一般に、HPLC分離を行うには、化学物質の3つの主要な特性を利用することができます。
– 極性
– 電荷
– 分子サイズ
最初に、極性と、この特性を利用した2つの主要な分離モード、順相および逆相クロマトグラフィーについて説明します。
極性による分離
分子の構造、活性、物理化学特性は構成原子とそれらの間の結合により決定されます。 分子内で、特別な性質や予測可能な化学反応の原因となる特定の原子の配置を官能基と呼ぶ。 この構造によって、その分子が極性か非極性かが決まることが多い。 有機分子は、それぞれの分子が持つ主要な官能基によって分類される。 極性に基づく分離モードを使用すると、異なる種類の分子の相対的なクロマトグラフィー保持は、これらの官能基の性質と位置によってほぼ決定されます。 図Pに示すように、分子のクラスは、相対的な保持によって、高極性から高非極性までのクロマトグラフィ極性の範囲またはスペクトルに並べ替えられます。
図P：分析物の官能基によるクロマトグラフィ極性スペクトル
水は極性化合物です。 ベンゼンは非極性化合物である。 クロマトグラフィーの極性が近い分子同士は引き合う傾向があり、極性が異なる分子は引き合う力が弱く、反発し合うこともあります。 これは、極性に基づくクロマトグラフィ分離モードの基礎となります。
このことを考えるもう1つの方法は、よく知られている「油と水は混ざらない」という例えです。 極性に基づくクロマトグラフィ分離は、磁気のように反対極が互いに引き合うのではなく、同種のもの同士は強く、異種のもの同士は弱く引き合うことに依存しています。
図Q: 移動相と固定相の適切な組み合わせが極性に基づく分離に影響
クロマトグラフィー分離システムを設計するには、極性の異なる移動相と固定相を選択して、サンプルに含まれるさまざまな化合物を競争させる必要があります。 すると、サンプル中の化合物のうち、固定相と極性が近いものは、より強く粒子に引き寄せられるため、遅れをとることになります。
このように、各相に対する化合物の相対的な吸引力の違いから、分析対象物の速度を変化させることで分離を行います。図R-1、R-2、R-3に、それぞれ移動相、固定相、サンプル分析対象物の典型的なクロマトグラフィー極性範囲を示します。 クロマトグラファーがどのように適切な相を選択し、極性ベースのHPLC分離に必要な引力の競合を発生させるか、順番に考えてみましょう。
図 R-1: 移動相クロマトグラフィー極性スペクトル
図 R-1 などで、いくつかの共通溶媒をクロマトグラフィー極性順に並べているスケールを溶媒系と呼びます。 移動相分子は、被分析物分子と競合して魅力的な固定相サイトを獲得し、被分析物を置換してカラム内をより速く移動させます。 水は移動相-溶媒系の極性に位置し、脂肪族炭化水素であるヘキサンは非極性に位置する。 その中間に位置するのが、単一溶媒や混和溶媒で、溶出力の強い順に並べることができます。
図 R-2: 固定相粒子クロマトグラフィー極性スペクトル
シリカは酸性シラノール官能基を含む活性親水性表面を持っています。 その結果、図R-2に示すように、静止相の極性に位置することになります。 シリカ表面の活性や極性は、極性の低い官能基を化学的に結合させることにより、選択的に変更することができる。 ここでは、極性の低い順にシアノプロピルシリル基、n-オクチルシリル基、n-オクタデシルシリル基をシリカに結合させた例を示す。
Figure R-3: Compound/Analyte Chromatographic Polarity Spectrum
サンプルのクロマトグラフ極性スペクトルを繰り返し表示します。 両相の極性を考慮した上で、ある固定相に対して、クロマトグラファーは分析対象物を保持し、かつ溶出できないほど強く保持しない移動相を選択しなければなりません。 クロマトグラファーは、同じ強さの溶媒の中で、分析物の極性と溶解度の微妙な違いを利用して、クロマトグラフィーシステムの選択性を最大にするために、どの相の組み合わせが最適かを検討します。 類は友を呼びますが、これまでの議論から想像できるように、極性に基づく分離を行うには、サンプルに関する知識とさまざまな種類の分析物および保持モードに関する経験が必要です。 要約すると、クロマトグラファーは、極性が適切に反対である移動相と粒子固定相の最適な組み合わせを選択します。
Normal-Phase HPLC
植物抽出物の分離では、Tswettは極性固定相と極性の低い移動相を使用して成功しました。
Figure S-1: 順相クロマトグラフィー
図S-1は、3色試験混合物の順相クロマトグラフィー分離を表しています。 固定相は極性を持ち、極性のある黄色染料を最も強く保持する。 比較的非極性の青色色素は、非極性溶媒である移動相によって保持競争に勝利し、速やかに溶出する。 青色色素は移動相に最も似ているため、移動速度が速い。
Reversed-Phase HPLC
逆相という用語は、順相と逆のクロマトグラフィーモード、つまり極性移動相と非極性固定相を使用することを表します。 図S-2は、このようなプロトコルで分離された黒の3色混合物を示しています。
Figure S-2: Reversed-Phase Chromatography
ここで最も強い保持化合物は、非極性染料の青で、その非極性固定相への引力が最も高いからです。 極性の黄色染料は保持が弱く、極性のある水性移動相との競争に勝ち、ベッドを最も速く移動し、類は類を呼ぶように最も早く溶出します。
今日、より再現性が高く適用範囲が広いため、逆相クロマトグラフィーはすべてのHPLCメソッドの約75%で使用されています。 これらのプロトコルのほとんどは、水とアセトニトリルやメタノールなどの混和性の高い極性有機溶媒を混合した水溶液を移動相として使用しています。 これにより、非極性で疎水性の粒子表面と分析対象物の適切な相互作用が保証される。 C18結合シリカは、最も一般的な逆相HPLC充填剤です。
Table Cは、極性に基づく2つの主要なHPLC分離モードの相特性の概要を示しています。 これらの極性に基づくモードでは、類は友を呼ぶのです。
Table C: 極性に基づく分離の位相特性
Hydrophilic-Interaction Chromatography
HILICは順相クロマトグラフィの変形と見なすことができます。 順相クロマトグラフィーの場合、移動相は100%有機物です。 移動相と極性充填剤の細孔には、微量の水しか存在しません。 極性化合物は極性固定相に強く結合し、溶出しないことがあります。
有機移動相に水を加えることで、順相では強く保持される極性化合物を分離、溶出させることができます。 極性溶媒である水は、極性化合物と固定相の取り合いとなる。 HILICは、アイソクラティック溶出モードとグラジエント溶出モードのいずれでも使用可能です。 極性化合物は、移動相の極性を上げることにより、極性充填剤に引き寄せられ、溶出されます。 分析対象物は、親水性の高い順に溶出されます。
Hydrophobic-Interaction Chromatography
HIC は逆相クロマトグラフィーの一種で、タンパク質などの大きな生体分子を分離するために使用されます。 通常、これらの分子は水溶液中でそのままの状態を保ち、有機溶媒や表面との接触を避けて変性させることが望まれる。 HICは、大きな分子と適度な疎水性を持つ固定相（例えば、オクタデシル結合ではなくブチル結合のシリカ）との疎水性相互作用を利用する。 当初、水中の塩濃度が高いほど、タンパク質は充填剤に保持されるようになる。 塩濃度を下げながら勾配分離を行うのが一般的である。 このようにして、生体分子は疎水性の高い順に溶出される。
電荷に基づく分離。 イオン交換クロマトグラフィー
極性に基づく分離では、同類は同類に引き寄せられ、反対同士は反発し合うことがあります。 イオン交換クロマトグラフィーやその他の電荷に基づく分離では、この法則は逆となります。 同種のものは反発し、異種のものは引き寄せられます。 イオン交換分離のための固定相は、その表面の酸性または塩基性機能の性質と強さ、および引き寄せたり保持したりするイオンの種類によって特徴付けられます。 陽イオン交換は、正電荷のイオンを負電荷の表面に保持し分離するために使用されます。 逆に、陰イオン交換は、プラスに帯電したイオンを保持・分離するために使われる。
図T.イオン交換の種類によって、分離と溶出には少なくとも2つの一般的なアプローチがあります。 イオン交換クロマトグラフィー
強力なイオン交換体は、常にイオン化している官能基を持っています。 一般的には、弱いイオンを保持し、分離するために使用されます。 これらの弱イオンは、固定相部位に強く引き寄せられるイオンを含む移動相で置換することにより、溶出されることがあります。
弱イオン交換体は、あるpH値以上または以下では中和され、電荷によってイオンを保持する能力を失います。 帯電すると、強いイオンを保持し分離するために使用されます。
Table D: Ion-Exchange Guidelines
弱いイオン交換体が中和されると、疎水性または親水性相互作用によって種を保持し分離することができます。 このように、弱イオン交換体は混合モードの分離に使用されることがあります。
Table Dは、イオン交換の主要なカテゴリに関するガイドラインの概要を示しています。 例えば、塩基性の強い分析物を保持するためには、pH > 7の弱カチオン交換固定相粒子を使用し、これにより粒子表面が負に帯電することが保証されます。 pKaは、官能基の50%がイオン化し、50%が中性となるpH値であることに注意してください。
強塩基を保持するために強陽イオン交換体を使用しないでください。両者は帯電したままで、互いに強く引き合うため、塩基の溶出はほとんど不可能です。 強陽イオン交換体を、さらに強い保持力を示す競合塩基で満たし、活性交換部位の競争に勝つことで目的の化合物を置き換えることでしか、塩基を除去することはできない。 この方法は、HPLCやSPEではほとんど実用的でなく、安全でもない。
サイズに基づく分離。 サイズ排除クロマトグラフィー –
1950年代、PorathとFlodinは、生体分子を多孔性を制御した親水性のデキストランポリマーに通す、またはろ過することにより、電荷や極性ではなく、サイズに基づいて分離できることを発見しました。 このプロセスは、ゲルろ過と呼ばれるようになった。 その後、合成されたオリゴマーやポリマーを、特定の細孔径を持つ有機ポリマーパッキングで分離する方法が開発された。 この方法はゲル浸透クロマトグラフィーと呼ばれた。 細孔径を制御したシリカパックを用いた同様の分離は、サイズ排除クロマトグラフィーと呼ばれました。 1963年に発表された最初の商業用HPLC装置は、GPCアプリケーション用に設計されました。
これらの技術はすべて、通常、分析対象物が充填物の細孔容積の多くまたは少ない部分に入り、または排除されるような範囲の細孔径分布で合成された固定相を用いて行われます。 小さな分子は、ベッドを通過する際に、より多くの細孔に入り込む。 より大きな分子は、あるサイズ以上の孔にしか入らないので、ベッドで過ごす時間が短くなる。 最も大きな分子は、孔から完全に排除され、粒子間のみを通過し、少量で非常に速く溶出することができる。 移動相を選択する理由は2つある。1つは分析対象物の溶媒として適していること、もう1つは分析対象物と固定相の間の相互作用を防ぐことができることである。 このようにして、大きな分子が先に溶出し、小さな分子はゆっくりと移動し、溶液中の大きさの順に遅れて溶出するのである。 GPC は、ポリマーの分子量と溶液中のサイズを関連付けることができるため、ポリマーの分子量分布の測定に革命をもたらしました。