Modes de séparation HPLC

En général, trois caractéristiques principales des composés chimiques peuvent être utilisées pour créer des séparations HPLC. Ce sont :

– la polarité
– la charge électrique
– la taille moléculaire

D’abord, considérons la polarité et les deux principaux modes de séparation qui exploitent cette caractéristique : la chromatographie en phase normale et la chromatographie en phase inversée.

Séparations basées sur la polarité

La structure, l’activité et les caractéristiques physico-chimiques d’une molécule sont déterminées par l’arrangement de ses atomes constitutifs et les liaisons entre eux. Au sein d’une molécule, un arrangement spécifique de certains atomes, responsable de propriétés particulières et de réactions chimiques prévisibles, est appelé groupe fonctionnel. Cette structure détermine souvent si la molécule est polaire ou non polaire. Les molécules organiques sont classées en classes en fonction du ou des principaux groupes fonctionnels qu’elles contiennent. En utilisant un mode de séparation basé sur la polarité, la rétention chromatographique relative de différents types de molécules est largement déterminée par la nature et l’emplacement de ces groupes fonctionnels. Comme le montre la figure P, les classes de molécules peuvent être ordonnées par leur rétention relative dans une gamme ou un spectre de polarité chromatographique allant de très polaire à très non polaire.

Figure P : Spectre de polarité chromatographique par groupe fonctionnel de l’analyte

L’eau est un composé polaire. Le benzène est un composé non polaire. Les molécules ayant une polarité chromatographique similaire ont tendance à être attirées les unes vers les autres ; celles ayant une polarité dissemblable présentent une attraction beaucoup plus faible, voire nulle, et peuvent même se repousser. Cela devient la base des modes de séparation chromatographique basés sur la polarité.

Une autre façon de penser à cela est par l’analogie familière : l’huile et l’eau ne se mélangent pas. Contrairement au magnétisme où les pôles opposés s’attirent, les séparations chromatographiques basées sur la polarité dépendent de l’attraction plus forte entre les aimants et de l’attraction plus faible entre les opposés. Rappelez-vous, « Les semblables s’attirent » en chromatographie basée sur la polarité.

Figure Q : La combinaison appropriée des phases mobile et stationnaire affecte la séparation basée sur la polarité

Pour concevoir un système de séparation chromatographique , nous créons une compétition pour les différents composés contenus dans l’échantillon en choisissant une phase mobile et une phase stationnaire de polarités différentes. Ensuite, les composés de l’échantillon dont la polarité est similaire à celle de la phase stationnaire seront retardés car ils sont plus fortement attirés par les particules. Les composés dont la polarité est similaire à celle de la phase mobile seront préférentiellement attirés par celle-ci et se déplaceront plus rapidement.

De cette façon, sur la base des différences dans l’attraction relative de chaque composé pour chaque phase, une séparation est créée en changeant les vitesses des analytes.

Les figures R-1, R-2 et R-3 présentent des plages de polarité chromatographiques typiques pour les phases mobiles, les phases stationnaires et les analytes de l’échantillon, respectivement. Considérons chacune d’entre elles tour à tour pour voir comment un chromatographe choisit les phases appropriées pour développer la compétition d’attraction nécessaire à la réalisation d’une séparation HPLC basée sur la polarité.

Figure R-1 : Spectre de polarité chromatographique de la phase mobile

Une échelle, telle que celle présentée dans la figure R-1, sur laquelle certains solvants courants sont placés par ordre de polarité chromatographique relative est appelée série éluotrope. Les molécules de phase mobile qui entrent en compétition avec les molécules d’analyte pour les sites attractifs de la phase stationnaire déplacent ces analytes, ce qui les fait se déplacer plus rapidement dans la colonne. L’eau se situe à l’extrémité polaire de l’échelle phase mobile-solvant, tandis que l’hexane, un hydrocarbure aliphatique, se situe à l’extrémité non polaire. Entre les deux, les solvants individuels, ainsi que les mélanges de solvants miscibles, peuvent être classés par ordre de force d’élution. L’extrémité de l’échelle qui représente la phase mobile  » la plus forte  » dépend de la nature de la surface de la phase stationnaire où se produit la compétition pour les molécules d’analyte.

Figure R-2 : Spectre de polarité chromatographique des particules en phase stationnaire

La silice a une surface active et hydrophile contenant des groupes fonctionnels silanol acides. Par conséquent, elle se situe à l’extrémité polaire de l’échelle de la phase stationnaire illustrée à la figure R-2. L’activité ou la polarité de la surface de la silice peut être modifiée sélectivement en lui liant chimiquement des groupes fonctionnels moins polaires. Les exemples illustrés ici comprennent, par ordre de polarité décroissante, les groupements cyanopropylsilyle- , n-octylsilyle- et n-octadécylsilyle- sur la silice. Cette dernière est un garnissage hydrophobe , très peu polaire.

Figure R-3 : Spectre de polarité chromatographique composé/analyte

Figure R-3 répète le spectre de polarité chromatographique de notre échantillon . Après avoir considéré la polarité des deux phases, donc, pour une phase stationnaire donnée, un chromatographe doit choisir une phase mobile dans laquelle les analytes d’intérêt sont retenus, mais pas si fortement qu’ils ne peuvent être élués. Parmi les solvants de force similaire, le chromatographe examine quelle combinaison de phases peut le mieux exploiter les différences plus subtiles de polarité et de solubilité des analytes pour maximiser la sélectivité du système chromatographique. Les similitudes s’attirent, mais, comme vous pouvez probablement l’imaginer d’après ce qui a été dit jusqu’à présent, la création d’une séparation basée sur la polarité implique la connaissance de l’échantillon et l’expérience de différents types d’analytes et de modes de rétention. Pour résumer, le chromatographe choisira la meilleure combinaison d’une phase mobile et d’une phase stationnaire de particules avec des polarités opposées appropriées. Ensuite, lorsque les analytes de l’échantillon se déplacent dans la colonne, la règle du semblable attire le semblable déterminera quels analytes ralentissent et lesquels avancent à une vitesse plus rapide.

HPLC à phase normale

Dans ses séparations d’extraits de plantes, Tswett a réussi à utiliser une phase stationnaire polaire avec une phase mobile beaucoup moins polaire. Ce mode classique de chromatographie est devenu connu sous le nom de phase normale.

Figure S-1 : Chromatographie en phase normale

La figure S-1 représente une séparation chromatographique en phase normale de notre mélange test à trois colorants. La phase stationnaire est polaire et retient le plus fortement le colorant jaune polaire. Le colorant bleu, relativement non polaire, est gagné dans la compétition de rétention par la phase mobile, un solvant non polaire, et s’élue rapidement. Comme le colorant bleu ressemble le plus à la phase mobile, il se déplace plus rapidement. Il est typique pour la chromatographie en phase normale sur silice que la phase mobile soit 100% organique ; aucune eau n’est utilisée.

HPLC en phase inversée

Le terme phase inversée décrit le mode de chromatographie qui est juste l’opposé de la phase normale, à savoir l’utilisation d’une phase mobile polaire et d’une phase stationnaire non-polaire. La figure S-2 illustre le mélange noir à trois colorants séparé à l’aide d’un tel protocole.

Figure S-2 : chromatographie en phase inversée

Maintenant, le composé le plus fortement retenu est le colorant bleu plus non-polaire, car son attraction pour la phase stationnaire non-polaire est la plus grande. Le colorant jaune polaire, étant faiblement retenu, est gagné en compétition par la phase mobile polaire et aqueuse, se déplace le plus rapidement à travers le lit, et élue le plus tôt les semblables s’attirent.

Aujourd’hui, parce qu’elle est plus reproductible et a une large applicabilité, la chromatographie en phase inversée est utilisée pour environ 75% de toutes les méthodes HPLC. La plupart de ces protocoles utilisent comme phase mobile un mélange aqueux d’eau avec un solvant organique polaire miscible, tel que l’acétonitrile ou le méthanol. Cela garantit généralement une interaction adéquate des analytes avec la surface non polaire et hydrophobe des particules. Une silice liée à C18 est le type le plus populaire de garnissage HPLC en phase inversée.

Le tableau C présente un résumé des caractéristiques de phase pour les deux principaux modes de séparation HPLC basés sur la polarité. Rappelez-vous, pour ces modes basés sur la polarité, les semblables attirent les semblables.

Tableau C : Caractéristiques de phase pour les séparations basées sur la polarité

Chromatographie à interaction hydrophile

La HILIC peut être considérée comme une variante de la chromatographie en phase normale. Dans la chromatographie en phase normale, la phase mobile est 100% organique. Seules des traces d’eau sont présentes dans la phase mobile et dans les pores des particules de garnissage polaire. Les analytes polaires se lient fortement à la phase stationnaire polaire et peuvent ne pas éluer.

L’ajout d’un peu d’eau à la phase mobile organique permet de séparer et d’éluer les composés polaires qui sont fortement retenus en mode phase normale . L’eau, un solvant très polaire, concurrence efficacement les analytes polaires pour la phase stationnaire. La méthode HILIC peut être utilisée en mode d’élution isocratique ou à gradient. Les composés polaires qui sont initialement attirés par les particules du matériau de garnissage polaire peuvent être élués lorsque la polarité de la phase mobile augmente. Les analytes sont élués par ordre croissant d’hydrophilie. Des tampons ou des sels peuvent être ajoutés à la phase mobile pour maintenir les analytes ionisables sous une forme unique.

Chromatographie à interaction hydrophobe

La CIH est un type de chromatographie en phase inverse qui est utilisé pour séparer les grandes biomolécules, telles que les protéines. Il est généralement souhaitable de maintenir ces molécules intactes dans une solution aqueuse, en évitant le contact avec des solvants organiques ou des surfaces qui pourraient les dénaturer. Le procédé HIC tire parti de l’interaction hydrophobe des grandes molécules avec une phase stationnaire modérément hydrophobe, par exemple une silice à liaison butyle plutôt qu’octadécyle. Initialement, des concentrations de sel plus élevées dans l’eau favoriseront la rétention des protéines sur le garnissage. Les séparations par gradient sont généralement réalisées en diminuant la concentration en sel. De cette façon, les biomolécules sont éluées par ordre d’hydrophobie croissante.

Séparations basées sur la charge : Chromatographie par échange d’ions

Pour les séparations basées sur la polarité, les semblables sont attirés par les semblables et les opposés peuvent être repoussés. En chromatographie par échange d’ions et autres séparations basées sur la charge électrique, la règle est inversée. Les semblables peuvent se repousser, tandis que les opposés sont attirés l’un vers l’autre. Les phases stationnaires pour les séparations par échange d’ions sont caractérisées par la nature et la force des fonctions acides ou basiques sur leurs surfaces et les types d’ions qu’elles attirent et retiennent. L’échange de cations est utilisé pour retenir et séparer les ions chargés positivement sur une surface négative. Inversement, l’échange d’anions est utilisé pour retenir et séparer les ions chargés négativement sur une surface positive. Avec chaque type d’échange d’ions, il existe au moins deux approches générales pour la séparation et l’élution.

Figure T : Chromatographie par échange d’ions

Les échangeurs d’ions forts portent des groupes fonctionnels qui sont toujours ionisés. Ils sont généralement utilisés pour retenir et séparer les ions faibles. Ces ions faibles peuvent être élués par déplacement avec une phase mobile contenant des ions qui sont plus fortement attirés par les sites de la phase stationnaire. Alternativement, les ions faibles peuvent être retenus sur la colonne, puis neutralisés en modifiant in situ le pH de la phase mobile, ce qui leur fait perdre leur attraction et les fait éluer.

Les échangeurs d’ions faibles peuvent être neutralisés au-dessus ou en dessous d’une certaine valeur de pH et perdre leur capacité à retenir les ions par charge. Lorsqu’ils sont chargés, ils sont utilisés pour retenir et séparer les ions forts. Si ces ions ne peuvent pas être élués par déplacement, alors les sites d’échange de la phase stationnaire peuvent être neutralisés, coupant l’attraction ionique, et permettant l’élution des analytes chargés.

Tableau D : Directives sur l’échange d’ions

Lorsque les échangeurs d’ions faibles sont neutralisés, ils peuvent retenir et séparer les espèces par des interactions hydrophobes ou hydrophiles ; dans ces cas, la force d’élution est déterminée par la polarité de la phase mobile . Ainsi, les échangeurs d’ions faibles peuvent être utilisés pour des séparations à mode mixte .

Le tableau D présente des lignes directrices pour les principales catégories d’échange d’ions. Par exemple, pour retenir un analyte fortement basique , utiliser une particule de phase stationnaire à échange de cations faibles à pH > 7 ; cela assure une surface de particule chargée négativement. Pour libérer ou éluer la base forte, abaisser le pH de la phase mobile en dessous de 3 ; cela supprime la charge de surface et arrête le mécanisme de rétention par échange d’ions.

Notez qu’un pKa est la valeur de pH à laquelle 50% du groupe fonctionnel est ionisé et 50% est neutre. Pour assurer une surface d’analyte ou de particule essentiellement neutre, ou entièrement chargée, le pH doit être ajusté à une valeur d’au moins 2 unités au-delà du pKa, selon le cas.

Ne pas utiliser un échangeur de cations forts pour retenir une base forte ; les deux restent chargés et fortement attirés l’un vers l’autre, rendant l’élution de la base presque impossible. Elle ne peut être éliminée qu’en submergeant l’échangeur de cations forts avec une base concurrente qui présente une rétention encore plus forte et déplace le composé d’intérêt en gagnant la compétition pour les sites d’échange actifs. Cette approche est rarement pratique, ou sûre, en HPLC et SPE.

Séparations basées sur la taille : Chromatographie d’exclusion de taille –

Dans les années 1950, Porath et Flodin ont découvert que les biomolécules pouvaient être séparées en fonction de leur taille, plutôt que de leur charge ou de leur polarité, en les faisant passer, ou en les filtrant, à travers un polymère dextran hydrophile à porosité contrôlée. Ce procédé a été baptisé « filtration sur gel ». Plus tard, un schéma analogue a été utilisé pour séparer les oligomères et les polymères synthétiques en utilisant des garnitures de polymères organiques avec des plages de tailles de pores spécifiques. Ce procédé a été appelé chromatographie par perméation de gel. Des séparations similaires réalisées à l’aide de garnitures de silice à porosité contrôlée ont été appelées chromatographie d’exclusion de taille. Introduits en 1963, les premiers instruments commerciaux HPLC ont été conçus pour les applications GPC.

Toutes ces techniques sont généralement réalisées sur des phases stationnaires qui ont été synthétisées avec une distribution de la taille des pores sur une plage qui permet aux analytes d’intérêt de pénétrer, ou d’être exclus, d’une plus ou moins grande partie du volume des pores du garnissage. Les molécules plus petites pénètrent dans un plus grand nombre de pores lors de leur passage dans le lit. Les molécules plus grosses peuvent ne pénétrer que dans les pores dépassant une certaine taille, de sorte qu’elles passent moins de temps dans le lit. Les plus grosses molécules peuvent être totalement exclues des pores et passer uniquement entre les particules, s’éluant très rapidement dans un petit volume. Les phases mobiles sont choisies pour deux raisons : premièrement, elles sont de bons solvants pour les analytes et, deuxièmement, elles peuvent empêcher toute interaction entre les analytes et la surface de la phase stationnaire. De cette façon, les plus grosses molécules éluent en premier, tandis que les plus petites molécules se déplacent plus lentement et éluent plus tard, dans l’ordre décroissant de leur taille en solution. D’où la règle simple : les plus grosses sortent en premier.

Puisqu’il est possible de corréler la masse moléculaire d’un polymère avec sa taille en solution, la GPC a révolutionné la mesure de la distribution de la masse moléculaire des polymères qui, à son tour, détermine les caractéristiques physiques qui peuvent améliorer, ou nuire, au traitement, à la qualité et à la performance des polymères .

Conclusion