HPLC-Trennverfahren

Im Allgemeinen können drei primäre Merkmale chemischer Verbindungen verwendet werden, um HPLC-Trennungen durchzuführen. Diese sind:

– Polarität
– Elektrische Ladung
– Molekülgröße

Zunächst betrachten wir die Polarität und die beiden primären Trennungsmodi, die dieses Merkmal ausnutzen: Normalphasen- und Umkehrphasen-Chromatographie.

Trennungen auf der Grundlage der Polarität

Die Struktur, die Aktivität und die physikalisch-chemischen Eigenschaften eines Moleküls werden durch die Anordnung der Atome, aus denen es besteht, und die Bindungen zwischen ihnen bestimmt. Innerhalb eines Moleküls wird eine spezifische Anordnung bestimmter Atome, die für besondere Eigenschaften und vorhersehbare chemische Reaktionen verantwortlich ist, als funktionelle Gruppe bezeichnet. Diese Struktur bestimmt oft, ob das Molekül polar oder unpolar ist. Organische Moleküle werden nach der/den wichtigsten funktionellen Gruppe(n), die sie enthalten, in Klassen eingeteilt. Die relative chromatografische Retention der verschiedenen Molekülarten wird weitgehend durch die Art und den Ort dieser funktionellen Gruppen bestimmt. Wie in Abbildung P dargestellt, können Molekülklassen anhand ihrer relativen Retention in einen Bereich oder ein Spektrum chromatographischer Polarität von stark polar bis stark unpolar eingeordnet werden.

Abbildung P: Chromatographisches Polaritätsspektrum nach funktioneller Gruppe des Analyten

Wasser ist eine polare Verbindung. Benzol ist eine unpolare Verbindung. Moleküle mit ähnlicher chromatographischer Polarität neigen dazu, sich gegenseitig anzuziehen, während Moleküle mit ungleicher Polarität, wenn überhaupt, eine viel schwächere Anziehung aufweisen und sich sogar gegenseitig abstoßen können. Dies ist die Grundlage für chromatographische Trennverfahren, die auf der Polarität beruhen.

Eine weitere Möglichkeit, sich dies vorzustellen, ist die bekannte Analogie: Öl und Wasser vermischen sich nicht. Anders als im Magnetismus, wo sich entgegengesetzte Pole gegenseitig anziehen, hängen chromatographische Trennungen auf der Grundlage der Polarität von der stärkeren Anziehung zwischen Gleichem und der schwächeren Anziehung zwischen Gegensätzlichem ab. Erinnern Sie sich: „Gleiches zieht Gleiches an“ in der auf Polarität basierenden Chromatographie.

Abbildung Q: Die richtige Kombination von mobiler und stationärer Phase wirkt sich auf die auf Polarität basierende Trennung aus

Um ein chromatographisches Trennsystem zu entwerfen, schaffen wir Wettbewerb für die verschiedenen in der Probe enthaltenen Verbindungen, indem wir eine mobile Phase und eine stationäre Phase mit unterschiedlichen Polaritäten wählen. Dann werden Verbindungen in der Probe, die eine ähnliche Polarität wie die stationäre Phase haben, verzögert, weil sie stärker von den Partikeln angezogen werden. Verbindungen, deren Polarität der der mobilen Phase ähnlich ist, werden bevorzugt von ihr angezogen und bewegen sich schneller.

Auf diese Weise wird auf der Grundlage von Unterschieden in der relativen Anziehungskraft jeder Verbindung für jede Phase eine Trennung erzeugt, indem die Geschwindigkeiten der Analyten verändert werden.

Die Abbildungen R-1, R-2 und R-3 zeigen typische chromatografische Polaritätsbereiche für mobile Phasen, stationäre Phasen bzw. Probenanalyten. Betrachten wir sie nacheinander, um zu sehen, wie ein Chromatograph die geeigneten Phasen auswählt, um die Anziehungskonkurrenz zu entwickeln, die für eine auf Polarität basierende HPLC-Trennung erforderlich ist.

Abbildung R-1: Chromatographisches Polaritätsspektrum der mobilen Phase

Eine Skala, wie die in Abbildung R-1 gezeigte, auf der einige gängige Lösungsmittel in der Reihenfolge ihrer relativen chromatographischen Polarität angeordnet sind, wird als eluotrope Reihe bezeichnet. Moleküle der mobilen Phase, die mit den Analytmolekülen um die attraktiven Plätze der stationären Phase konkurrieren, verdrängen diese Analyten, wodurch sie sich schneller durch die Säule bewegen. Wasser steht am polaren Ende der Skala der mobilen Phase und Lösungsmittel, während Hexan, ein aliphatischer Kohlenwasserstoff, am unpolaren Ende steht. Dazwischen können sowohl einzelne Lösungsmittel als auch mischbare Lösungsmittelgemische in der Reihenfolge ihrer Elutionsstärke eingeordnet werden. Welches Ende der Skala die „stärkste“ mobile Phase darstellt, hängt von der Beschaffenheit der Oberfläche der stationären Phase ab, auf der der Wettbewerb um die Analytmoleküle stattfindet.

Abbildung R-2: Chromatographisches Polaritätsspektrum der stationären Phase

Siliciumdioxid hat eine aktive, hydrophile Oberfläche, die saure funktionelle Silanolgruppen enthält. Folglich fällt es an das polare Ende der in Abbildung R-2 dargestellten Skala für stationäre Phasen. Die Aktivität oder Polarität der Siliciumdioxidoberfläche kann selektiv verändert werden, indem weniger polare funktionelle Gruppen chemisch an sie gebunden werden. Zu den hier gezeigten Beispielen gehören, in der Reihenfolge abnehmender Polarität, Cyanopropylsilyl- , n-Octylsilyl- und n-Octadecylsilyl-Gruppen auf Siliciumdioxid. Letztere ist eine hydrophobe, sehr unpolare Packung.

Abbildung R-3: Chromatographisches Polaritätsspektrum der Verbindung/Analyten

Abbildung R-3 zeigt das chromatographische Polaritätsspektrum unserer Probe. Nach Berücksichtigung der Polarität beider Phasen muss der Chromatograph also für eine gegebene stationäre Phase eine mobile Phase wählen, in der die interessierenden Analyten zurückgehalten werden, aber nicht so stark, dass sie nicht eluiert werden können. Unter Lösungsmitteln ähnlicher Stärke muss der Chromatograph abwägen, welche Phasenkombination die subtileren Unterschiede in der Polarität und Löslichkeit der Analyten am besten ausnutzen kann, um die Selektivität des chromatographischen Systems zu maximieren. Gleiches zieht Gleiches an, aber wie Sie sich aus der bisherigen Diskussion wahrscheinlich vorstellen können, erfordert die Erstellung einer Trennung auf der Grundlage der Polarität Kenntnisse über die Probe und Erfahrung mit verschiedenen Arten von Analyten und Retentionsmodi. Zusammenfassend lässt sich sagen, dass der Chromatograph die beste Kombination aus einer mobilen Phase und einer stationären Partikelphase mit entsprechend entgegengesetzten Polaritäten auswählt. Während sich die Analyten durch die Säule bewegen, bestimmt die Regel „Gleiches zieht Gleiches an“, welche Analyten langsamer und welche schneller werden.

Normalphasen-HPLC

Bei der Trennung von Pflanzenextrakten verwendete Tswett erfolgreich eine polare stationäre Phase mit einer viel weniger polaren mobilen Phase. Diese klassische Art der Chromatographie wurde als Normalphase bekannt.

Abbildung S-1: Normalphasen-Chromatographie

Abbildung S-1 zeigt eine normalphasige chromatographische Trennung unserer Dreifarbstoff-Testmischung. Die stationäre Phase ist polar und hält den polaren gelben Farbstoff am stärksten zurück. Der relativ unpolare blaue Farbstoff wird im Retentionswettbewerb durch die mobile Phase, ein unpolares Lösungsmittel, gewonnen und eluiert schnell. Da der blaue Farbstoff der mobilen Phase am ähnlichsten ist, bewegt er sich schneller. Typisch für die Normalphasenchromatographie auf Kieselgel ist, dass die mobile Phase zu 100 % organisch ist; es wird kein Wasser verwendet.

Umkehrphasen-HPLC

Der Begriff Umkehrphase beschreibt den Chromatographiemodus, der genau das Gegenteil der Normalphase ist, nämlich die Verwendung einer polaren mobilen Phase und einer unpolaren stationären Phase. Abbildung S-2 zeigt das schwarze Dreifarbstoffgemisch, das mit einem solchen Protokoll aufgetrennt wird.

Abbildung S-2: Reversed-Phase-Chromatographie

Die am stärksten zurückgehaltene Verbindung ist nun der unpolare blaue Farbstoff, da seine Anziehungskraft auf die unpolare stationäre Phase am größten ist. Der polare gelbe Farbstoff, der nur schwach zurückgehalten wird, gewinnt den Wettbewerb mit der polaren, wässrigen mobilen Phase, bewegt sich am schnellsten durch das Bett und eluiert am ehesten, wenn Gleiches auf Gleiches trifft.

Heutzutage wird die Umkehrphasenchromatographie aufgrund ihrer besseren Reproduzierbarkeit und breiten Anwendbarkeit für etwa 75 % aller HPLC-Methoden verwendet. Die meisten dieser Protokolle verwenden als mobile Phase ein wässriges Gemisch aus Wasser und einem mischbaren, polaren organischen Lösungsmittel, wie Acetonitril oder Methanol. Dies gewährleistet in der Regel die richtige Wechselwirkung der Analyten mit der unpolaren, hydrophoben Partikeloberfläche. Ein C18-gebundenes Siliziumdioxid ist die gängigste Art von Umkehrphasen-HPLC-Packungen.

Tabelle C enthält eine Zusammenfassung der Phaseneigenschaften für die beiden wichtigsten HPLC-Trennverfahren auf der Grundlage der Polarität. Denken Sie daran, dass bei diesen auf Polarität basierenden Modi Gleiches Gleiches anzieht.

Tabelle C: Phaseneigenschaften für Trennungen auf der Grundlage der Polarität

Hydrophile-Interaktions-Chromatographie

HILIC kann als eine Variante der Normalphasen-Chromatographie betrachtet werden. Bei der Normalphasenchromatographie ist die mobile Phase zu 100 % organisch. Nur Spuren von Wasser sind in der mobilen Phase und in den Poren der polaren Füllkörper vorhanden. Polare Analyten binden stark an die polare stationäre Phase und werden möglicherweise nicht eluiert.

Durch Zugabe von Wasser zur organischen mobilen Phase können polare Verbindungen, die im Normalphasenmodus stark zurückgehalten werden, getrennt und eluiert werden. Wasser, ein sehr polares Lösungsmittel, konkurriert effektiv mit polaren Analyten um die stationäre Phase. HILIC kann entweder im isokratischen Modus oder im Gradientenelutionsmodus durchgeführt werden. Polare Verbindungen, die zunächst von den Partikeln des polaren Füllmaterials angezogen werden, können eluiert werden, wenn die Polarität der mobilen Phase erhöht wird. Die Analyten werden in der Reihenfolge ihrer zunehmenden Hydrophilie eluiert. Der mobilen Phase können Puffer oder Salze zugesetzt werden, um ionisierbare Analyten in einer einzigen Form zu halten.

Hydrophobic-Interaction Chromatography

HIC ist eine Art der Umkehrphasen-Chromatographie, die zur Trennung großer Biomoleküle, wie z. B. Proteine, verwendet wird. In der Regel ist es wünschenswert, diese Moleküle in einer wässrigen Lösung intakt zu halten und den Kontakt mit organischen Lösungsmitteln oder Oberflächen zu vermeiden, die sie denaturieren könnten. Die HIC macht sich die hydrophobe Wechselwirkung großer Moleküle mit einer mäßig hydrophoben stationären Phase zunutze, z. B. butylgebundenes anstelle von octadecylgebundenem Siliciumdioxid. Anfänglich fördern höhere Salzkonzentrationen im Wasser die Bindung der Proteine an die Packung. Gradiententrennungen werden in der Regel mit abnehmender Salzkonzentration durchgeführt. Auf diese Weise werden die Biomoleküle in der Reihenfolge ihrer zunehmenden Hydrophobie eluiert.

Trennungen auf der Grundlage der Ladung: Ionenaustauschchromatographie

Bei Trennungen auf der Grundlage der Polarität wird Gleiches von Gleichem angezogen und Gegensätzliches kann abgestoßen werden. Bei der Ionenaustauschchromatographie und anderen Trennungen, die auf elektrischer Ladung basieren, ist die Regel umgekehrt. Gleiches kann sich abstoßen, während sich Gegensätzliches gegenseitig anzieht. Stationäre Phasen für Ionenaustausch-Trennungen sind durch die Art und Stärke der sauren oder basischen Funktionen auf ihren Oberflächen und die Arten von Ionen, die sie anziehen und zurückhalten, gekennzeichnet. Der Kationenaustausch wird verwendet, um positiv geladene Ionen an einer negativen Oberfläche zu halten und zu trennen. Umgekehrt dient der Anionenaustausch dazu, negativ geladene Ionen auf einer positiven Oberfläche zurückzuhalten und zu trennen. Bei jeder Art von Ionenaustausch gibt es mindestens zwei allgemeine Ansätze für die Trennung und Elution.

Abbildung T: Ionenaustausch-Chromatographie

Starke Ionenaustauscher tragen funktionelle Gruppen, die immer ionisiert sind. Sie werden in der Regel verwendet, um schwache Ionen zurückzuhalten und abzutrennen. Diese schwachen Ionen können durch Verdrängung mit einer mobilen Phase eluiert werden, die Ionen enthält, die stärker von den Stellen der stationären Phase angezogen werden. Alternativ können schwache Ionen auf der Säule zurückgehalten und dann in situ durch Änderung des pH-Werts der mobilen Phase neutralisiert werden, wodurch sie ihre Anziehungskraft verlieren und eluiert werden.

Schwache Ionenaustauscher können oberhalb oder unterhalb eines bestimmten pH-Werts neutralisiert werden und verlieren ihre Fähigkeit, Ionen durch Ladung zurückzuhalten. Wenn sie geladen sind, werden sie verwendet, um starke Ionen zurückzuhalten und zu trennen. Wenn diese Ionen nicht durch Verdrängung eluiert werden können, können die Austauschstellen der stationären Phase neutralisiert werden, wodurch die Ionenanziehung abgeschaltet und die Elution der geladenen Analyten ermöglicht wird.

Tabelle D: Richtlinien für den Ionenaustausch

Wenn schwache Ionenaustauscher neutralisiert werden, können sie Spezies durch hydrophobe oder hydrophile Wechselwirkungen zurückhalten und trennen; in diesen Fällen wird die Elutionsstärke durch die Polarität der mobilen Phase bestimmt. Daher können schwache Ionenaustauscher für Trennungen im gemischten Modus verwendet werden.

Tabelle D enthält Leitlinien für die wichtigsten Ionenaustauschkategorien. Um z. B. einen stark basischen Analyten zurückzuhalten, verwenden Sie ein Partikel der stationären Phase mit schwachem Kationenaustausch bei pH > 7; dadurch wird eine negativ geladene Partikeloberfläche gewährleistet. Um die starke Base freizusetzen oder zu eluieren, senken Sie den pH-Wert der mobilen Phase unter 3; dadurch wird die Oberflächenladung entfernt und der Ionenaustausch-Retentionsmechanismus ausgeschaltet.

Beachten Sie, dass ein pKa der pH-Wert ist, bei dem 50 % der funktionellen Gruppe ionisiert und 50 % neutral sind. Um eine im Wesentlichen neutrale oder eine vollständig geladene Analyt- oder Partikeloberfläche zu gewährleisten, muss der pH-Wert auf einen Wert eingestellt werden, der mindestens 2 Einheiten über dem pKa-Wert liegt.

Verwenden Sie keinen starken Kationenaustauscher, um eine starke Base zurückzuhalten; beide bleiben geladen und werden stark voneinander angezogen, so dass es nahezu unmöglich ist, die Base zu eluieren. Sie kann nur entfernt werden, indem der starke Kationenaustauscher mit einer konkurrierenden Base überschwemmt wird, die eine noch stärkere Retention aufweist und die Verbindung von Interesse verdrängt, indem sie den Wettbewerb um die aktiven Austauschstellen gewinnt. Dieser Ansatz ist in der HPLC und SPE selten praktikabel oder sicher.

Trennungen auf der Grundlage der Größe: Größenausschlusschromatographie –

In den 1950er Jahren entdeckten Porath und Flodin, dass Biomoleküle aufgrund ihrer Größe und nicht aufgrund ihrer Ladung oder Polarität getrennt werden können, indem sie durch ein hydrophiles Dextranpolymer mit kontrollierter Porosität geleitet oder gefiltert werden. Dieser Prozess wurde als Gelfiltration bezeichnet. Später wurde ein analoges Schema verwendet, um synthetische Oligomere und Polymere mit Hilfe von organisch-polymeren Packungen mit spezifischen Porengrößenbereichen zu trennen. Dieses Verfahren wurde als Gelpermeationschromatographie bezeichnet. Ähnliche Trennungen unter Verwendung von Silikapackungen mit kontrollierter Porosität wurden als Größenausschlusschromatographie bezeichnet. Die ersten kommerziellen HPLC-Geräte, die 1963 eingeführt wurden, waren für GPC-Anwendungen konzipiert.

Alle diese Techniken werden in der Regel mit stationären Phasen durchgeführt, die mit einer Porengrößenverteilung über einen Bereich synthetisiert wurden, der es den interessierenden Analyten ermöglicht, in mehr oder weniger Porenvolumen der Packung einzudringen bzw. daraus ausgeschlossen zu werden. Kleinere Moleküle durchdringen bei ihrer Passage durch das Bett einen größeren Teil der Poren. Größere Moleküle können nur in Poren oberhalb einer bestimmten Größe eindringen, so dass sie weniger Zeit im Bett verbringen. Die größten Moleküle können vollständig von den Poren ausgeschlossen werden und nur zwischen den Partikeln hindurchgehen, wobei sie sehr schnell in einem kleinen Volumen eluieren. Mobile Phasen werden aus zwei Gründen ausgewählt: Erstens sind sie gute Lösungsmittel für die Analyten, und zweitens können sie Wechselwirkungen zwischen den Analyten und der Oberfläche der stationären Phase verhindern. Auf diese Weise eluieren die größeren Moleküle zuerst, während die kleineren Moleküle langsamer wandern und später eluieren, in abnehmender Reihenfolge ihrer Größe in der Lösung. Daher die einfache Regel: Die Großen kommen zuerst heraus.

Da es möglich ist, das Molekulargewicht eines Polymers mit seiner Größe in Lösung zu korrelieren, hat die GPC die Messung der Molekulargewichtsverteilung von Polymeren revolutioniert, die wiederum die physikalischen Eigenschaften bestimmt, die die Verarbeitung, Qualität und Leistung von Polymeren verbessern oder beeinträchtigen können.

Schlussfolgerung