Separační režimy HPLC

Obecně lze při vytváření HPLC separací využít tři základní charakteristiky chemických sloučenin. Jsou to:

– polarita
– elektrický náboj
– velikost molekuly

Nejprve se zabývejme polaritou a dvěma základními separačními režimy, které tuto vlastnost využívají: chromatografie na normální fázi a chromatografie na obrácené fázi.

Separace na základě polarity

Struktura, aktivita a fyzikálně-chemické vlastnosti molekuly jsou určeny uspořádáním atomů jejích složek a vazeb mezi nimi. V rámci molekuly se specifické uspořádání určitých atomů, které je zodpovědné za zvláštní vlastnosti a předvídatelné chemické reakce, nazývá funkční skupina. Tato struktura často určuje, zda je molekula polární, nebo nepolární. Organické molekuly jsou řazeny do tříd podle hlavní funkční skupiny (skupin), kterou (které) obsahují. Při použití separačního režimu založeného na polaritě je relativní chromatografická retence různých druhů molekul do značné míry určena povahou a umístěním těchto funkčních skupin. Jak je znázorněno na obrázku P, lze třídy molekul seřadit podle jejich relativní retence do rozsahu nebo spektra chromatografické polarity od vysoce polárních po vysoce nepolární.

Obrázek P: Chromatografické spektrum polarity podle funkční skupiny analytu

Voda je polární sloučenina. Benzen je nepolární sloučenina. Molekuly s podobnou chromatografickou polaritou mají tendenci se vzájemně přitahovat; molekuly s rozdílnou polaritou vykazují mnohem slabší přitažlivost, pokud vůbec nějakou, a mohou se dokonce odpuzovat. To se stává základem chromatografických separačních režimů založených na polaritě.

Jiným způsobem, jak si to představit, je známá analogie: olej a voda se nemíchají. Na rozdíl od magnetismu, kde se opačné póly přitahují, chromatografické separace založené na polaritě závisí na silnější přitažlivosti mezi podobnými a slabší přitažlivosti mezi protiklady. Pamatujte si, že v chromatografii založené na polaritě platí: „Podobné přitahuje podobné.“

Obrázek Q: Správná kombinace mobilní a stacionární fáze ovlivňuje separaci založenou na polaritě

K návrhu chromatografického separačního systému , vytvoříme konkurenci pro různé sloučeniny obsažené ve vzorku výběrem mobilní fáze a stacionární fáze s různou polaritou. Pak se sloučeniny ve vzorku, které mají podobnou polaritu jako stacionární fáze, budou zdržovat, protože jsou k částicím silněji přitahovány. Sloučeniny, jejichž polarita je podobná polaritě mobilní fáze, k ní budou přednostně přitahovány a budou se pohybovat rychleji.

Takto se na základě rozdílů v relativní přitažlivosti jednotlivých sloučenin pro každou fázi vytvoří separace změnou rychlostí analytů.

Obrázky R-1, R-2 a R-3 zobrazují typické chromatografické rozsahy polarit mobilních fází, stacionárních fází a analytů vzorku. Podívejme se na každou z nich postupně, abychom viděli, jak chromatograf vybírá vhodné fáze, aby se vyvinula přitažlivá konkurence potřebná k dosažení separace HPLC založené na polaritě.

Obrázek R-1: Chromatografické spektrum polarity mobilní fáze

Stupnice, jako je ta na obrázku R-1, na které jsou některá běžná rozpouštědla umístěna v pořadí podle relativní chromatografické polarity, se nazývá eluotropická řada. Molekuly mobilní fáze, které účinně soutěží s molekulami analytu o atraktivní místa stacionární fáze, vytlačují tyto analyty, což způsobuje jejich rychlejší pohyb kolonou . Voda je na polárním konci stupnice mobilní fáze a rozpouštědla, zatímco hexan, alifatický uhlovodík, je na nepolárním konci. Mezi ně lze zařadit jednotlivá rozpouštědla i směsi mísitelných rozpouštědel podle eluční síly. Který konec stupnice představuje „nejsilnější“ mobilní fázi, závisí na povaze povrchu stacionární fáze, kde dochází k soutěži o molekuly analytu.

Obrázek R-2: Chromatografické spektrum polarity částic stacionární fáze

Křemelina má aktivní, hydrofilní povrch obsahující kyselé silanolové funkční skupiny. V důsledku toho spadá na polární konec škály stacionární fáze znázorněné na obrázku R-2. Aktivitu nebo polaritu povrchu oxidu křemičitého lze selektivně modifikovat tím, že se na něj chemicky navážou méně polární funkční skupiny . Zde uvedené příklady zahrnují, v pořadí podle klesající polarity, kyanopropylsilyl- , n-oktylsilyl- a n-oktadecylsilyl- části na oxidu křemičitém. Poslední jmenovaný je hydrofobní , velmi nepolární obal.

Obrázek R-3: Chromatografické spektrum polarity sloučeniny/analytu

Obrázek R-3 opakuje chromatografické spektrum polarity našeho vzorku . Po zvážení polarity obou fází pak musí chromatograf pro danou stacionární fázi zvolit mobilní fázi, ve které jsou zájmové analyty zadržovány, ale ne tak silně, aby nemohly být eluovány. Mezi rozpouštědly podobné síly chromatograf zvažuje, která kombinace fází může nejlépe využít jemnějších rozdílů v polaritě a rozpustnosti analytů, aby maximalizoval selektivitu chromatografického systému. Podobné přitahuje podobné, ale jak si z dosavadní diskuse pravděpodobně dokážete představit, vytvoření separace na základě polarity vyžaduje znalost vzorku a zkušenosti s různými druhy analytů a retenčními režimy. Shrneme-li to, chromatograf vybere nejlepší kombinaci mobilní fáze a stacionární fáze částic s vhodně opačnými polaritami. Potom, jak se analyty vzorku pohybují kolonou, pravidlo podobné přitahuje podobné určí, které analyty se zpomalují a které postupují větší rychlostí.

Normální fáze HPLC

Při separaci rostlinných extraktů byl Tswett úspěšný při použití polární stacionární fáze s mnohem méně polární mobilní fází. Tento klasický způsob chromatografie se stal známým jako normální fáze.

Obrázek S-1: Normálněfázová chromatografie

Obrázek S-1 představuje normálněfázovou chromatografickou separaci naší testovací směsi tří barviv. Stacionární fáze je polární a nejsilněji zadržuje polární žluté barvivo. Relativně nepolární modré barvivo vítězí v retenční soutěži s mobilní fází, nepolárním rozpouštědlem, a rychle eluuje. Protože se modré barvivo nejvíce podobá mobilní fázi, pohybuje se rychleji. Pro chromatografii na normální fázi na oxidu křemičitém je typické, že mobilní fáze je 100% organická; nepoužívá se voda.

HPLC s obrácenou fází

Termín obrácená fáze popisuje způsob chromatografie, který je pravým opakem normální fáze, a to použití polární mobilní fáze a nepolární stacionární fáze. Obrázek S-2 znázorňuje separaci černé směsi tří barviv pomocí takového protokolu.

Obrázek S-2: Chromatografie s obrácenou fází

Nejsilněji zadrženou sloučeninou je nyní nepolárnější modré barvivo, protože jeho přitažlivost k nepolární stacionární fázi je největší. Polární žluté barvivo, které je slabě zadržováno, vítězí v konkurenci polární, vodné mobilní fáze, pohybuje se nejrychleji přes lože a eluuje nejdříve jako přitahuje podobné.

Dnes se chromatografie s obrácenou fází, protože je reprodukovatelnější a má širokou použitelnost, používá přibližně u 75 % všech metod HPLC. Většina těchto protokolů používá jako mobilní fázi vodnou směs vody s mísitelným polárním organickým rozpouštědlem, jako je acetonitril nebo methanol. To obvykle zajišťuje správnou interakci analytů s nepolárním, hydrofobním povrchem částic. Nejoblíbenějším typem balení HPLC s reverzní fází je oxid křemičitý s vazbou C18.

Tabulka C uvádí souhrn charakteristik fází pro dva hlavní způsoby separace HPLC na základě polarity. Pamatujte, že pro tyto režimy založené na polaritě platí, že podobné přitahuje podobné.

Tabulka C: Fázové charakteristiky pro separace založené na polaritě

Chromatografie s hydrofilní interakcí

HILIC lze považovat za variantu chromatografie s normální fází. Při chromatografii na normální fázi je mobilní fáze 100% organická. V mobilní fázi a v pórech polárních obalových částic jsou přítomny pouze stopy vody. Polární analyty se silně vážou na polární stacionární fázi a nemusí eluovat.

Přidání určitého množství vody do organické mobilní fáze umožňuje separovat a eluovat polární sloučeniny, které jsou silně zadržovány v režimu normální fáze . Voda, velmi polární rozpouštědlo, účinně soutěží s polárními analyty o stacionární fázi. HILIC lze provozovat v izokratickém nebo gradientovém elučním režimu. Polární sloučeniny, které jsou zpočátku přitahovány k částicím polárního obalového materiálu, mohou být eluovány při zvyšování polarity mobilní fáze . Analyty se eluují v pořadí podle rostoucí hydrofilnosti . Do mobilní fáze mohou být přidány pufry nebo soli, aby ionizovatelné analyty zůstaly v jedné formě.

Hydrofobní interakční chromatografie

HIC je typ chromatografie s obrácenou fází, který se používá k separaci velkých biomolekul, jako jsou proteiny. Obvykle je žádoucí udržet tyto molekuly neporušené ve vodném roztoku a vyhnout se kontaktu s organickými rozpouštědly nebo povrchy, které by je mohly denaturovat. HIC využívá hydrofobní interakce velkých molekul s mírně hydrofobní stacionární fází, např. s křemíkem vázaným butylem, nikoli oktadecylem. Zpočátku vyšší koncentrace solí ve vodě podpoří zadržování proteinů na obalu. Gradientní separace se obvykle provádí snižováním koncentrace soli. Tímto způsobem se biomolekuly eluují v pořadí podle rostoucí hydrofobicity.

Separace na základě náboje:

Při separacích založených na polaritě se podobné přitahuje k podobnému a protiklady se mohou odpuzovat. U iontově výměnné chromatografie a dalších separací založených na elektrickém náboji je pravidlo obrácené. Podobné se mohou odpuzovat, zatímco protiklady se vzájemně přitahují. Stacionární fáze pro iontově výměnné separace jsou charakterizovány povahou a silou kyselých nebo zásaditých funkcí na jejich povrchu a typy iontů, které přitahují a zadržují. Kationtová výměna se používá k zadržení a oddělení kladně nabitých iontů na záporném povrchu. A naopak, aniontová výměna se používá k zadržení a oddělení záporně nabitých iontů na kladném povrchu . U každého typu iontové výměny existují nejméně dva obecné přístupy k separaci a eluci.

Obrázek T: Chromatografie s iontovou výměnou

Silné iontoměniče nesou funkční skupiny, které jsou vždy ionizovány. Obvykle se používají k zadržení a oddělení slabých iontů. Tyto slabé ionty mohou být eluovány vytěsněním mobilní fází obsahující ionty, které jsou silněji přitahovány k místům stacionární fáze. Alternativně mohou být slabé ionty zadrženy na koloně a poté neutralizovány změnou pH mobilní fáze in situ, což způsobí, že ztratí svou přitažlivost a eluují se.

Slabé iontoměniče mohou být neutralizovány nad nebo pod určitou hodnotou pH a ztrácejí schopnost zadržovat ionty podle náboje. Když jsou nabité, používají se k zadržení a oddělení silných iontů. Pokud tyto ionty nemohou být eluovány vytěsněním, pak mohou být výměnná místa stacionární fáze neutralizována, čímž se vypne iontová přitažlivost a umožní se eluce nabitých analytů.

Tabulka D: Pokyny pro iontovou výměnu

Když jsou slabé iontoměniče neutralizovány, mohou zadržovat a oddělovat druhy hydrofobními nebo hydrofilními interakcemi; v těchto případech je eluční síla určena polaritou mobilní fáze . Slabé iontoměniče lze tedy použít pro separace ve smíšeném režimu .

Tabulka D uvádí pokyny pro hlavní kategorie iontové výměny. Například pro zadržení silně bazického analytu , použijte částice se slabou kationtovou výměnou stacionární fáze při pH > 7; to zajistí záporně nabitý povrch částic. Chcete-li uvolnit nebo eluovat silnou zásadu, snižte pH mobilní fáze pod 3; tím se odstraní povrchový náboj a vypne se mechanismus retence iontovou výměnou.

Všimněte si, že pKa je hodnota pH, při které je 50 % funkční skupiny ionizováno a 50 % neutrální. Aby byl zajištěn v podstatě neutrální nebo plně nabitý povrch analytu nebo částice, musí být pH upraveno na hodnotu nejméně o 2 jednotky vyšší, než je pKa, podle potřeby .

Nepoužívejte silně kationtový výměník k zadržení silné báze; obě zůstávají nabité a silně se vzájemně přitahují, což téměř znemožňuje eluci báze. Lze ji odstranit pouze zahlcením silného kationtového výměníku konkurenční bází, která vykazuje ještě silnější retenci a vytěsní zájmovou sloučeninu tím, že zvítězí v soutěži o aktivní výměnná místa. Tento přístup je v HPLC a SPE zřídkakdy praktický nebo bezpečný.

Separace na základě velikosti: V 50. letech 20. století Porath a Flodin objevili, že biomolekuly lze separovat spíše na základě jejich velikosti než na základě jejich náboje nebo polarity, a to průchodem nebo filtrací přes hydrofilní polymer dextran s řízenou pórovitostí. Tento proces byl označen jako gelová filtrace. Později bylo analogické schéma použito k separaci syntetických oligomerů a polymerů pomocí organických polymerních obalů se specifickým rozsahem velikosti pórů. Tento proces se nazýval gelová permeační chromatografie . Podobné separace prováděné pomocí obalů z oxidu křemičitého s řízenou pórovitostí se nazývaly velikostně vylučovací chromatografie . První komerční přístroje HPLC, zavedené v roce 1963, byly navrženy pro aplikace GPC .

Všechny tyto techniky se obvykle provádějí na stacionárních fázích, které byly syntetizovány s rozdělením velikosti pórů v rozsahu, který umožňuje, aby analyty, které jsou předmětem zájmu, vstupovaly do větší či menší části objemu pórů obalu nebo z něj byly vyloučeny. Menší molekuly při průchodu vrstvou pronikají do větší části pórů. Větší molekuly mohou pronikat pouze do pórů nad určitou velikost, takže v loži stráví méně času. Největší molekuly mohou být z pórů zcela vyloučeny a procházet pouze mezi částicemi a eluovat velmi rychle v malém objemu. Mobilní fáze se vybírají ze dvou důvodů: zaprvé jsou dobrými rozpouštědly pro analyty a zadruhé mohou zabránit jakýmkoli interakcím mezi analyty a povrchem stacionární fáze. Tímto způsobem dochází k eluci větších molekul jako prvních, zatímco menší molekuly se pohybují pomaleji a eluují se později, a to v sestupném pořadí podle jejich velikosti v roztoku. Odtud plyne jednoduché pravidlo: velké vystupují jako první.

Jelikož je možné korelovat molekulovou hmotnost polymeru s jeho velikostí v roztoku, GPC způsobila revoluci v měření distribuce molekulové hmotnosti polymerů, která následně určuje fyzikální vlastnosti, jež mohou zlepšit nebo zhoršit zpracování, kvalitu a výkon polymerů.

Závěr

.