Rezultate și discuții
Am început prin a testa Taq (de la Thermus aquaticus), Vent de înaltă fidelitate (exo-, de la Thermococcus litoralis), Pfu (exo+, de la Pyrococcus furiosus), Deep Vent (exo+, de la Pyrococcus sp. GB-D) și Q5 (exo+) în reacții tradiționale de polimerizare în lanț (PCR) cu un deoxiribonucleozid monofosfat (dGMP), dNDP și dNTP ca substraturi (Fig. 1 A și B). Înlocuirea oricăruia dintre dNTP-uri cu dNDP-uri a susținut o sinteză robustă a ADN-ului, iar alte experimente cu două, trei sau toate cele patru dNDP-uri în locul dNTP-urilor au susținut PCR. Pentru a ne asigura că produsele nu au rezultat din dNTP-uri contaminante și că reacțiile nu au fost potențate de stabilizatorii prezenți în tampoanele comerciale sau în stocurile de enzime, am testat sinteza ADN din dNDP-uri purificate folosind tampoane și enzime de casă. Am inclus, de asemenea, enzime replicative bacteriene, cum ar fi ADN-polimerazele replicative bacteriene din Bacillus stearothermophilus (Bst) termofilic și Bacillus subtilis mezofilic (Bsu, fragment mare). Acestea, împreună cu polimerazele arheologice de la Thermococcus kodakensis (KOD), Thermococcus sp. 9°N (9°N) și Thermococcus gorganarius (Tgo), au prezentat extinderi robuste ale amorselor folosind doar 100 µM de dNDP purificate la 60 °C (cu excepția Bsu, care a fost testată la 37 °C în toate cazurile) (Fig. 1C). Reacțiile de extensie a amorselor au fost eficiente pentru toate aceste enzime, în special pentru Deep Vent, KOD și 9°N. A fost observată o pauză înainte de încorporarea dA și dC în oligonucleotidul nazal (Fig. 1 C și D), sugerând că KM pentru dADP și dCDP sunt suficient de mari pentru a încetini extensia amorselor la o concentrație de substrat de 100 μM.
Pentru a obține o perspectivă mecanică asupra reacției, am studiat mai întâi eficiența acesteia folosind enzima Taq. Variația temperaturii de extensie de la 50 °C la 72 °C nu a dus la nicio diferență observabilă în ceea ce privește cantitatea de produs de lungime completă. Pentru a simplifica analizele cinetice, toate reacțiile PCR au fost efectuate utilizând un protocol de ciclare a temperaturii în două etape, în care amorsa a fost aneantizată și extinsă în prima etapă la 72 °C, iar duplexul a fost topit la 95 °C în a doua etapă (Fig. S1A). Pentru a compara ratele de utilizare a dNDP cu cele ale dNTP-urilor canonice, timpul de prelungire a fost variat de la 15 la 120 s. Pentru un timp de prelungire de 15 s, reacția dNTP a produs aproximativ de patru ori mai mult produs în comparație cu reacția cu timp de prelungire de 2 min care conținea dNDP-uri (Fig. S1B). Aceste date au sugerat că rata de încorporare pentru difosfați este mai lentă decât cea a trifosfaților tradiționali, așa cum ar fi de așteptat având în vedere energia mai mică a dNDP-urilor la starea de bază. Am întrebat în continuare dacă un singur dNDP sau toate cele patru dNDP sunt responsabile pentru rata de încorporare mai lentă. S-a utilizat PCR cantitativă (qPCR) pentru o măsurare precisă a formării produsului. Fiecare difosfat a fost interogat independent prin combinarea acestuia cu 0,2 mM din celelalte trei dNTP-uri pentru a amplifica un șablon de ADN lung. Aceste reacții au fost normalizate la o reacție de control, care conținea 0,2 mM din toate cele patru dNTP-uri (Fig. S1C). O valoare de 1 indică faptul că un difosfat este încorporat la fel de eficient ca și analogul său trifosfat. Aceste rezultate sugerează că dADP este încorporat cel mai puțin eficient (1 mM dADP a produs ∼60% din 0,2 mM dATP), urmat de dezoximidină difosfat (dTDP) și dezoxicitină difosfat (dCDP). Pe de altă parte, este necesară doar o creștere de două ori a concentrației de dGDP pentru a atinge aceeași eficiență PCR ca și în cazul reacției de control cu dGTP.
Pentru a analiza direct polimerizarea ADN-ului, am realizat o reacție de extensie a unui primer marcat cu 32P și a unui șablon lung (706 nt). Concentrația de difosfat a fost variată de la 0,1 la 1,0 mM și combinată cu 0,2 mM din celelalte trei dNTP-uri, similar reacțiilor qPCR descrise mai sus. După cum era de așteptat, creșterea concentrațiilor de dADP a scăzut timpul necesar pentru a produce un produs de lungime completă (Fig. 1E). O pauză pe lungimea ADN-ului șablon a fost observată numai în cazul dADP, sugerând că polimeraza stagnează în timpul încorporării substraturilor dADP (Fig. 1E). Pe de altă parte, lipsa de pauză în reacția dTDP a sugerat că dTDP a fost utilizat mai eficient decât dADP (Fig. S2A), așa cum sugerează analiza qPCR (Fig. S1A). Analiza formării produsului a sugerat că concentrația de dADP necesară pentru a atinge o rată semimaximă este de ∼420 µM (Fig. S2B), cu mai mult de un ordin de mărime peste KM pentru dNTP-urile măsurate anterior (16 și 24 µM) (5, 6). În apropierea concentrației saturate de dADP, ADN-ul complet este sintetizat în aproximativ 30 s și, având în vedere că secvența de 706 nți conține 182 de adenozine, viteza medie de utilizare a dADP este de cel puțin ∼6 s-1. Acest lucru este cu aproximativ un ordin de mărime mai lent decât viteza medie de utilizare a dNTP-urilor de către polimeraza Taq (kcat = 47 s-1) și este de 1,5 ori mai mică decât kcat-ul lui Pfu (7).
Pentru a compara în continuare cinetica sintezei ADN-ului pe șabloane lungi din dNDP-uri și dNTP-uri, am folosit un șablon de ADN monocatenar (ssDNA) M13mp18 din plasmidă M13mp18 de 7.249 nt (8). Polimerazele Bsu (la 37 °C), Bst și Taq (la 60 °C) au prezentat o sinteză robustă de ADN din dNDP (Fig. S2C). Am măsurat rata de sinteză a ADN-ului utilizând fluorescența intercalatorului SYTO9, observată cu ajutorul unui termociclator în timp real la diferite concentrații de dNDP și dNTP (Fig. S2D) (9). O reprezentare grafică a acestor rate în funcție de concentrația de nucleotide a evidențiat o KM aparentă de ∼0,4 mM pentru dNDP-uri și o rată maximă de sinteză care este de aproximativ 17 ori mai mică pentru dNDP-uri decât pentru dNTP-uri (Fig. S2E). Aceste rezultate arată, într-o comparație directă în condiții identice, că rata de sinteză a ADN-ului din dNDPs este cu puțin peste un ordin de mărime mai mică decât cea din dNTPs și că Vmax/KM este astfel de aproximativ 400 de ori mai mică pentru dNDPs decât pentru dNTPs.
O reacție de polimerizare cu substraturi trifosfați canonici crește lungimea șirului de ADN nazal cu un nucleotid, eliberând un PPi (3). În timpul reacției inverse, pirofosforoliza, amorsa este scurtată cu o nucleotidă și se eliberează un dNTP. În mod analog, atunci când dNDP-urile sunt utilizate ca substraturi, polimerazele eliberează fosfați, iar reacția inversă este fosforoliza ADN-ului (Fig. 2A). Pentru a confirma faptul că polimerazele utilizează direct dNDP-uri și nu folosesc o activitate enzimatică necunoscută până în prezent (sau o nucleotidă difosfat kinază copurificată) care transformă două dNDP-uri într-un dNTP și un dNMP, am folosit dNDP-uri purificate și am analizat produsele unei reacții de extensie a amorselor. Am măsurat producția de fosfat utilizând un senzor fluorescent, care este derivat din proteina bacteriană de legare a fosfaților și prezintă o specificitate ridicată pentru fosfat (10). Am constatat că, în prezența dNDP-urilor purificate și a polimerazei ADN Taq, fosfatul se acumulează (Fig. 2B), dar în experimentele în care lipsește polimeraza, nu se produce. În experimentele de control cu dNTP-uri, s-a observat producerea de fosfat, dar rata sa a fost mai lentă și independentă de enzimă, ceea ce sugerează că fosfatul detectat a rezultat din degradarea dNTP-urilor în dNDP și fosfat și nu a fost legat de sinteza ADN-ului. Aceste rezultate au confirmat că Taq utilizează direct dNDP ca substraturi, eliberând fosfat ca produs secundar al sintezei ADN. Atunci când am măsurat cantitatea de fosfat produsă în prelungirile amorselor pe ADNSS M13 de 7 249 nt descris mai sus, am constatat că s-a produs ∼1-11 µM de fosfat folosind un șablon de 1,6 nm peste producția de fosfat de fond din degradarea dNDP (Fig. S3A). Această concentrație de fosfat corespunde la ∼2-6.000 de molecule per ADN, sau la aproximativ 0,1-0,9 din șablonul copiat cu ajutorul dNDP-urilor. Intervalul larg rezultă dintr-un fond de fosfat relativ mare în materialul de plecare și din reacția de fond sustrasă din semnalul din reacția de extensie a amorselor.
Fosforoliza ADN-ului de către ADN polimeraza Taq. (A) Schema reacțiilor directă și inversă cu dNTPs/dNDPs și, respectiv, pirofosfat/fosfat ca substraturi. (B) Senzorul fluorescent specific fosfatului a evidențiat fosfatul într-o reacție de extensie a amorselor catalizată de Taq cu dNDPs purificate (linie continuă). Nu s-a observat nicio fluorescență atunci când enzima a fost omisă (linie punctată). (C) Reacțiile inverse dependente de fosfat anorganic (Pi) și de pirofosfat (PPi) pe parcursul a 20 de minute arată digestia amorselor marcate cu 5′. (D) Analiza TLC cu schimb de anioni a produselor eliberate în timpul reacției inverse. Incubarea Taq polimerazei Taq în prezența fosfatului (Pi) și a unui primer marcat cu 32P produce 32P-dADP, iar adăugarea de 5 mM de pirofosfat la reacție produce, de asemenea, 32P-dATP, ceea ce constituie o dovadă suplimentară a faptului că Taq ADN polimeraza poate utiliza atât substraturi di- cât și trifosfat pentru polimerizare. (E) Degradarea ADN cu fosfat (○) și pirofosfat (●), care arată diferențe mari în KM (∼10 și 0,054 ± 0,005 mM) și Vmax (0,0010 ± 0,0005 și, respectiv, 0,205 ± 0,005 s-1). Datele privind pirofosfatul au fost ajustate direct (Inset la scară liniară), în timp ce parametrii pentru fosfat au fost extrași dintr-un grafic dublu-reciproc al datelor.
Pentru a verifica faptul că reacțiile nu produc dNTPs din dNDPs, am incubat polimeraza Taq cu 250 µM de dCDP și dTDP și am rezolvat reacțiile prin cromatografie de schimb de ioni (Fig. S3B). Această analiză nu a evidențiat nicio specie moleculară nouă care să corespundă nucleotidelor mono- sau trifosforilate în reacția care conține enzima, în comparație cu reacția fără enzimă, indicând lipsa activității fosforil-transferazei în preparatul enzimatic și susținând și mai mult utilizarea directă a dNDP-urilor în sinteza ADN.
După cum s-a descris mai sus, reacțiile cu substraturi dNDP eliberează un fosfat anorganic (Pi), iar reacția inversă este astfel fosforoliza ADN-ului (Fig. 2A). Pentru a testa eficiența acestei reacții inverse, am investigat fosforoliza unui primer marcat cu 5′ 32P și aneantizat pe un șir șablon șablon, prin incubarea acestuia cu enzima și 10 mM Pi. Fig. 2C arată îndepărtarea nucleotidei terminale 3′ din șirul de amorsă de către Taq ADN polimeraza în prezența Pi și PPi, demonstrând că Taq ADN polimeraza poate suferi reacția inversă de polimerizare a ADN-ului atât de la dNTPs, cât și de la dNDPs. Analiza polimerazelor termofile Bst, Deep Vent, KOD (Fig. S4A), 9°N, Tgo și a polimerazelor mezofile Bsu a evidențiat, de asemenea, fosforoliza ADN-ului (Fig. S4B), deși într-o măsură mai mică. A fost examinată, de asemenea, o reacție de control cu fragmentul Klenow al ADN polimerazei I de Escherichia coli, care nu acceptă dNDP ca substrat (Fig. S4C) și a arătat că prezența PPi, dar nu și a Pi, duce la scurtarea amorsării.
Pentru a analiza mai amănunțit reacția inversă, am preparat ADNdb marcat intern cu 32P-fosfat prin efectuarea unei reacții de extensie a amorsării cu α-32P-dATP, urmată de purificarea PAGE. Am analizat produsele reacției inverse utilizând TLC cu schimb de anioni (polietilenimină). Așa cum era de așteptat, incubarea ADN-ului marcat intern cu polimeraza Taq și pirofosfat a generat produse care au comigrat cu dATP. Reacțiile în prezența fosfatului au produs specii care au migrat mai rapid, corespunzând dADP, iar reacțiile fără fosfat sau pirofosfat nu au produs nicio specie care să migreze, ceea ce indică faptul că, în prezența Taq polimerazei singure, ADN-ul a rămas intact (Fig. 2D) și confirmă faptul că reacția inversă este o fosforoliză a ADN-ului.
În cele din urmă, analiza cineticii dependente de substrat a reacției inverse a relevat o KM de ∼10 ± 5 mM (n = 9) și 57 ± 5 µM (n = 5) pentru fosfat și, respectiv, pirofosfat, deși solubilitatea scăzută a fosfatului de magneziu peste 10 mM ne-a împiedicat să obținem măsurători precise (Fig. 2E). Structurile cristaline ale ADN polimerazelor cu pirofosfat sau acid fosfonoformic în situsurile active arată o interacțiune coulombiană cu proteina (11⇓-13). Raportul de 200 de ori între KM-urile celor două substraturi corespunde la ∼15 kJ/mol (3,6 kcal/mol) la 72 °C, o energie de legătură aproximativ egală cu o interacțiune ionică între fosfatul suplimentar și un cation compensator de pe proteină și care susține un model în care fosfatul/pirofosfatul este recunoscut în principal printr-o interacțiune sarcină-încărcare. Estimările vitezelor maxime ale reacției inverse au urmat o tendință similară: în aceste condiții, Vmax a fost de 0,0010 ± 0,0005 s-1 și 0,205 ± 0,005 s-1 pentru fosfat și, respectiv, pirofosfat, dezvăluind din nou un raport de aproximativ 200 de ori mai mare între cele două activități. Luate împreună, sub concentrațiile saturate ale celor două substraturi, reacția de fosfat este de aproximativ 4 × 104 ori mai puțin eficientă, sugerând că fosforoliza ADN-ului nu reprezintă o amenințare semnificativă pentru stabilitatea genomului.
Pentru a obține mai multe informații despre sinteza ADN-ului din substraturile cu energie scăzută (dNDP și Pi), am măsurat energiile de activare folosind analiza Arrhenius a reacțiilor înainte și înapoi. Deoarece măsurătorile cu o singură moleculă ale modificărilor conformaționale asociate cu recunoașterea și încorporarea dNTP-urilor corecte au evidențiat o mișcare mai rapidă a proteinei decât cinetica de reacție observată (14), etapa de limitare a vitezei reacției înainte în Taq polimeraza este probabil legată de etapa de chimie sau de o rearanjare pre-catalitică a situsului activ care depinde de interacțiunea cu fosfații substratului. Am observat că Vmax atât pentru reacția directă, cât și pentru cea inversă este mai mică pentru dNDP și fosfat decât pentru dNTP și pirofosfat, ceea ce sugerează că etapa de limitare a vitezei este sensibilă la starea de fosforilare a substraturilor. Cu toate acestea, atât rearanjarea precatalitică (cum ar fi alinierea reziduurilor situsului activ și legarea unui ion Mg2+ catalitic), cât și etapa chimică pot fi afectate de fosforilarea substratului; prin urmare, oricare dintre aceste etape poate fi limitatoare de viteză în prezența dNDP-urilor, presupunând că acestea nu introduc o nouă etapă conformațională lentă în mecanism. În Pol β, s-a propus anterior ca aceste două etape să aibă constante de viteză similare (15), iar energiile de activare calculate pentru reacțiile înainte și inversă care utilizează substraturile cu energie ridicată (dNTP și pirofosfat) diferă cu doar 15 kJ/mol (4). În cazul enzimelor termofile Taq și Klentaq1, energia de activare a reacției înainte variază foarte mult, între 90 și 125 kJ/mol, în funcție de condițiile experimentale și, probabil, de identitatea nucleotidelor care reacționează (8, 16), în timp ce energia de activare a pirofosforolizei nu a fost, după cunoștințele noastre, determinată experimental.
Am analizat ratele de încorporare a unui singur nucleotid de 50 µM de dCDP, dADP și dTDP, suprapuse pe dA, dC și, respectiv, dA, în timpul reacției de extensie a amorselor. Analiza Arrhenius a arătat o dependență liniară a ln(kobs) de 1/T pentru experimentele sub 60 °C, dezvăluind energii de activare de 85 ± 14, 108 ± 11 și 112 ± 15 kJ/mol pentru cele trei nucleotide (Fig. 3 A și B; n = 6 pentru fiecare nucleotidă). Analiza Arrhenius a reacției inverse cu 0,4 mM de fosfat, care produce o moleculă de dADP, a evidențiat o energie de activare mare de 138 ± 10 kJ/mol (n = 5), în concordanță cu rata lentă observată a fosforolizei ADN-ului de către Taq (Fig. 3 A și B) și reprezentând o creștere semnificativă față de energia de activare calculată a pirofosforolizei (92 kJ/mol în Pol β) (4). Astfel, energia de activare a reacțiilor directe și inverse pentru dADP diferă cu ∼30 kJ/mol, oferind o puternică polarizare pentru sinteza ADN. Această înclinație pentru reacția directă are ca rezultat o cerință mai mică de sechestrare a produsului fosfat de către o cale metabolică din aval, spre deosebire de sinteza ADN-ului bazată pe dNTP și hidroliza pirofosfatului de către pirofosfatazele anorganice. Mai mult, în cazul în care modificările conformaționale precatalitice din Taq polimeraza nu sunt afectate de substraturile cu energie scăzută și etapa de chimie este limitatoare de viteză, utilizarea dNDP-urilor și a fosfaților poate oferi noi perspective experimentale asupra catalizei enzimatice a sintezei ADN.
Parametrii cinetici ai reacțiilor înainte și înapoi cu Taq ADN polimeraza. (A) Analiza Arrhenius a fosforolizei (pentru a produce dADP; ▲) și a reacției directe cu dNDPs, obținând Ea de 138 ± 10 și, respectiv, 90 ± 10 kJ/mol (108 ± 11, 85 ± 14 și 112 ± 15 kJ/mol pentru dADP, △; dCDP, ○; și, respectiv, dTDP, +). (B) Coordonata de reacție pentru reacțiile înainte și inversă, prezentată în raport cu energia unui amorsă neexpusă, dAMP (presupusă a fi aceeași cu valoarea AMP) și fosfat (Pi). Adăugarea energiilor de activare măsurate la energia hidrolizei ADP și a unui fosfodiester relevă faptul că starea de tranziție (TS) se află aproximativ la același nivel pentru reacțiile înainte și inversă (în limita erorii experimentale, indicată de caseta gri). Diferența mare dintre energiile de activare și KM pentru dNDP și fosfat, împreună cu natura exergonică a reacției globale, explică eficiența sintezei ADN-ului din dNDP, în special de către ADN polimerazele ADN termofile, și stabilitatea aparentă a ADN-ului în ceea ce privește fosforoliza în condiții de încărcare cu energie scăzută sau ridicată a celulei.
Studiul nostru demonstrează că Taq și alte câteva enzime din familiile A și B de ADN polimeraze, inclusiv enzimele replicative ale bacteriilor termofile și mezofile, pot înlocui substraturile trifosforice canonice cu analogii difosfați. Primele dovezi privind posibilitatea de a renunța la γ-fosfatul din substratul nucleotidic au apărut în urma studiilor efectuate asupra transcriptazei inverse a HIV-1 și a bacteriofagului RB69 ADN polimerazei gp43. Variantele HIV-1 RT care suprimă interacțiunea electrostatică dintre γ-fosfatul din dNTP-ul de intrare și polimerază au dus la păstrarea activității, deși la o rată mult mai mică (17⇓-19), iar bacteriofagul RB69 ADN polimeraza gp43 a prezentat o activitate similară (20). Ambele enzime virale acceptă dNDP ca substraturi, dar cu KM (sau KD) care sunt de 500 și 17 ori mai mari și cu constante de viteză care sunt de 100 și 400 de ori mai mici decât pentru dNTPs de către RT HIV-1 și, respectiv, RB69 gp43 (20, 21). Studiul nostru demonstrează că polimerazele replicative celulare posedă această activitate, descrie afinitățile de substrat și energiile de activare atât pentru reacțiile directe, cât și pentru cele inverse și implică faptul că sinteza ADN-ului din dNDP-uri este rezonabil de eficientă, în special pentru enzimele termostabile.
Rezultatele noastre sugerează că replicarea ADN-ului poate fi realizată folosind dNDP-uri ca substraturi. La termofile, replicarea genomului poate fi mai puțin sensibilă la încărcătura energetică a celulei decât la mezofile, deoarece polimerazele termostabile pot accepta atât substraturile difosforilate, cât și cele trifosforilate. Astfel, replicarea ADN-ului este mai puțin afectată de raportul intracelular ATP/ADP, iar eficiența relativ ridicată cu care este sintetizat ADN-ul la temperaturi ridicate sugerează că termofilele ar putea fi capabile să renunțe complet la substraturile trifosforilate. Mai mult, dovezile paleobiologice sugerează că ultimul strămoș comun al biosferei noastre a fost un termofil (22⇓-24), iar studiul nostru implică faptul că substraturile defosforilate ar fi putut fi suficiente pentru replicarea genomului organismelor timpurii, atenuând necesitatea metabolizării intermediarilor metabolici trifosforilați cu energie ridicată. Într-un astfel de caz, difosfații ar putea fi considerați intermediari în evoluția metaboliților de mare energie și ar putea include elementele constitutive ancestrale ale genomurilor timpurii, cum ar fi ribonucleotidele sau acizii nucleici mai simpli.
ADN polimeraza joacă roluri importante în numeroase biotehnologii. Utilizarea substraturilor difosfați raportate aici are potențialul de a face practică încorporarea de analogi costisitori, cum ar fi nucleotidele marcate izotopic sau modificate chimic, eliminând necesitatea unor sinteze dificile de trifosfați. Această caracteristică a ADN polimerazelor poate oferi, de asemenea, o metodă de detectare a nucleotidelor utilizate în secvențierea ADN de mare capacitate. Două metode comune detectează grupul PPi care pleacă asociat cu extensia amorselor, fie printr-un test secundar chemiluminiscent, fie prin monitorizarea unei modificări a pH-ului local (25, 26). Utilizarea unui substrat dNDP produce Pi, oferind astfel o oportunitate suplimentară de a distinge între nucleotidele încorporate. Această apreciere extinsă a capacităților ADN polimerazei sugerează, de asemenea, că examinarea altor enzime dependente de trifosfați ar putea dezvălui toleranța pentru substraturi difosfați cu energie mai mică, mai ușor de accesat, ca intermediari evolutivi.
.