Síntesis de ADN a partir de sustratos difosfato por las ADN polimerasas

Resultados y discusión

Comenzamos probando Taq (de Thermus aquaticus), Vent de alta fidelidad (exo-, de Thermococcus litoralis), Pfu (exo+, de Pyrococcus furiosus), Deep Vent (exo+, de Pyrococcus sp. GB-D) y Q5 (exo+) en reacciones en cadena de la polimerasa (PCR) tradicionales con un desoxirribonucleósido monofosfato (dGMP), dNDPs y dNTPs como sustratos (Fig. 1 A y B). La sustitución de cualquiera de los dNTPs por dNDPs apoyó la síntesis robusta de ADN, y otros experimentos con dos, tres o los cuatro dNDPs en lugar de los dNTPs apoyaron la PCR. Para asegurarnos de que los productos no provenían de dNTPs contaminantes y de que las reacciones no se veían reforzadas por los estabilizadores presentes en los tampones comerciales o en los stocks de enzimas, probamos la síntesis de ADN a partir de dNDPs purificados utilizando tampones y enzimas caseros. También incluimos enzimas replicativas bacterianas, como las polimerasas de ADN replicativas bacterianas del Bacillus stearothermophilus (Bst) termófilo y del Bacillus subtilis mesófilo (Bsu, fragmento grande). Éstas, junto con las polimerasas arqueas de Thermococcus kodakensis (KOD), Thermococcus sp. 9°N (9°N) y Thermococcus gorganarius (Tgo), mostraron robustas extensiones de cebadores utilizando sólo 100 µM de dNDPs purificados a 60 °C (excepto Bsu, que se probó a 37 °C en todos los casos) (Fig. 1C). Las reacciones de extensión de cebadores fueron eficientes para todas estas enzimas, particularmente para Deep Vent, KOD y 9°N. Se observó una pausa antes de la incorporación de dA y dC en el oligonucleótido naciente (Fig. 1 C y D), lo que sugiere que los KM para el dADP y el dCDP son lo suficientemente altos como para ralentizar la extensión del cebador a una concentración de sustrato de 100-µM.

Para obtener una visión mecanicista de la reacción, primero estudiamos su eficiencia utilizando la enzima Taq. La variación de la temperatura de extensión de 50 °C a 72 °C no dio lugar a ninguna diferencia observable en la cantidad de producto de longitud completa. Para simplificar los análisis cinéticos, todas las reacciones de PCR se realizaron utilizando un protocolo de ciclos de temperatura de dos pasos, en el que el cebador fue recocido y extendido en el primer paso a 72 °C y el dúplex se fundió a 95 °C en el segundo paso (Fig. S1A). Para comparar las tasas de utilización de los dNDPs con las de los dNTPs canónicos, se varió el tiempo de extensión de 15 a 120 s. Para un tiempo de extensión de 15 s, la reacción con dNTPs produjo aproximadamente cuatro veces el producto en comparación con la reacción de 2 minutos de tiempo de extensión que contenía los dNDPs (Fig. S1B). Estos datos sugieren que la velocidad de incorporación de los difosfatos es más lenta que la de los trifosfatos tradicionales, como cabría esperar si se tiene en cuenta la menor energía del estado básico de los dNDPs. A continuación nos preguntamos si la velocidad de incorporación es más lenta en el caso de los dNDPs o en el de los cuatro. Se utilizó la PCR cuantitativa (qPCR) para medir con precisión la formación de productos. Cada difosfato se interrogó de forma independiente combinándolo con 0,2 mM de los otros tres dNTPs para amplificar una plantilla de ADN larga. Estas reacciones se normalizaron con respecto a una reacción de control, que contenía 0,2 mM de los cuatro dNTPs (Fig. S1C). Un valor de 1 indica que un difosfato se incorpora tan eficientemente como su análogo trifosfato. Estos resultados sugieren que el dADP es el que se incorpora con menos eficiencia (1 mM de dADP produjo ∼60% de 0,2 mM de dATP), seguido del difosfato de desoximidina (dTDP) y del difosfato de desoxicitidina (dCDP). Por otro lado, sólo es necesario duplicar la concentración de dGDP para alcanzar la misma eficiencia de PCR que la reacción de control con dGTP.

Para analizar directamente la polimerización del ADN, realizamos una reacción de extensión de un cebador marcado con 32P y una plantilla larga (706 nt). La concentración de difosfato se varió de 0,1 a 1,0 mM y se combinó con 0,2 mM de los otros tres dNTPs, de forma similar a las reacciones de qPCR descritas anteriormente. Como se esperaba, el aumento de las concentraciones de dADP disminuyó la cantidad de tiempo necesaria para producir un producto de longitud completa (Fig. 1E). La pausa a lo largo de la longitud del ADN molde se observó únicamente en el caso del dADP, lo que sugiere que la polimerasa se detiene durante la incorporación de sustratos de dADP (Fig. 1E). Por otro lado, la falta de pausa en la reacción con dTDP sugería que el dTDP se utilizaba de forma más eficiente que el dADP (Fig. S2A), como sugería el análisis de qPCR (Fig. S1A). El análisis de la formación de productos sugirió que la concentración de dADP requerida para alcanzar la media tasa máxima es ∼420 µM (Fig. S2B), más de un orden de magnitud por encima del KM para los dNTPs medidos previamente (16 y 24 µM) (5, 6). Cerca de la concentración saturante de dADP, el ADN completo se sintetiza en unos 30 s y, dado que la secuencia de 706 nt contiene 182 adenosinas, la velocidad media de utilización del dADP es al menos ∼6 s-1. Esto es aproximadamente un orden de magnitud más lento que la velocidad media de utilización de dNTPs por la Taq polimerasa (kcat = 47 s-1) y está dentro de 1,5 veces del kcat de Pfu (7).

Para comparar aún más la cinética de la síntesis de ADN en plantillas largas a partir de dNDPs y dNTPs, utilizamos una plantilla de plásmido de ADN monocatenario (ssDNA) M13mp18 de 7.249 nt (8). Las polimerasas Bsu (a 37 °C), Bst y Taq (a 60 °C) mostraron una robusta síntesis de ADN a partir de dNDPs (Fig. S2C). Medimos la tasa de síntesis de ADN utilizando la fluorescencia del intercalador SYTO9, observada por un termociclador en tiempo real a diferentes concentraciones de dNDP y dNTP (Fig. S2D) (9). Un gráfico de estas tasas frente a la concentración de nucleótidos reveló un KM aparente de ∼0,4 mM para los dNDPs y una tasa máxima de síntesis que es unas 17 veces menor para los dNDPs que para los dNTPs (Fig. S2E). Estos resultados muestran, en una comparación directa bajo condiciones idénticas, que la tasa de síntesis de ADN a partir de los dNDPs es un poco más de un orden de magnitud menor que a partir de los dNTPs y que la Vmax/KM es, por tanto, unas 400 veces menor para los dNDPs que para los dNTPs.

Una reacción de polimerización con sustratos canónicos de trifosfato aumenta la longitud de la cadena naciente de ADN en un nucleótido, liberando un PPi (3). Durante la reacción inversa, la pirofosforólisis, el cebador se acorta en un nucleótido y se libera un dNTP. De forma análoga, cuando se utilizan dNDPs como sustratos, las polimerasas liberan fosfatos y la reacción inversa es la fosforólisis del ADN (Fig. 2A). Para confirmar que las polimerasas utilizan los dNDPs directamente y no utilizan una actividad enzimática hasta ahora desconocida (o nucleótido difosfato quinasa copurificado) que convierte dos dNDPs en un dNTP y un dNMP, utilizamos dNDPs purificados y analizamos los productos de una reacción de extensión de cebadores. Medimos la producción de fosfato utilizando un sensor fluorescente, derivado de la proteína bacteriana de unión a fosfato y que presenta una alta especificidad para el fosfato (10). Encontramos que, en presencia de dNDPs purificados y de la ADN polimerasa Taq, el fosfato se acumula (Fig. 2B), pero en los experimentos que carecen de la polimerasa, no lo hace. En los experimentos de control con dNTPs, se observó la producción de fosfato, pero su tasa fue más lenta e independiente de la enzima, lo que sugiere que el fosfato detectado era el resultado de la degradación de los dNTPs a dNDP y fosfato y no estaba relacionado con la síntesis de ADN. Estos resultados confirmaron que la Taq utiliza directamente los dNDPs como sustratos, liberando fosfato como subproducto de la síntesis de ADN. Cuando medimos la cantidad de fosfato producida en las extensiones de los cebadores en el ssDNA M13 de 7.249 nt descrito anteriormente, encontramos que se producía ∼1-11 µM de fosfato utilizando una plantilla de 1,6 nM por encima de la producción de fosfato de fondo procedente de la degradación de los dNDP (Fig. S3A). Esta concentración de fosfato corresponde a ∼2-6.000 moléculas por ADN, o alrededor de 0,1-0,9 de la plantilla copiada usando dNDPs. El amplio rango es el resultado de un fondo de fosfato relativamente grande en el material de partida y la reacción de fondo restada de la señal en la reacción de extensión del cebador.

Para verificar que las reacciones no producen dNTPs a partir de dNDPs, incubamos la Taq polimerasa con 250 µM de dCDP y dTDP y resolvimos las reacciones mediante cromatografía de intercambio iónico (Fig. S3B). Este análisis no reveló ninguna especie molecular nueva correspondiente a nucleótidos mono o trifosforilados en la reacción que contenía la enzima, en comparación con la reacción sin enzima, lo que indica una falta de actividad fosforil transferasa en la preparación de la enzima y apoya aún más la utilización directa de los dNDPs en la síntesis de ADN.

Como se ha descrito anteriormente, las reacciones con los sustratos dNDP liberan un fosfato inorgánico (Pi), y la reacción inversa es, por tanto, la fosforólisis del ADN (Fig. 2A). Para comprobar la eficacia de esta reacción inversa, investigamos la fosforólisis de un cebador marcado con 5′ 32P y recocido en una cadena molde incubándolo con la enzima y 10 mM de Pi. La Fig. 2C muestra la eliminación del nucleótido 3′ terminal de la hebra del cebador por parte de la Taq ADN polimerasa en presencia de Pi y PPi, lo que demuestra que la Taq ADN polimerasa puede someterse a la reacción inversa de polimerización del ADN a partir tanto de dNTPs como de dNDPs. Los análisis de las polimerasas termófilas Bst, Deep Vent, KOD (Fig. S4A), 9°N, Tgo y la mesófila Bsu también mostraron fosforólisis del ADN (Fig. S4B), aunque en menor medida. También se examinó una reacción de control con el fragmento Klenow de la ADN polimerasa I de Escherichia coli, que no acepta dNDPs como sustratos (Fig. S4C) y mostró que la presencia de PPi, pero no de Pi, provoca el acortamiento del cebador.

Para analizar más a fondo la reacción inversa, preparamos dsADN marcado internamente con 32P-fosfato realizando una reacción de extensión del cebador utilizando α-32P-dATP, seguida de una purificación por PAGE. Analizamos los productos de la reacción inversa mediante TLC de intercambio aniónico (polietilenimina). Como se esperaba, la incubación del ADN marcado internamente con la Taq polimerasa y el pirofosfato dio lugar a productos que comulgaban con el dATP. Las reacciones en presencia de fosfato produjeron especies de migración más rápida, correspondientes a dADP, y las reacciones sin fosfato o pirofosfato no produjeron ninguna especie de migración, indicando que en presencia de la Taq polimerasa sola el ADN permanecía intacto (Fig. 2D) y confirmando que la reacción inversa es la fosforólisis del ADN.

Por último, el análisis de la cinética dependiente del sustrato de la reacción inversa reveló un KM de ∼10 ± 5 mM (n = 9) y 57 ± 5 µM (n = 5) para el fosfato y el pirofosfato, respectivamente, aunque la baja solubilidad del fosfato de magnesio por encima de 10 mM nos impidió obtener medidas precisas (Fig. 2E). Las estructuras de cristal de las ADN polimerasas con pirofosfato o ácido fosfonofórmico en los sitios activos muestran una interacción culombiana con la proteína (11⇓-13). La relación de 200 veces entre los KM de los dos sustratos corresponde a ∼15 kJ/mol (3,6 kcal/mol) a 72 °C, una energía de unión aproximadamente igual a una interacción iónica entre el fosfato adicional y un catión compensador en la proteína y que apoya un modelo en el que el fosfato/pirofosfato se reconoce principalmente a través de una interacción carga-carga. Las estimaciones de las velocidades máximas de la reacción inversa siguieron una tendencia similar: en estas condiciones, la Vmax fue de 0,0010 ± 0,0005 s-1 y 0,205 ± 0,005 s-1 para el fosfato y el pirofosfato, respectivamente, revelando de nuevo una relación de aproximadamente 200 veces entre las dos actividades. En conjunto, por debajo de las concentraciones de saturación de los dos sustratos, la reacción del fosfato es unas 4 × 104 veces menos eficiente, lo que sugiere que la fosforólisis del ADN no supone una amenaza significativa para la estabilidad del genoma.

Para obtener más información sobre la síntesis de ADN a partir de los sustratos de baja energía (dNDPs y Pi), medimos las energías de activación utilizando el análisis de Arrhenius de las reacciones directa e inversa. Dado que las mediciones de una sola molécula de los cambios conformacionales asociados con el reconocimiento y la incorporación de los dNTPs correctos revelaron un movimiento más rápido de la proteína que la cinética de reacción observada (14), el paso que limita la velocidad de la reacción de avance en la Taq polimerasa está probablemente relacionado con el paso químico o con un reordenamiento pre-catalítico del sitio activo que depende de la interacción con los fosfatos del sustrato. Hemos observado que la Vmax de las reacciones directa e inversa es menor para el dNDP y el fosfato que para el dNTP y el pirofosfato, lo que sugiere que el paso que limita la velocidad es sensible al estado de fosforilación de los sustratos. Sin embargo, tanto el reordenamiento precatalítico (como la alineación de los residuos del sitio activo y la unión de un ion Mg2+ catalítico) como el paso químico pueden verse afectados por la fosforilación del sustrato; por tanto, cualquiera de los dos pasos puede ser limitante de la tasa en presencia de dNDPs, suponiendo que no introduzcan un nuevo paso conformacional lento en el mecanismo. En la Pol β, se ha propuesto previamente que estos dos pasos tienen constantes de velocidad similares (15), y las energías de activación calculadas para las reacciones directa e inversa que utilizan los sustratos de alta energía (dNTPs y pirofosfato) difieren en tan solo 15 kJ/mol (4). En el caso de las enzimas termófilas Taq y Klentaq1, la energía de activación de la reacción directa varía ampliamente, oscilando entre 90 y 125 kJ/mol, dependiendo de las condiciones experimentales y probablemente de la identidad de los nucleótidos que reaccionan (8, 16), mientras que la energía de activación de la pirofosforólisis no ha sido, hasta donde sabemos, determinada experimentalmente.

Analizamos las tasas de incorporación de un solo nucleótido de 50 µM de dCDP, dADP, y dTDP, apilando sobre dA, dC, y dA, respectivamente, durante la reacción de extensión del cebador. El análisis de Arrhenius mostró una dependencia lineal de ln(kobs) con respecto a 1/T para experimentos por debajo de 60 °C, revelando energías de activación de 85 ± 14, 108 ± 11 y 112 ± 15 kJ/mol para los tres nucleótidos (Fig. 3 A y B; n = 6 para cada nucleótido). El análisis de Arrhenius de la reacción inversa con 0,4 mM de fosfato, dando lugar a una molécula de dADP, reveló una gran energía de activación de 138 ± 10 kJ/mol (n = 5), en consonancia con la lenta tasa observada de fosforólisis del ADN por Taq (Fig. 3 A y B), y que representa un aumento significativo sobre la energía de activación calculada de la pirofosforólisis (92 kJ/mol en Pol β) (4). La energía de activación de las reacciones hacia delante y hacia atrás para el dADP difiere, por tanto, en ∼30 kJ/mol, proporcionando un fuerte sesgo para la síntesis de ADN. Este sesgo para la reacción hacia adelante resulta en un menor requerimiento de secuestro del producto fosfato por una vía metabólica aguas abajo, en contraste con la síntesis de ADN basada en dNTP y la hidrólisis de pirofosfato por pirofosfatasas inorgánicas. Además, si los cambios conformacionales precatalíticos en la Taq polimerasa no se ven afectados por los sustratos de baja energía y el paso químico es limitante de la velocidad, la utilización de dNDPs y fosfatos puede aportar nuevos conocimientos experimentales sobre la catálisis enzimática de la síntesis de ADN.