Fluorescență

Fluorescența este o luminescență care se întâlnește mai ales ca fenomen optic în corpurile reci, în care absorbția moleculară a unui foton la o anumită lungime de undă declanșează emisia unui alt foton cu o lungime de undă mai mare. Substanța care prezintă fluorescență se numește fluorofor. Diferența de energie dintre fotonii absorbiți și cei emiși sfârșește sub formă de vibrații moleculare sau căldură. De obicei, fotonul absorbit este în domeniul ultraviolet, iar lumina emisă este în domeniul vizibil, dar acest lucru depinde de fluoroforul utilizat și de alți factori.

Fluorescența este denumită după mineralul fluorit, compus din fluorură de calciu, care prezintă adesea acest fenomen. O varietate de alte minerale și materiale organice sunt, de asemenea, fluorescente și sunt utilizate pentru o serie de aplicații diferite. De exemplu, fluorescența este utilă pentru iluminarea și marcarea moleculelor în chimia analitică și biochimie. Fluoroforii au fost utilizați pentru a marca celulele, anticorpii și alte structuri biologice și pentru a determina structurile și modurile de acțiune ale acestora.

Exemple de materiale fluorescente

Pietrele prețioase, mineralele, fibrele și multe alte materiale care pot fi întâlnite în criminalistică sau care au legătură cu diverse obiecte de colecție pot avea o fluorescență distinctivă sau pot prezenta o fluorescență diferită sub acțiunea ultravioletelor cu unde scurte, a ultravioletelor cu unde lungi sau a razelor X.

Multe tipuri de calcite și chihlimbar vor prezenta fluorescență sub acțiunea ultravioletelor cu unde scurte. Rubinele, smaraldele și diamantul Hope prezintă fluorescență roșie sub lumină UV cu unde scurte; diamantele emit, de asemenea, lumină sub raze X.

Petrolul brut (petrolul) prezintă fluorescență într-o gamă de culori, de la maro opac pentru uleiuri grele și gudroane până la gălbui strălucitor și alb albăstrui pentru uleiuri foarte ușoare și condensate. Acest fenomen este utilizat în forajele de explorare petrolieră pentru a identifica cantități foarte mici de petrol în resturile de foraj și în probele de carotaj.

Lichidele organice, cum ar fi amestecurile de antracen în benzen sau toluen, sau stilbene în aceiași solvenți, devin fluorescente la iradierea cu raze ultraviolete sau gamma. Timpii de dezintegrare ai acestei fluorescențe sunt de ordinul nanosecundelor, deoarece durata de viață a luminii depinde de durata de viață a stărilor excitate ale materialului fluorescent, în acest caz antracenul sau stilbenul.

Aplicații

Există mulți compuși naturali și sintetici care prezintă fluorescență, iar aceștia au o serie de aplicații. Unele animale de mare adâncime, cum ar fi ochiul verde, folosesc fluorescența.

Iluminare

Tubul fluorescent obișnuit se bazează pe fluorescență. În interiorul tubului de sticlă se află un vid parțial și o cantitate mică de mercur. O descărcare electrică în tub face ca atomii de mercur să emită lumină. Lumina emisă se află în domeniul ultraviolet (UV), este invizibilă și este dăunătoare pentru majoritatea organismelor vii. Tubul este căptușit cu un strat de material fluorescent, numit fosfor, care absoarbe ultravioletele și emite din nou lumină vizibilă. Iluminatul fluorescent este foarte eficient din punct de vedere energetic în comparație cu tehnologia cu incandescență, dar spectrele produse pot face ca anumite culori să pară nenaturale.

La mijlocul anilor 1990, au devenit disponibile diode emițătoare de lumină albă (LED), care funcționează printr-un proces similar. De obicei, semiconductorul emițător de lumină propriu-zis produce lumină în partea albastră a spectrului, care lovește un compus fosforic depus pe cip; fosforul devine fluorescent din partea verde spre roșu a spectrului. Combinația dintre lumina albastră care trece prin fosfor și lumina emisă de fosfor produce o emisie netă de lumină albă.

Se spune că iluminatul stradal modern cu vapori de mercur a evoluat de la lampa fluorescentă.

Sticla fluorescentă oxidează esterul de oxalat de fenil pentru a produce lumină.

Iluminatul fluorescent compact (CFL) este la fel ca orice lampă fluorescentă tipică, cu avantaje. Este autobalastată și este utilizată pentru a înlocui incandescența în majoritatea aplicațiilor. Ele produc un sfert din căldura per lumen ca și becurile cu incandescență și durează de aproximativ cinci ori mai mult. Aceste becuri conțin mercur și trebuie manipulate și eliminate cu grijă.

Chimie analitică

Fluorescența în mai multe lungimi de undă poate fi detectată de un detector cu matrice, pentru a detecta compuși din fluxul HPLC. De asemenea, plăcile de cromatografie în strat subțire (TLC) pot fi vizualizate dacă compușii sau un reactiv colorant sunt fluorescenți.

Urmele digitale pot fi vizualizate cu ajutorul unor compuși fluorescenți, cum ar fi ninhidrina.

Biochimie și medicină

Moleculele biologice pot fi marcate cu o grupare chimică fluorescentă (fluorofor) printr-o reacție chimică simplă, iar fluorescența marcajului permite detectarea sensibilă și cantitativă a moleculei. Exemplele includ:

• Microscopia prin fluorescență a țesuturilor, celulelor sau structurilor subcelulare se realizează prin marcarea unui anticorp cu un fluorofor și permițând anticorpului să găsească antigenul său țintă în cadrul probei. Marcarea mai multor anticorpi cu diferiți fluorofori permite vizualizarea mai multor ținte în cadrul unei singure imagini.
• Secvențierea automată a ADN-ului prin metoda de terminare a lanțului; fiecare dintre cele patru baze diferite de terminare a lanțului are propriul marcaj fluorescent specific. Pe măsură ce moleculele de ADN marcate sunt separate, eticheta fluorescentă este excitată de o sursă UV, iar identitatea bazei care termină molecula este identificată prin lungimea de undă a luminii emise.
• Detecția ADN: compusul bromura de etidiu, atunci când este liber să își schimbe conformația în soluție, are o fluorescență foarte mică. Fluorescența bromurii de etidiu este mult amplificată atunci când se leagă de ADN, astfel încât acest compus este foarte util în vizualizarea localizării fragmentelor de ADN în electroforeza pe gel de agaroză. Bromura de etidiu poate fi toxică; o alternativă mai sigură este colorantul SYBR Green.
• Microarray de ADN
• Imunologie: Un anticorp are atașată o grupare chimică fluorescentă, iar locurile (de exemplu, pe un specimen microscopic) unde anticorpul s-a legat pot fi văzute și chiar cuantificate prin fluorescență.
• FACS (sortare celulară activată prin fluorescență)
• Fluorescența a fost folosită pentru a studia structura și conformațiile ADN-ului și proteinelor cu tehnici precum transferul de energie prin rezonanță de fluorescență, care măsoară distanța la nivel de angstrom. Acest lucru este deosebit de important în cazul complexelor formate din mai multe biomolecule.
• Aequorina, de la meduza Aequorea victoria, produce o strălucire albastră în prezența ionilor de Ca2+ (printr-o reacție chimică). Ea a fost utilizată pentru a obține imagini în timp real ale fluxului de calciu în celule. Succesul înregistrat cu aequorin a stimulat continuarea cercetărilor asupra A. victoria și a dus la descoperirea proteinei fluorescente verzi (GFP), care a devenit un instrument de cercetare extrem de important. GFP și proteinele înrudite sunt utilizate ca reportofoane pentru orice număr de evenimente biologice, inclusiv pentru aspecte precum localizarea subcelulară. Nivelurile de expresie a genelor sunt uneori măsurate prin legarea unei gene pentru producția de GFP la o altă genă.

De asemenea, multe molecule biologice au o fluorescență intrinsecă care poate fi uneori utilizată fără a fi nevoie de atașarea unei etichete chimice. Uneori, această fluorescență intrinsecă se modifică atunci când molecula se află într-un mediu specific, astfel încât poate fi măsurată distribuția sau legarea moleculei. Bilirubina, de exemplu, este foarte fluorescentă atunci când se leagă de un site specific de pe albumina serică. Protoporfirina de zinc, formată în globulele roșii în curs de dezvoltare în locul hemoglobinei atunci când fierul nu este disponibil sau când este prezent plumbul, are o fluorescență strălucitoare și poate fi folosită pentru a detecta aceste probleme.

În 2006, numărul aplicațiilor de fluorescență este în creștere în științele biologice biomedicale și în cele conexe. Metodele de analiză în aceste domenii sunt, de asemenea, în creștere, deși cu o nomenclatură din ce în ce mai nefericită sub forma unor acronime precum:: FLIM, FLI, FLIP, FLIP, CALI, FLIE, FRET, FRAP, FCS, PFRAP, smFRET, FIONA, FRIPS, SHREK, SHRIMP, TIRF. Majoritatea acestor tehnici se bazează pe microscoape cu fluorescență. Aceste microscoape utilizează surse de lumină de mare intensitate, de obicei lămpi cu mercur sau xenon, LED-uri sau lasere, pentru a excita fluorescența în probele care fac obiectul observației. Filtrele optice separă apoi lumina de excitație de fluorescența emisă, pentru a fi detectată cu ochiul liber sau cu ajutorul unei camere (CCD) sau al altor detectoare de lumină (tuburi fotomultiplicatoare, spectrografe etc.). Se desfășoară numeroase cercetări pentru a îmbunătăți capacitățile unor astfel de microscoape, sondele fluorescente utilizate și aplicațiile la care acestea sunt aplicate. Se remarcă în special microscoapele confocale, care folosesc un orificiu în formă de ac de ac pentru a realiza secționarea optică – oferind o vedere cantitativă, tridimensională a probei.

Siguranță

Bucurile fluorescente creează mult mai puțină căldură reziduală decât becurile cu incandescență și cele cu halogen. Becurile cu halogen sunt implicate într-un număr mare de incendii, iar becurile cu incandescență prezintă, de asemenea, un risc mai mare de incendiu decât becurile fluorescente, din cauza căldurii reziduale. Lămpile se pot răsturna accidental sau, uneori, din cauza unor evenimente precum cutremurele. Prin urmare, utilizarea becurilor fluorescente poate fi un mijloc de prevenire a incendiilor accidentale. Cu toate acestea, becurile fluorescente pot conține mercur, iar spargerea unui astfel de bec ar putea duce la o deversare costisitoare de mercur.

Considerații teoretice

Fotochimie

Fluorescența apare atunci când o moleculă sau un punct cuantic se relaxează până la starea sa fundamentală după ce a fost excitat electronic.

Excitare: S 0 + h ν → S 1 {\displaystyle S_{0}+h\nu \to S_{1}}.

Fluorescență (emisie): S 1 → S 0 + h ν {\displaystyle S_{1}\to S_{0}+h\nu } , aici h ν {\displaystyle h\nu } este un termen generic pentru energia fotonilor, unde: h = constanta lui Planck și ν {\displaystyle \nu } = frecvența luminii. (Frecvențele specifice ale luminii excitante și emise depind de sistemul respectiv.)

Starea S0 se numește starea fundamentală a fluoroforului (molecula fluorescentă), iar S1 este prima sa stare excitată (electronic).

O moleculă în starea sa excitată, S1, se poate relaxa prin diferite căi concurente. Ea poate suferi o „relaxare non-radiativă”, în care energia de excitație este disipată sub formă de căldură (vibrații) către solvent. Moleculele organice excitate se pot relaxa, de asemenea, prin conversia într-o stare triplet care se poate relaxa ulterior prin fosforescență sau printr-o etapă secundară de relaxare non-radiativă.

Relaxarea unei stări S1 poate avea loc, de asemenea, prin interacțiunea cu o a doua moleculă prin stingerea fluorescenței. Oxigenul molecular (O2) este un stingător extrem de eficient al fluorescenței datorită stării sale de bază triplet neobișnuite.

Moleculele care sunt excitate prin absorbția luminii sau printr-un proces diferit (de exemplu, ca produs al unei reacții) pot transfera energie către o a doua moleculă „sensibilizată”, care este convertită în starea sa excitată și poate apoi să devină fluorescentă. Acest procedeu este utilizat în bastoanele luminoase.

Câștigul cuantic de fluorescență

Câștigul cuantic de fluorescență dă eficiența procesului de fluorescență. Se definește ca fiind raportul dintre numărul de fotoni emiși și numărul de fotoni absorbiți.

Φ = # p h o t o n s e m i t e d # p h o t o n s a b s o r b e d {\displaystyle \Phi ={\frac {\rm {\#\\ fotoni\ emiși}{\rm {\#\\ fotoni\ absorbiți}}}}

Câștigul cuantic maxim de fluorescență este de 1,0 (100 la sută); fiecare foton absorbit are ca rezultat un foton emis. Compușii cu randamente cuantice de 0,10 sunt totuși considerați destul de fluorescenți. Un alt mod de a defini randamentul cuantic al fluorescenței, este prin ratele de dezintegrare a stării excitate:

k f ∑ i k i {\displaystyle {\frac {{k}_{f}}{\sum _{i}{k}_{i}}}}

unde k f {\displaystyle {k}_{f}} este rata de emisie spontană de radiații și

∑ i k i {\displaystyle \sum _{i}{k}_{i}}

este suma tuturor ratelor de dezintegrare a stărilor excitate. Alte rate de dezintegrare a stării excitate sunt cauzate de alte mecanisme decât emisia de fotoni și, prin urmare, sunt adesea numite „rate non-radiative”, care pot include:stingerea coliziunii dinamice, interacțiunea dipol-dipol în câmp apropiat (sau transferul de energie prin rezonanță), conversia internă și trecerea intersistemică. Astfel, dacă rata oricărei căi se modifică, acest lucru va afecta atât durata de viață a stării excitate, cât și randamentul cuantic de fluorescență.

Randamentul cuantic de fluorescență se măsoară prin comparație cu un standard cu o cuantică cunoscută; sarea de chinină, sulfatul de chinină, într-o soluție de acid sulfuric este un standard comun de fluorescență.

Viața de fluorescență

Viața de fluorescență se referă la timpul mediu în care molecula rămâne în starea sa excitată înainte de a emite un foton. Fluorescența urmează de obicei o cinetică de ordinul întâi:

= 0 e – Γ t , {\displaystyle \left=\left_{0}e^{-\Gamma t},}

unde {\displaystyle \left} este concentrația moleculelor din starea excitată la momentul t {\displaystyle t} , 0 {\displaystyle \left_{0}} este concentrația inițială și Γ {\displaystyle \Gamma } este rata de dezintegrare sau inversul duratei de viață a fluorescenței. Acesta este un exemplu de descreștere exponențială. Diferite procese radiative și non-radiative pot depopula starea excretată. În acest caz, rata totală de dezintegrare este suma tuturor ratelor:

Γ t o t = Γ r a d + Γ n r a d {\displaystyle \Gamma _{tot}=\Gamma _{rad}+\Gamma _{nrad}}.

unde Γ t o t {\displaystyle \Gamma _{tot}} este rata totală de dezintegrare, Γ r a d {\displaystyle \Gamma _{rad}} rata de dezintegrare radiativă și Γ n r a d {\displaystyle \Gamma _{nrad}} rata de dezintegrare non-radiativă. Este similar cu o reacție chimică de ordinul întâi în care constanta de viteză de ordinul întâi este suma tuturor vitezelor (un model cinetic paralel). În cazul în care rata de emisie spontană sau oricare dintre celelalte rate sunt rapide, durata de viață este scurtă. În cazul compușilor fluorescenți utilizați în mod obișnuit, timpii tipici de dezintegrare a stării excitate pentru compușii fluorescenți care emit fotoni cu energii cuprinse între UV și infraroșu apropiat se situează între 0,5 și 20 de nanosecunde. Durata de viață a fluorescenței este un parametru important pentru aplicațiile practice ale fluorescenței, cum ar fi transferul de energie prin rezonanță de fluorescență.

Reguli

Există mai multe reguli care se referă la fluorescență. Regula Kasha-Vavilov dictează că randamentul cuantic al luminescenței este independent de lungimea de undă a radiației excitante.

Această regulă nu este întotdeauna valabilă și este încălcată grav în multe molecule simple. O afirmație ceva mai sigură, deși tot cu excepții, este că spectrul de fluorescență prezintă o dependență foarte mică de lungimea de undă a radiației excitante.

Vezi și

• Fluoresceină
• Lampă fluorescentă
• Lumină
• Fosforescență
• Lumină
• Raze X

• Lakowicz, Joseph R. 2006. Principles of Fluorescence Spectroscopy, ed. a 3-a. New York: Springer. ISBN 978-0387312781
• Turro, Nicholas J. 1991. Fotochimie moleculară modernă. Mill Valley, CA: University Science Books. ISBN 093570272717
• Valeur, Bernard. 2002. Fluorescența moleculară: Principles and Applications. Weinheim: Wiley-VCH. ISBN 35272999919X

Toate linkurile recuperate la 14 aprilie 2017.

• Fluorofori.org Baza de date a coloranților fluorescenți
• Fluorescența pe Scienceworld
• Concepte de bază în fluorescență