene grupos funcionales de silanol ácidos. En consecuencia, se encuentra en el extremo polar de la escala de fase estacionaria que se muestra en la Figura R-2. La actividad o polaridad de la superficie de sílice puede modificarse selectivamente mediante la unión química de grupos funcionales menos polares. Los ejemplos mostrados aquí incluyen, en orden de polaridad decreciente, cianopropilsil- , n-octilsilil- , y n-octadecilsilil- sobre la sílice. Este último es un empaque hidrofóbico, muy no polar.

Figura R-3: Espectro de polaridad cromatográfica del compuesto/alito

La figura R-3 repite el espectro de polaridad cromatográfica de nuestra muestra . Después de considerar la polaridad de ambas fases, entonces, para una fase estacionaria dada, un cromatógrafo debe elegir una fase móvil en la que los analitos de interés sean retenidos, pero no con tanta fuerza que no puedan ser eluidos. Entre los disolventes de fuerza similar, el cromatógrafo considera qué combinación de fases puede explotar mejor las diferencias más sutiles en la polaridad y solubilidad del analito para maximizar la selectividad del sistema cromatográfico. Los semejantes atraen a los semejantes, pero, como probablemente pueda imaginar por lo expuesto hasta ahora, crear una separación basada en la polaridad implica el conocimiento de la muestra y la experiencia con diversos tipos de analitos y modos de retención. En resumen, el cromatógrafo elegirá la mejor combinación de fase móvil y fase estacionaria de partículas con polaridades adecuadamente opuestas. Entonces, a medida que los analitos de la muestra se mueven a través de la columna, la regla de que lo semejante atrae a lo semejante determinará qué analitos se ralentizan y cuáles avanzan a mayor velocidad.

HPLC en fase normal

En sus separaciones de extractos de plantas, Tswett tuvo éxito utilizando una fase estacionaria polar con una fase móvil mucho menos polar. Este modo clásico de cromatografía se conoció como fase normal.

Figura S-1: Cromatografía en fase normal

La figura S-1 representa una separación cromatográfica en fase normal de nuestra mezcla de prueba de tres colorantes. La fase estacionaria es polar y retiene con mayor intensidad el colorante amarillo polar. El colorante azul, relativamente no polar, es ganado en la competición de retención por la fase móvil, un disolvente no polar, y eluye rápidamente. Como el colorante azul es el más parecido a la fase móvil, se mueve más rápido. Es típico de la cromatografía de fase normal sobre sílice que la fase móvil sea 100% orgánica; no se utiliza agua.

HPLC de fase inversa

El término fase inversa describe el modo de cromatografía que es justo lo contrario de la fase normal, es decir, el uso de una fase móvil polar y una fase estacionaria no polar. La figura S-2 ilustra la mezcla de tres colorantes negros que se separan utilizando dicho protocolo.

Figura S-2: Cromatografía de fase inversa

Ahora el compuesto más fuertemente retenido es el colorante azul más apolar, ya que su atracción por la fase estacionaria no polar es mayor. El colorante amarillo polar, al ser débilmente retenido, es ganado en la competencia por la fase móvil acuosa polar, se mueve más rápidamente a través del lecho y eluye más pronto lo que se atrae.

Hoy en día, debido a que es más reproducible y tiene una amplia aplicabilidad, la cromatografía de fase inversa se utiliza para aproximadamente el 75% de todos los métodos de HPLC. La mayoría de estos protocolos utilizan como fase móvil una mezcla acuosa de agua con un disolvente orgánico miscible y polar, como el acetonitrilo o el metanol. Esto suele garantizar la correcta interacción de los analitos con la superficie no polar e hidrofóbica de la partícula. Una sílice con enlace C18 es el tipo más popular de empaque de HPLC de fase inversa.

La Tabla C presenta un resumen de las características de la fase para los dos modos principales de separación de HPLC basados en la polaridad. Recuerde, para estos modos basados en la polaridad, lo semejante atrae a lo semejante.

Tabla C: Características de la fase para separaciones basadas en la polaridad

Cromatografía de interacción hidrofílica

HILIC puede considerarse una variante de la cromatografía de fase normal. En la cromatografía de fase normal, la fase móvil es 100% orgánica. Sólo hay trazas de agua en la fase móvil y en los poros de las partículas de empaquetamiento polar. Los analitos polares se unen fuertemente a la fase estacionaria polar y pueden no eluir.

Añadir algo de agua a la fase móvil orgánica permite separar y eluir compuestos polares que son fuertemente retenidos en el modo de fase normal . El agua, un disolvente muy polar, compite eficazmente con los analitos polares por la fase estacionaria. La técnica HILIC puede utilizarse en modo de elución isocrática o en modo de elución en gradiente. Los compuestos polares que son atraídos inicialmente por las partículas del material de empaquetamiento polar pueden ser eluidos a medida que se incrementa la polaridad de la fase móvil. Los analitos se eluyen en orden de hidrofilia creciente. Pueden añadirse tampones o sales a la fase móvil para mantener los analitos ionizables en una sola forma.

Cromatografía de interacción hidrofóbica

HIC es un tipo de cromatografía de fase inversa que se utiliza para separar biomoléculas grandes, como las proteínas. Normalmente es deseable mantener estas moléculas intactas en una solución acuosa, evitando el contacto con disolventes orgánicos o superficies que puedan desnaturalizarlas. El HIC aprovecha la interacción hidrofóbica de las moléculas grandes con una fase estacionaria moderadamente hidrofóbica, por ejemplo, sílice con enlace butílico, en lugar de sílice con enlace octadecílico. Inicialmente, las mayores concentraciones de sal en el agua favorecerán la retención de las proteínas en el empaque. Las separaciones en gradiente se realizan normalmente disminuyendo la concentración de sal. De este modo, las biomoléculas se eluyen en orden de hidrofobicidad creciente.

Separaciones basadas en la carga: Cromatografía de intercambio iónico

Para las separaciones basadas en la polaridad, lo semejante es atraído por lo semejante y los opuestos pueden ser repelidos. En la cromatografía de intercambio iónico y otras separaciones basadas en la carga eléctrica, la regla se invierte. Los similares pueden repelerse, mientras que los opuestos se atraen. Las fases estacionarias para las separaciones por intercambio iónico se caracterizan por la naturaleza y la fuerza de las funciones ácidas o básicas en sus superficies y los tipos de iones que atraen y retienen. El intercambio de cationes se utiliza para retener y separar los iones con carga positiva en una superficie negativa. Por el contrario, el intercambio de aniones se utiliza para retener y separar los iones cargados negativamente en una superficie positiva. Con cada tipo de intercambio iónico, hay al menos dos enfoques generales para la separación y la elución.

Figura T: Cromatografía de intercambio iónico

Los intercambiadores iónicos fuertes llevan grupos funcionales siempre ionizados. Suelen utilizarse para retener y separar iones débiles. Estos iones débiles pueden ser eluidos por desplazamiento con una fase móvil que contiene iones que son más fuertemente atraídos por los sitios de la fase estacionaria. Alternativamente, los iones débiles pueden ser retenidos en la columna, y luego neutralizados cambiando in situ el pH de la fase móvil, haciendo que pierdan su atracción y se eluyan.

Los intercambiadores de iones débiles pueden ser neutralizados por encima o por debajo de un determinado valor de pH y perder su capacidad de retener iones por carga. Cuando están cargados, se utilizan para retener y separar iones fuertes. Si estos iones no pueden ser eluidos por desplazamiento, entonces los sitios de intercambio de la fase estacionaria pueden ser neutralizados, apagando la atracción iónica, y permitiendo la elución de los analitos cargados.

Tabla D: Directrices de intercambio iónico

Cuando los intercambiadores iónicos débiles son neutralizados, pueden retener y separar especies por interacciones hidrofóbicas o hidrofílicas; en estos casos, la fuerza de elución está determinada por la polaridad de la fase móvil . Así, los intercambiadores de iones débiles pueden utilizarse para separaciones de modo mixto.

La tabla D esboza las directrices para las principales categorías de intercambio de iones. Por ejemplo, para retener un analito fuertemente básico, utilice una partícula de fase estacionaria de intercambio catiónico débil a pH > 7; esto asegura una superficie de partícula cargada negativamente. Para liberar o eluir la base fuerte, baje el pH de la fase móvil por debajo de 3; esto elimina la carga de la superficie y desactiva el mecanismo de retención por intercambio iónico.

Nótese que un pKa es el valor de pH en el que el 50% del grupo funcional está ionizado y el 50% es neutro. Para asegurar una superficie de analito o partícula esencialmente neutra, o totalmente cargada, el pH debe ajustarse a un valor al menos 2 unidades más allá del pKa, según corresponda.

No utilice un intercambiador de cationes fuertes para retener una base fuerte; ambos permanecen cargados y se atraen fuertemente entre sí, haciendo que la base sea casi imposible de eluir. Sólo puede eliminarse inundando el intercambiador de cationes fuertes con una base competidora que muestre una retención aún más fuerte y desplace el compuesto de interés ganando la competencia por los sitios de intercambio activos. Este enfoque rara vez es práctico, o seguro, en HPLC y SPE.

Separaciones basadas en el tamaño: Cromatografía de exclusión por tamaño –

En la década de 1950, Porath y Flodin descubrieron que las biomoléculas podían separarse en función de su tamaño, en lugar de su carga o polaridad, haciéndolas pasar, o filtrándolas, a través de un polímero de dextrano hidrofílico de porosidad controlada. Este proceso se denominó filtración en gel. Posteriormente, se utilizó un esquema análogo para separar oligómeros y polímeros sintéticos utilizando paquetes de polímeros orgánicos con rangos específicos de tamaño de poro. Este proceso se denominó cromatografía de permeación en gel. Las separaciones similares realizadas con paquetes de sílice de porosidad controlada se denominaron cromatografía de exclusión por tamaño. Introducidos en 1963, los primeros instrumentos comerciales de HPLC se diseñaron para aplicaciones de GPC.

Todas estas técnicas se realizan normalmente en fases estacionarias que han sido sintetizadas con una distribución del tamaño de los poros en un rango que permite que los analitos de interés entren, o sean excluidos, en mayor o menor medida del volumen de poros del empaque. Las moléculas más pequeñas penetran más en los poros en su paso por el lecho. Las moléculas más grandes sólo pueden penetrar en los poros a partir de un determinado tamaño, por lo que pasan menos tiempo en el lecho. Las moléculas más grandes pueden quedar totalmente excluidas de los poros y pasar sólo entre las partículas, eluyendo muy rápidamente en un pequeño volumen. Las fases móviles se eligen por dos razones: en primer lugar, son buenos disolventes para los analitos y, en segundo lugar, pueden evitar cualquier interacción entre los analitos y la superficie de la fase estacionaria. De este modo, las moléculas más grandes eluyen primero, mientras que las moléculas más pequeñas viajan más lentamente y eluyen después, en orden decreciente de su tamaño en la solución. De ahí la sencilla regla: las grandes salen primero.

Dado que es posible correlacionar el peso molecular de un polímero con su tamaño en solución, la GPC revolucionó la medición de la distribución del peso molecular de los polímeros que, a su vez, determina las características físicas que pueden mejorar, o perjudicar, el procesamiento, la calidad y el rendimiento de los polímeros.

Conclusión