HPLC-separationsmetoder

Generelt kan tre primære egenskaber ved kemiske forbindelser bruges til at skabe HPLC-separationer. De er:

– Polaritet
– Elektrisk ladning
– Molekylær størrelse

Først skal vi se på polaritet og de to primære separationsformer, der udnytter denne egenskab: normalfasekromatografi og omvendt fase-kromatografi.

Separationer baseret på polaritet

Et molekyls struktur, aktivitet og fysisk-kemiske egenskaber bestemmes af arrangementet af dets bestanddele af atomer og bindingerne mellem dem. Inden for et molekyle kaldes en specifik anordning af visse atomer, som er ansvarlig for særlige egenskaber og forudsigelige kemiske reaktioner, for en funktionel gruppe. Denne struktur er ofte afgørende for, om molekylet er polært eller upolært. Organiske molekyler inddeles i klasser efter den/de vigtigste funktionelle gruppe(r), som de hver især indeholder. Ved hjælp af en separationsmetode baseret på polaritet bestemmes den relative kromatografiske retention af forskellige typer molekyler i vid udstrækning af arten og placeringen af disse funktionelle grupper. Som vist i figur P kan molekylklasser ordnes efter deres relative retention i et område eller spektrum af kromatografisk polaritet fra meget polær til meget upolær.

Figur P: Kromatografisk polaritetsspektrum efter analysandens funktionelle gruppe

Vand er en polær forbindelse. Benzen er en upolær forbindelse. Molekyler med samme kromatografiske polaritet har en tendens til at blive tiltrukket af hinanden; molekyler med forskellig polaritet udviser en meget svagere tiltrækning, hvis nogen, og kan endda frastøde hinanden. Dette bliver grundlaget for kromatografiske separationsmåder baseret på polaritet.

En anden måde at tænke på dette på er ved hjælp af den velkendte analogi: olie og vand blandes ikke. I modsætning til magnetisme, hvor modsatrettede poler tiltrækker hinanden, afhænger kromatografiske separationer baseret på polaritet af den stærkere tiltrækning mellem ensartede ting og den svagere tiltrækning mellem modsatrettede ting. Husk, at “ens tiltrækker ens” i polaritetsbaseret kromatografi.

Figur Q: Korrekt kombination af mobil og stationær fase påvirker adskillelse baseret på polaritet

For at designe et kromatografisk separationssystem , skaber vi konkurrence om de forskellige forbindelser, der er indeholdt i prøven, ved at vælge en mobil fase og en stationær fase med forskellige polariteter. Derefter vil forbindelser i prøven, der har samme polaritet som den stationære fase, blive forsinket, fordi de tiltrækkes stærkere af partiklerne. Forbindelser, hvis polaritet svarer til den mobile fases polaritet, vil fortrinsvis blive tiltrukket af den og bevæge sig hurtigere.

På denne måde skabes der på grundlag af forskelle i den relative tiltrækning af hver forbindelse til hver fase en adskillelse ved at ændre analytternes hastigheder.

Figurerne R-1, R-2 og R-3 viser typiske kromatografiske polaritetsintervaller for henholdsvis mobile faser, stationære faser og prøveanalytikere. Lad os se på hver enkelt for sig for at se, hvordan en kromatograf vælger de passende faser for at udvikle den tiltrækningskonkurrence, der er nødvendig for at opnå en polaritetsbaseret HPLC-separation.

Figur R-1: Spektrum af kromatografisk polaritet for mobilfasen

En skala, som den, der er vist i figur R-1, hvorpå nogle almindelige opløsningsmidler er placeret i rækkefølge efter relativ kromatografisk polaritet, kaldes en eluotropisk serie. Molekyler i mobilfasen, der konkurrerer effektivt med analysemolekyler om de attraktive steder i den stationære fase, fortrænger disse analyter og får dem til at bevæge sig hurtigere gennem kolonnen . Vand befinder sig i den polære ende af skalaen for mobilfasens opløsningsmiddel, mens hexan, et alifatisk kulbrinte, befinder sig i den upolære ende. Derimellem kan de enkelte opløsningsmidler og blandinger af blandbare opløsningsmidler placeres i rækkefølge efter elueringsstyrke. Hvilken ende af skalaen, der repræsenterer den “stærkeste” mobile fase, afhænger af karakteren af den stationære fases overflade, hvor konkurrencen om analysemolekylerne finder sted.

Figur R-2: Spektrum af polaritetsspektret for stationær fasepartikelkromatografi

Silica har en aktiv, hydrofil overflade, der indeholder syreholdige silanolfunktionelle grupper. Derfor falder det i den polære ende af skalaen for stationær fase, som er vist i figur R-2. Silicaoverfladens aktivitet eller polaritet kan ændres selektivt ved kemisk binding af mindre polære funktionelle grupper til den . De her viste eksempler omfatter, i rækkefølge af faldende polaritet, cyanopropylsilyl- , n-octylsilyl- og n-octadecylsilyl- grupper på silica. Sidstnævnte er en hydrofob , meget upolær pakning.

Figur R-3: Forbindelse/Analyte kromatografisk polaritetsspektrum

Figur R-3 gentager det kromatografiske polaritetsspektrum for vores prøve . Efter at have overvejet polariteten af begge faser skal kromatografen for en given stationær fase vælge en mobil fase, hvori de pågældende analyter tilbageholdes, men ikke så stærkt, at de ikke kan elueres. Blandt opløsningsmidler med samme styrke overvejer kromatografen, hvilken fasekombination der bedst kan udnytte de mere subtile forskelle i analysandets polaritet og opløselighed for at maksimere det kromatografiske systems selektivitet. Ligner tiltrækker hinanden, men som du sikkert kan forestille dig ud fra den hidtidige diskussion, kræver det kendskab til prøven og erfaring med forskellige typer analytter og retentionsmåder at skabe en separation baseret på polaritet. Sammenfattende kan man sige, at kromatografen vælger den bedste kombination af en mobil fase og en stationær partikelfase med modsatrettede polariteter. Når prøveanalyterne så bevæger sig gennem kolonnen, vil reglen “like attracts like” bestemme, hvilke analyter der bremses, og hvilke der fortsætter med højere hastighed.

Normal-Phase HPLC

I sine separationer af planteekstrakter havde Tswett succes med at bruge en polær stationær fase med en meget mindre polær mobil fase. Denne klassiske form for kromatografi blev kendt som normalfase.

Figur S-1: Normalfasekromatografi

Figur S-1 viser en kromatografisk separation i normalfase af vores testblanding med tre farvestoffer. Den stationære fase er polær og tilbageholder det polære gule farvestof stærkest. Det relativt upolære blå farvestof vinder i retentionskonkurrencen ved hjælp af den mobile fase, et upolært opløsningsmiddel, og elueres hurtigt. Da det blå farvestof er mest lig den mobile fase , bevæger det sig hurtigere. Det er typisk for normalfasekromatografi på silica, at den mobile fase er 100 % organisk; der anvendes ikke vand.

Reversed-Phase HPLC

Tegningen reversed-phase beskriver den kromatografimodus, der er det stik modsatte af normalfasen, nemlig brugen af en polær mobil fase og en upolær stationær fase. Figur S-2 illustrerer den sorte blanding af tre farvestoffer, der adskilles ved hjælp af en sådan protokol.

Figur S-2: Omvendt fase-kromatografi

Nu er den stærkest tilbageholdte forbindelse det mere upolære blå farvestof, da dets tiltrækningskraft til den upolære stationære fase er størst. Det polære gule farvestof, der er svagt tilbageholdt, vindes i konkurrence af den polære, vandige mobile fase, bevæger sig hurtigst gennem sengen og elueres tidligst, når lige tiltrækkes som lige.

I dag anvendes omvendt fase-kromatografi til ca. 75 % af alle HPLC-metoder, fordi den er mere reproducerbar og har en bred anvendelighed. De fleste af disse protokoller anvender som mobil fase en vandig blanding af vand med et blandbart, polært organisk opløsningsmiddel, f.eks. acetonitril eller methanol. Dette sikrer typisk en korrekt interaktion mellem analytter og den upolære, hydrofobiske partikeloverflade. C18-bundet silica er den mest populære type HPLC-pakning med omvendt fase.

Tabel C indeholder en oversigt over fasekarakteristika for de to vigtigste HPLC-separationsformer baseret på polaritet. Husk, at for disse polaritetsbaserede tilstande gælder det, at lige meget tiltrækker lige meget.

Tabel C: Faseegenskaber for separationer baseret på polaritet

Hydrofil interaktionskromatografi

HILIC kan betragtes som en variant af kromatografi i normal fase. Ved normalfasekromatografi er den mobile fase 100 % organisk. Der er kun spor af vand i den mobile fase og i porerne i de polære pakningspartikler. Polære analyter binder stærkt til den polære stationære fase og elueres muligvis ikke.

Tilsætning af lidt vand til den organiske mobile fase gør det muligt at adskille og eluere polære forbindelser, der holdes stærkt tilbage i normalfasemåden . Vand, der er et meget polært opløsningsmiddel, konkurrerer effektivt med polære analytter om den stationære fase. HILIC kan køres i enten isokratisk eller gradient elueringsmåde. Polære forbindelser, der i første omgang tiltrækkes af de polære pakningspartikler, kan elueres, efterhånden som polariteten af den mobile fase øges . Analyterne elueres i rækkefølge efter stigende hydrofilicitet . Der kan tilsættes buffere eller salte til den mobile fase for at holde ioniserbare analyter i en enkelt form.

Hydrofob interaktionskromatografi

HIC er en type omvendt fase-kromatografi, der anvendes til at adskille store biomolekyler, f.eks. proteiner. Det er normalt ønskeligt at bevare disse molekyler intakte i en vandig opløsning og undgå kontakt med organiske opløsningsmidler eller overflader, der kan denaturere dem. HIC udnytter den hydrofobiske vekselvirkning mellem store molekyler og en moderat hydrofob stationær fase, f.eks. butylbundet , snarere end octadecylbundet , silica. I første omgang vil højere saltkoncentrationer i vandet tilskynde proteinerne til at blive fastholdt på pakningen. Gradientseparationer udføres typisk ved faldende saltkoncentration. På denne måde elueres biomolekylerne i rækkefølge efter stigende hydrofobicitet.

Separationer baseret på ladning: Ionbytningskromatografi

For separationer baseret på polaritet tiltrækkes ensartede stoffer af ensartede, og modsatrettede stoffer kan blive frastødt. Ved ionbytningskromatografi og andre separationer, der er baseret på elektrisk ladning, er reglen omvendt. Lignende kan frastøde hinanden, mens modsætninger tiltrækkes af hinanden. Stationære faser til ionbyteseparationer er karakteriseret ved arten og styrken af de sure eller basiske funktioner på deres overflader og de typer ioner, som de tiltrækker og tilbageholder. Kationbytning anvendes til at tilbageholde og adskille positivt ladede ioner på en negativ overflade. Omvendt anvendes anionbytning til at tilbageholde og adskille negativt ladede ioner på en positiv overflade . Med hver type ionbytning er der mindst to generelle fremgangsmåder for separation og eluering.

Figur T: Ionbytningskromatografi

Stærke ionbyttere bærer funktionelle grupper, der altid er ioniserede. De anvendes typisk til at tilbageholde og adskille svage ioner. Disse svage ioner kan elueres ved fortrængning med en mobil fase, der indeholder ioner, som tiltrækkes stærkere til de stationære fasesteder. Alternativt kan svage ioner tilbageholdes på søjlen og derefter neutraliseres ved in situ at ændre pH-værdien af den mobile fase, hvorved de mister deres tiltrækning og elueres.

svage ionbyttere kan neutraliseres over eller under en bestemt pH-værdi og mister deres evne til at tilbageholde ioner ved ladning. Når de er ladede, anvendes de til at tilbageholde og adskille stærke ioner. Hvis disse ioner ikke kan elueres ved fortrængning, kan de stationære fasers udvekslingssteder neutraliseres, hvorved den ioniske tiltrækning lukkes, og de ladede analyter kan elueres.

Tabel D: Retningslinjer for ionbyttere

Når svage ionbyttere neutraliseres, kan de tilbageholde og adskille arter ved hydrofobiske eller hydrofiliske interaktioner; i disse tilfælde bestemmes elueringsstyrken af den mobile fases polaritet . Svage ionbyttere kan således anvendes til separationer med blandet tilstand .

Tabel D indeholder retningslinjer for de vigtigste kategorier af ionbyttere. For at tilbageholde en stærkt basisk analysand skal der f.eks. anvendes en svag kationbyttende stationær fasepartikel ved pH > 7; dette sikrer en negativt ladet partikeloverflade. For at frigøre eller eluere den stærkt basiske base skal man sænke pH-værdien af den mobile fase til under 3; dette fjerner overfladeladningen og slukker for ionbytterens tilbageholdelsesmekanisme.

Bemærk, at en pKa er den pH-værdi, ved hvilken 50% af den funktionelle gruppe er ioniseret og 50% er neutral. For at sikre en i det væsentlige neutral eller en fuldt ladet analyte eller partikeloverflade skal pH-værdien justeres til en værdi, der ligger mindst 2 enheder over pKa-værdien, alt efter hvad der er relevant.

Der må ikke anvendes en stærk kationbytter til at tilbageholde en stærk base; begge forbliver ladede og stærkt tiltrukket af hinanden, hvilket gør det næsten umuligt at eluere basen. Den kan kun fjernes ved at oversvømme den stærke kationbytter med en konkurrerende base, der udviser en endnu stærkere retention og fortrænger den pågældende forbindelse ved at vinde konkurrencen om de aktive byttepladser. Denne fremgangsmåde er sjældent praktisk eller sikker i HPLC og SPE.

Separationer baseret på størrelse: I 1950’erne opdagede Porath og Flodin, at biomolekyler kunne adskilles på grundlag af deres størrelse snarere end på grundlag af deres ladning eller polaritet ved at lade dem passere eller filtrere dem gennem en hydrofil polymer af dextran med kontrolleret porøsitet og hydrofilitet. Denne proces blev kaldt gelfiltrering. Senere blev en analog ordning anvendt til at adskille syntetiske oligomerer og polymerer ved hjælp af organiske polymerpakninger med specifikke porestørrelsesintervaller. Denne proces blev kaldt gel-permeationskromatografi . Lignende separationer udført ved hjælp af silica-pakker med kontrolleret porøsitet blev kaldt size-exclusionskromatografi . De første kommercielle HPLC-instrumenter, der blev introduceret i 1963, blev designet til GPC-applikationer.

Alle disse teknikker udføres typisk på stationære faser, der er blevet syntetiseret med en porestørrelsesfordeling over et område, der gør det muligt for de pågældende analyter at komme ind i eller blive udelukket fra mere eller mindre af poremængden i pakningen. Mindre molekyler trænger ind i flere af porerne ved deres passage gennem sengetøjet. Større molekyler kan kun trænge ind i porer over en vis størrelse, så de tilbringer mindre tid i senget. De største molekyler kan blive helt udelukket fra porerne og passerer kun mellem partiklerne og elueres meget hurtigt i et lille volumen. Mobile faser vælges af to grunde: for det første er de gode opløsningsmidler for analysanderne, og for det andet kan de forhindre interaktioner mellem analysanderne og den stationære fases overflade. På denne måde elueres de større molekyler først, mens de mindre molekyler bevæger sig langsommere og elueres senere, i faldende rækkefølge efter deres størrelse i opløsningen. Derfor den enkle regel: De store kommer først ud.

Da det er muligt at korrelere molekylvægten af en polymer med dens størrelse i opløsning, har GPC revolutioneret målingen af molekylvægtfordelingen af polymerer, som igen bestemmer de fysiske egenskaber, der kan forbedre eller forringe polymerens forarbejdning, kvalitet og ydeevne.

Slutning