- Abstrakt
- 1. Úvod
- 2. Materiál a metody
- 2.1. Materiál a metody 2.1. Zvířata
- 2.2. Zvířata byla rozdělena do tří skupin po 20 potkanech. Indukce akutního zánětu
- 2.3. Skupiny a ošetření
- 2.4. Přípravek byl připraven v souladu se zásadami pro přípravu homeopatik. Analýza dat
- 2.5. Způsoby léčby. Imunohistochemická analýza
- 2.6. V případě, že se jedná o mikroorganismus, který je v rozmezí od 1. do 4. sekundy vystaven působení DAB (DAKO), byl proveden další pokus. Histomorfometrie
- 2.7. Značení endoteliálních buněk. Statistická analýza
- 2.8. Analýza intenzity otoku v jednotlivých podskupinách. Bioetická kritéria
- 3. Výsledky
- 4. Diskuse
- Střet zájmů
- Poděkování
Abstrakt
Byly hodnoceny účinky Arnica montana 6cH na individuální modulaci kinetiky akutního zánětu u potkanů. Dospělým samcům potkanů kmene Wistar byl inokulován 1% karagenan do stélky a v době od 30 do 180 minut po inokulaci dráždivé látky jim byla podána Arnica montana 6cH, dexamethason (4,0 mg/kg; pozitivní kontrola) nebo 5% hydroalkoholový roztok (negativní kontrola), per os, vždy po 15 minutách. Histopatologické a imunohistochemické postupy byly provedeny za účelem získání panelu zánětlivých pozitivních buněk pro CD3 (T lymfocyty), CD45RA (B lymfocyty), CD18 (beta 2 integrin), CD163 (ED2 protein), CD54 (ICAM-1) a MAC 387 (monocyty a makrofágy). Statistické zpracování údajů zahrnovalo a posteriori klasifikaci zvířat z každé skupiny () do dvou podskupin představujících spontánní předčasný nebo pozdní edém. Zvířata, která vykazovala předčasný edém, byla méně odpovědná vůči Arnica montana 6cH ve vztahu k hemodynamickým změnám. Naopak potkani, kteří vykazovali pozdní edém, vykazovali méně intenzivní edém (), nižší procento degranulace žírných buněk () a zvýšení průměru lymfatických cév (). Tyto údaje naznačují individuální kvalitativní úpravu zánětlivých cévních dějů působením Arnica montana 6cH.
1. Úvod
Jednou z nejdiskutovanějších kontroverzí ohledně účinnosti homeopatických léků je nutnost stanovení dokonalé symptomatické analogie mezi pacientem a patogenitou léku, tedy nutnost individuální preskripce podle principu similia. Právě tato vlastnost je jednou z nejobtížnějších výzev vědeckého výzkumu v této oblasti, a to z důvodu technické náročnosti jejího experimentálního prokázání. V literatuře se totiž nachází jen málo experimentálních studií o . Experimentální prokázání této zvláštnosti a pochopení jejích mechanismů tak může být užitečným nástrojem k řešení chronických sporů o účinnost homeopatie, které se často objevují v klinických studiích . Nedávno byla provedena elegantní studie in vitro, která prokázala význam regulačních a adaptačních buněčných mechanismů ve velikosti homeopatických léků vyvolávajících cytotoxické účinky na nádorové buňky .
Od roku 1997 do roku 2008 jsme postupně vypracovali výzkumnou studii o biologických účincích homeopatické Arniky montany, speciálně Arniky montany 6cH, s využitím zvířecích modelů . Stručně řečeno, výsledky získané v těchto studiích ukazují, že Arnica montana 6cH je schopna modulovat akutní zánětlivý proces u potkanů, protože může zvýšit absorpci lymfatického edému a lokální průtok krve a také podpořit řadu migrace polymorfonukleárních buněk. Všechny tyto experimenty jsou chronologicky popsány v .
Arnica montana je rostlina patřící do čeledi Compositae, která roste na kopcích východní a střední Evropy. V jejích listech, květech a kořenech bylo identifikováno několik účinných látek, jako jsou alkoholy, třísloviny, flavonoidy a sesquirterpenické laktony, zejména helenalin . Hlavním účinkem helenalinu je inhibice transkripčního faktoru NFκβ, podobně jako u kortikoidních steroidů . Náhodné požití rostliny může způsobit vazodilataci, krevní stázu, krvácení, edém a bolest. Tyto účinky jsou hlavními tématy popsanými v Arnica montana materia medica . Z tohoto důvodu jsou bolest při úrazu a vstřebávání otoků hlavními indikacemi pro klinické a experimentální použití homeopatických přípravků z Arnica montana . V poslední době byly navrženy i další způsoby použití vysoce naředěné Arniky montany, například agronomické použití Arniky v potencích 3, 6 a 12cH ke zlepšení růstu rostlin .
Cílem této studie bylo ověřit dvě hypotézy: (a) předpokládanou modulaci cévních a buněčných dějů při akutním zánětu arnikou se zaměřením na míru výskytu neutrofilů, monocytů, T a B lymfocytů v místě zánětu a intenzitu exprese adhezních molekul v zanícené pojivové tkáni pomocí imunohistochemických a histomorfometrických technik; (b) předpokládaný zásah do výstupů přirozených individuálních variací kinetiky zánětu.
2. Materiál a metody
2.1. Materiál a metody
2.1. Zvířata
Byli použiti dospělí samci potkanů kmene Wistar o hmotnosti 250 až 300 gramů. Potkani byli chováni v běžných laboratorních polypropylenových klecích (5 až 7 zvířat na klec) s řízenou teplotou (25 ± 3 °C) a světelným cyklem (světlo svítí od 6:00 do 18:00 hodin). Voda a potrava byly nabízeny ad libitum. Před zahájením pokusu byla zvířata náhodně zvážena, rozdělena a označena ve třech skupinách po 20 potkanech.
2.2. Zvířata byla rozdělena do tří skupin po 20 potkanech. Indukce akutního zánětu
Akutní zánětlivý proces byl vyvolán subkutánní inokulací 1% kappa karagenanu (SIGMA) zředěného ve sterilním fyziologickém roztoku do tlapky, jejíž tloušťka byla předem změřena mikrometrem (MYTUTOYO).
Po 30 a 180 minutách byla provedena nová měření, aby bylo možné vyhodnotit vývoj otoku před a po léčbě v závislosti na čase. Prvních 30 minut se tedy měřila spontánní tvorba otoku a zbývajících 150 minut se měřil účinek léku, protože léčba byla provedena po 30minutovém měření. Po 180 minutách byla zvířata eutanazována krční trakcí v hluboké anestezii a polštářky nohou byly odebrány a fixovány v pufrovaném 10% formaldehydu po dobu maximálně 24 hodin před zpracováním běžnými histologickými technikami, včetně zalití do parafínu, barvení hematoxylinem-eosinem a toluidinovou modří. Stejné parafínové bločky byly použity k provedení imunohistochemických postupů. Pro každou podložku pod nohu bylo provedeno jedno jediné sklíčko.
2.3. Skupiny a ošetření
Každá skupina potkanů byla ošetřena určitou látkou podle tabulky 1. V tabulce 1 je uvedeno, jakým způsobem byly potkany ošetřeny. Potkani ošetření Arnica montana 6cH (experimentální) a neošetření 5% hydroalkoholovým roztokem (negativní kontrola) získaným od stejného dodavatele byli označeni kódy tak, že všechna ošetření a měření byla provedena naslepo. Tyto kódy byly vytvořeny laborantem, který se studie neúčastnil, a uchovávány na zapečetěném listu až do statistické analýzy, kdy byly odhaleny.
|
|||||||||||||||||||||
Potkani léčení dexametazonem (pozitivní kontrola) byli provedeni otevřeně, a to z důvodu fyzikálních vlastností použitého přípravku; ten byl zcela odlišný od homeopatických, a tudíž snadno rozpoznatelný. Léčbu a mikroskopickou analýzu vzorků prováděly dvě nezávislé osoby, vždy zaslepeně. Celková dávka dexametazonu použitá k vyvolání protizánětlivých účinků byla 4 mg/kg, podle dříve definovaných norem . Tento frakcionovaný protokol byl navržen tak, aby reprodukoval obvyklý homeopatický klinický stav léčby akutního zánětu a byl použit i v předchozích studiích provedených naší skupinou . Dexametazon byl zvolen jako pozitivní kontrolní skupina, protože jeho mechanismus účinku napodobuje mechanismus helenalinu, hlavní účinné látky Arniky horské .
Komerční Arnica montana 6cH byla připravena v 5% hydroalkoholovém roztoku v lékárně certifikované regulační brazilskou Národní agenturou pro sanitární vigilanci (ANVISA), Farmácia Sensitiva, São Paulo. Techniky použité při přípravě byly v souladu s Brazilským homeopatickým lékopisem, 2. vydání, 1997.
2.4. Přípravek byl připraven v souladu se zásadami pro přípravu homeopatik. Analýza dat
Po prvním vynesení intenzity otoků získaných během období před léčbou (od nuly do 30 minut) byla data pomocí softwaru Excel 2003 roztříděna do půlměsíců tak, aby bylo možné pro každou skupinu rozdělit 10 potkanů (50 %), u kterých byla spontánně zjištěna nižší intenzita otoků, a 10 potkanů (50 %), u kterých byla zjištěna vyšší intenzita otoků. Pro každou experimentální skupinu tak byly vytvořeny dvě podskupiny po 10 zvířatech, které charakterizují dvě různé subpopulace potkanů podle zánětlivého kinetického vzorce (tabulka 2). Celý experimentální plán je vysvětlen ve vývojovém diagramu (obrázek 7).
|
||||||||||||||||||||||||||||
Protože klasická křivka edému vyvolaného karagenanem trvá až 6 hodin po inokulaci, výběr obou časů (30 a 180 minut) byl založen na jeho známém plateau . Navíc předchozí studie o účincích Arniky 6cH na karagenanem indukovaný edém neukazují po této době žádné další účinky . Kinetika hodnocení zánětlivého procesu po injekci karagenanu je klasickým experimentálním modelem vyvinutým v 70. letech 20. století . Je tedy důvěryhodným kritériem, které lze v tomto případě použít.
Po vynesení dat do grafu (obr. 1(a) a 1(b)) se oba kinetické modely staly snadno identifikovatelnými: (a) zvířata, která vykazovala méně intenzivní edém během prvních 30 minut před léčbou, měla vrchol mezi 30. a 180. minutou (tzv. pozdní edém) a (b) zvířata, která vykazovala intenzivnější edém v prvních 30 minutách, se po tomto období snížil (tzv. časný edém).
(a)
(b)
(c)
(d)
(a)
(b)
(c)
(d)
Odém (mm) v různých skupinách a podskupinách. (a) Vývoj otoku v závislosti na čase v podskupině s časným otokem; (b) vývoj otoku v závislosti na čase v podskupině s pozdním otokem; (c) intenzita otoku na konci experimentu v podskupině s časným otokem; (d) intenzita otoku na konci experimentu v podskupině s pozdním otokem. ; ANOVA, Tuckey-Krammer, ve vztahu ke kontrole. Hodnoty představují průměr ± směrodatnou odchylku.
Všechny výsledky byly porovnávány mezi šesti podskupinami. Tento výběr a posteriori byl proveden s cílem ověřit roli individuální idiosynkrazie v účinku arniky podle principu similia, protože rychlost ústupu otoků je jedním z nejznámějších symptomů Arnica montana popsaných v materia medica .
2.5. Způsoby léčby. Imunohistochemická analýza
Všechna sklíčka byla během pěti minut omyta roztokem alkoholu a éteru v poměru 1 : 1, poté osušena měkkým papírem a ošetřena poly-L-lysinem v poměru 1 : 10 (SIGMA). Poté byly na jejich povrch pomocí histologické lázně o teplotě 40 °C přeneseny 5 mikrometrové plátky tkáně zalité v parafínu. Poté byly plátky deparafinovány prostřednictvím dvou koupelí v absolutním xylolu po dobu 2 minut a dvou koupelí v absolutním alkoholu po dobu 3 minut. Sklíčka byla následně omyta v tekoucí vodovodní vodě.
Pro imunohistochemické postupy byl proveden první krok pro získání antigenu pomocí tepelné úpravy vzorků. Sklíčka byla vložena dovnitř citrátové pufrové lázně (SIGMA), pH = 6,0, obsahující 0,5 % tween 20 (DAKO), a zahřívána v elektrickém hrnci při 80 °C (PANASONIC) po dobu 20 minut. Poté byla sklíčka promyta v PBS, pH = 7,2 (SIGMA), po dobu 6 minut a osušena měkkým savým papírem a vzorek tkáně byl ohraničen pomocí vhodného pera (Pap-pen, AbCam).
Aktivita endogenní peroxidázy byla blokována inkubací tkání v 3% roztoku H2O2 zředěném v methanolu (ISOFAR), po dobu 15 minut při pokojové teplotě. Poté byly promyty v PBS (SIGMA) po dobu 6 minut a ošetřeny 2,5% koňským normálním sérem (VECTOR) po dobu 20 minut při 25 °C pro zablokování nespecifických vazebných míst na proteiny. Ihned po tomto kroku byly tkáně ošetřeny primární protilátkou (viz ředění a specifikace v tabulce 3) a ponechány přes noc při 4 °C ve vlhké komoře. Všechna ředění primárních protilátek byla provedena v 1% hovězím sérovém albuminu (BSA).
|
||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Na druhý den byly řezy promyty v PBS (sigma) po dobu 6 minut a ošetřeny polymer-peroxidázou konjugovanou sekundární protilátkou (IMPRESS UNIVERSAL, VECTOR), při 25 °C po dobu 30 minut. Po novém promytí v PBS (6 minut) byly vystaveny působení DAB (DAKO) po dobu 3 sekund, znovu promyty ve vodovodní vodě, obarveny Harrisovým hematoxylinem (01 minuta) a namontovány.
2.6. V případě, že se jedná o mikroorganismus, který je v rozmezí od 1. do 4. sekundy vystaven působení DAB (DAKO), byl proveden další pokus. Histomorfometrie
Pro vyhodnocení procenta degranulace žírných buněk bylo spočítáno dvě stě buněk na sklíčku obarvených metodou toluidinové modři, přičemž byla použita přilehlá políčka s rozlišením degranulovaných buněk od nedegranulovaných. Pro vyhodnocení průměru lymfatických cév bylo vyhodnoceno pět náhodně vybraných polí pomocí 200násobného objektivu. Byly pořízeny mikrofotografie každého pole (CANNON) a pomocí systému digitální analýzy obrazu (Image Tool 3.0) bylo stanoveno procento plochy lymfatických cév v každém poli. Průměr lymfatických cév lze podle předchozích pozorování považovat za vhodný parametr pro hodnocení absorpce lymfatického edému . Vzhledem k tomu, že se protokol týkal akutních příhod, nebyla hypotéza lymfangiogeneze zvažována.
Pro markery anti-CD45RA, CD3, CD18, CD163 a MAC 387 bylo pozorováno deset náhodně vybraných mikroskopických polí na jedno sklíčko pomocí imerzního objektivu (velikost 1000 x). Zahrnovala téměř všechny podkožní cévní pojivové tkáně podložky a byl zaznamenán počet pozitivních buněk na jedno pole. V případě Anti-MAC 387 byly uvažovány pouze mononukleární pozitivní buňky. Na sklíčkách obarvených hematoxylinem-eozinem byl spočítán počet PMN buněk na jedno pole. V tomto případě bylo rozpoznání buněk provedeno pouze podle morfologických kritérií. Exprese CD163 je úměrná zralosti makrofágů, z tohoto důvodu byly tyto výsledky vyjádřeny jako poměr mezi CD163/MAC 387 mononukleárních pozitivních buněk na jedno pole.
Pro Anti-CD54 byla intenzita pozitivity na povrchu endoteliálních buněk hodnocena skórovacím systémem, který se pohyboval od 1 do 4. V případě Anti-CD54 byla intenzita pozitivity na povrchu endoteliálních buněk hodnocena pomocí skóre. Pět náhodně vybraných polí bylo hodnoceno po sklíčkách pomocí imerzního objektivu (velikost 1000 x) a bodování prováděli dva nezávislí pozorovatelé zaslepeným způsobem, aby se zabránilo subjektivní interpretaci při analýze. Konečné skóre pro každé sklíčko se rovnalo součtu dílčích skóre. Kritéria bodového hodnocení jsou uvedena v tabulce 4.
|
||||||||||||||||||||||||
2.7. Značení endoteliálních buněk. Statistická analýza
K určení Gaussova rozdělení většiny datových bodů byl nejprve použit Bartlettův test. Poté byla podle výsledků Bartlettova testu provedena ANOVA/Tuckey-Krammer nebo Kruskall-Wallis/Dunn. Hodnocení degranulace žírných buněk bylo naopak vyhodnoceno pomocí testu. Hodnoty byly považovány za signifikantní. Veškerá statistická analýza byla provedena pomocí softwaru INSTAT 3.
V souvislosti s otokem byla provedena také dodatečná vnitroskupinová statistická analýza a porovnání intenzity otoku mezi podskupinami ve 30. minutě (spontánní otok) ukázalo významné rozdíly (Tuckey-Krammer, ), což potvrdilo navržený experimentální design.
2.8. Analýza intenzity otoku v jednotlivých podskupinách. Bioetická kritéria
Protokol byl schválen bioetickou komisí Universidade Paulista (protokol 011/07) v souladu se zákonem státu São Paulo č. 11.977/05 (zákoník na ochranu zvířat státu São Paulo, Brazílie). Tento postup je v souladu s Evropskou úmluvou o ochraně obratlovců používaných pro pokusné a jiné vědecké účely a její přílohou.
3. Výsledky
Histopatologický aspekt zanícených chodidel odhalil klasický rámec typického časného akutního zánětu: edém a buněčný infiltrát odpovídající 2/3 PMN buněk a 1/3 mononukleárních buněk. S ohledem na vnitroskupinové statistické zpracování však bylo možné identifikovat existenci různých vzorců vývoje zánětlivého procesu v závislosti na čase (tabulky 5 a 6). Bylo tedy nutné tyto vzorce před analýzou účinků Arnica montana 6cH systematizovat a klasifikovat.
|
|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| aprůměr ± směrodatná odchylka; milimetry. bprůměr ± směrodatná odchylka; pixely na pole. střední hodnota a interval; skóre přiřazené dvěma nezávislými pozorovateli. průměr ± směrodatná odchylka; buňky na pole. |
|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
|
||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| aprůměr ± směrodatná odchylka; milimetry. bprůměr ± směrodatná odchylka; pixely na pole. medián a interval; skóre přiřazené dvěma nezávislými pozorovateli. průměr ± směrodatná odchylka; buňky na pole. |
||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Podle toho bylo možné pozorovat významný antiedematózní účinek Arnica montana 6cH (ANOVA, ) pouze u podskupiny potkanů, u kterých se vrchol edému projevil mezi 30. a 180. minutou po injekci karagenanu do footpadu (tzv. pozdní podskupina) (obrázek 1). Také histomorfometrická analýza preparátů obarvených toluidinovou modří ukázala, že pozdní podskupina vykazovala také méně intenzivní degranulaci žírných buněk (, ) a větší průměrný průměr lymfatických cév (Kruskal-Wallis, ). Naopak v časné podskupině (vrchol otoku před 30. minutou) bylo pozorováno pouze diskrétní, ale významné zvýšení degranulace žírných buněk (, ) a také zvýšení skóre exprese CD54 endoteliálními buňkami (Kruskal-Wallis, ) (tabulky 5 a 6, obrázky 2 a 5).
(a)
(b)
(a)
(b)
.
Histogram znázorňující procento degranulovaných žírných buněk a lymfatickou plochu (pixely) na pole. (a) Podskupina, u které se vyvinul dřívější edém; (b) podskupina, u které se vyvinul pozdější edém. , ve vztahu ke kontrole. **Kruskal-Wallis, ve vztahu ke skupině s dexametazonem.
Nebyl pozorován žádný rozdíl mezi skupinami a podskupinami, pokud jde o migraci buněk, s ohledem na PMN buňky a všechny markery použité v imunohistochemické analýze, včetně poměru CD 163+/MAC 387+ buněk (tabulky 5 a 6, obrázky 3, 4 a 5).
(a)
(b)
(a)
(b)
Histogram znázorňující počet MAC387 pozitivních buněk na pole, poměr CD163/MAC387 a počet polymorfonukleárních buněk na pole. (a) Podskupina, u které se vyvinul dřívější edém; (b) podskupina, u které se vyvinul pozdější edém. ANOVA, bez významnosti.
(a)
(b)
(a)
(b)
Histogram znázorňující počet CD3 a CD45R pozitivních buněk na jedno pole. (a) Podskupina, u které se vyvinul dřívější edém; (b) podskupina, u které se vyvinul pozdější edém. ANOVA, bez významnosti.
(a)
(b)
(a)
(b)
Histogram znázorňující počet CD18 (beta 2 integrin) pozitivních buněk na pole a medián (interval) skóre značení CD54 (ICAM). (a) Podskupina, u které se vyvinul dřívější edém; (b) podskupina, u které se vyvinul pozdější edém. ANOVA, bez významnosti; *Kruskal-Wallis/Dunn, ve vztahu ke kontrole.
Při souhrnu všech údajů je možné hlavní závěr ilustrovat rozptylovým grafem intenzity edému, ve kterém jsou patrné různé trendy mezi skupinami a podskupinami, po léčbě Arnica montana 6cH (obr. 6). Všimněte si, že zvířata léčená Arnikou a vykazující pozdní edém (pozdní podskupina) jsou oproti ostatním skupinám posunuta k výchozímu stavu.
(a)
(b)
(a)
(b)
Kresba rozptylu ukazující rozdílné trendy časového vývoje edému mezi oběma podskupinami. Bílé body představují kontrolu, černé body Arnica montana 6cH a šedé body dexametazon. V každém grafu je na ose – zobrazen edém 30 minut před injekcí karagenanu a na ose – edém na konci experimentu. LATE = podskupina s pozdním edémem; EARLY = podskupina s časným edémem. Všimněte si, že zvířata, která vykazovala pozdní vrchol edému a byla léčena Arnica montana 6cH, jsou oproti ostatním skupinám posunuta k základní linii.
Vývojový diagram kroků experimentu, určující dvě podskupiny potkanů podle kinetiky edému.
4. Diskuse
Mezi homeopatickými léky, které mají zvláštní zájem na potlačení zánětu , je Arnica montana jedním z nejvíce studovaných. Nicméně v recentní vědecké literatuře o homeopatii existuje mnoho studií, které se snaží prokázat účinnost jejího účinku, ale jen málo prací se věnuje pochopení fyziopatologických změn ve tkáních po expozici zvířat těmto léčivům . Právě z tohoto hlediska byla postavena tato práce; podrobným studiem zanícené pojivové tkáně s ohledem na podskupiny buněk, které do ní migrují, chování cév a časovou dynamiku tohoto procesu pod vlivem Arnica montana 6cH. Zajímavé je, že některé pozorované účinky jsou v souladu s dříve zjištěnými výsledky, jako např. překlenutí lymfatických cév a následné snížení otoku .
První výsledky zde získané poukazují na zajímavou skutečnost: individuální analýza jednotlivých podskupin ukazuje na význam časového faktoru v účinku Arniky montany 6cH; zvířata, u kterých se spontánně objevil pozdní vrchol otoku (po 30 minutách od injekce dráždivé látky), byla citlivější na Arniku než zvířata, u kterých se objevil časný vrchol otoku (před 30 minutami). V tomto případě byl edém dokonce méně intenzivní než u kontrolní skupiny a skupiny léčené dexametazonem a tato skutečnost byla doprovázena výrazným snížením degranulace žírných buněk a zvýšením průměru lymfatických cév. Oba jevy by mohly přispívat ke snížení makroskopického otoku a liší se od dexametazonového modelu, kdy se plocha lymfatických cév snižuje pasivně spolu se snížením otoku, jak ukazuje obrázek 2. Tento účinek potvrzuje výsledky pozorované dříve u .
Karagenan je polysacharid získávaný z mořské řasy Chondrus crispus, který má schopnost vyvolat lokální zánět, bez systémových účinků . Klasicky je známo, že prostaglandiny jsou generovány během tvorby otoku po subkutánní injekci karagenanu migrujícími neutrofily . Pozorování antiedémového účinku Arnica montana 6cH výhradně u zvířat, která vykazovala pozdní průběh akutního zánětu, ukazuje na účast různých chemických mediátorů v řídících drahách, jak bylo již dříve prokázáno u . V tomto smyslu histamin a prostaglandin, mediátory, jejichž vrchol účinku nastává k 15-30 minutám, pravděpodobně modulují tento proces v podskupině s pozdním edémem namísto mediátorů s velmi předčasným účinkem, jako je bradykinin, jehož vrchol nastává asi 10 minut po uvolnění .
Experimentální modely určené speciálně k prokázání významu individuální variability v účinku homeopatického léku byly popsány již dříve , ale nikdy v protokolu o zánětu. Individuálnost znamená v homeopatickém léku specifičnost; v Rocha 2008 , pouze přirozeně hyperaktivní potkani byli zodpovědní k léčbě Rhus toxicodendron 200cH, pokud jde o jejich chování v zařízení s otevřeným polem. Na druhé straně Soares 2007 pozoroval, že na Bryonia alba 200cH reagovali pouze hypoaktivní potkani. Tyto doplňující studie ukazují výsledky kompatibilní s příslušnou materia medica. Systematické srovnání obou studií a dalších je vidět v .
Co se týče buněčné migrace PMN a podtypů mononukleárních leukocytů, nebyl pozorován žádný rozdíl mezi skupinami a podskupinami, ani poměr CD163+/MAC387+ neodhalil žádnou změnu v dynamice zrání makrofágů v místě zánětu. CD 163 je transmembránový glykoprotein typu I o velikosti 175 kD, známý také jako protein ED2. Jeho přítomnost byla popsána na povrchu zralých makrofágů, ale v menší intenzitě také u nezralých monocytů a dalších mononukleárních buněk u lidí. Exprese ED 2 souvisí s metabolismem železa a zvyšuje se v pozdějších fázích zánětu, protože pozitivní buňky mají modulující úlohu a uvolňují autokrinní IL10 . Přítomnost T a B lymfocytů v místě zánětu by mohla souviset s určitým modulátorovým účinkem , který byl naznačen v předchozích studiích o Arnica montana 6cH , ale zde nebyl potvrzen.
Exprese adhezních molekul CD 54 (ICAM-1) byla vyšší u zvířat léčených Arnica montana 6cH, která vykazovala časný průběh zánětu, a souvisela s větším procentem degranulovaných žírných buněk v zanícené tkáni, ale ne s větší migrací leukocytů. Ačkoli v této fázi studie nebylo možné provést žádné mechanistické vysvětlení, zdá se, že celkové výsledky jsou rozděleny na dva hlavní vzorce: na regulaci cévní dynamiky, která je patrná v podskupině pozdního edému, a na regulaci buněčných dějů, která je patrná v podskupině časného edému, což naznačuje individuálně závislou kvalitativní úpravu cévních a buněčných zánětlivých dějů působením Arnica montana 6cH, jak je vidět na obrázku 6. Tyto různé vzorce variability, oscilující podle předchozího stavu testovaného biologického systému, byly experimentálně popsány v jiných experimentálních souvislostech s různými homeopatickými přípravky .
Na závěr lze zdůraznit dvě navržené hypotézy: (a) při léčbě Arnica montana 6cH nedochází k selektivní modulaci migrace podskupin leukocytů, ale pouze k regulaci cév, pokud jde o absorpci lymfy, expresi CD54 a degranulaci histaminu, a (b) po léčbě Arnica montana 6cH dochází k jasnému narušení jednotlivých kinetických změn v cévních dějích.
Střet zájmů
S touto prací není spojen žádný střet zájmů.
Poděkování
Autoři děkují programu CAPES-PROSUP a FAPESP Proc. č. 2007/59661-5 za finanční podporu; Marcii Gutierrez ze společnosti Farmacia Sensitiva za dodání léčiv; Fernandě Ferrari, Paulo Ailton Valdovato a Lice Osugui za technickou podporu.