Observarea embrionilor fertilizați pentru a obține embrioni de clivaj
De când a fost descrisă prima cultură de embrioni de iepure în 1912, iar zigotul de șoarece a putut fi cultivat in vitro pentru a forma embrioni în stadiul de blastocist , calitatea embrionului a devenit un factor important pentru sarcină după transferul embrionului in vitro în uter, deoarece calitatea embrionului are o strânsă corelație cu implantarea în uter a embrionului transferat. De la nașterea primului copil „eprubetă”, Louise Brown, în iulie 1978, pentru care Premiul Nobel pentru Fiziologie sau Medicină din 2010 a fost acordat lui Robert Edwards pentru dezvoltarea fertilizării in vitro (FIV) și a transferului de embrioni (TE) în vederea tratării infertilității la femeile cu oviducturi nepatentate, producția de embrioni in vitro (PIV) a fost utilizată pe scară largă în tratamentul infertilității umane și în reproducerea și extinderea populației animale. Cu toate acestea, succesul tehnologiei de reproducere asistată depinde, în principal, de producerea de embrioni viabili cu un potențial ridicat de implantare. Mai important, alegerea celui mai bun embrion pentru transfer a devenit o provocare majoră în FIV. La începuturile culturii embrionare, evaluarea calității embrionului se baza în principal pe criteriile morfologice ale embrionului transferat. Astfel, efectuarea unei observări în serie a morfologiei embrionului este o tehnică obișnuită pentru embriologi pentru a evalua embrionii și a fost considerată un predictor cheie al implantării și al sarcinii . Pe termen lung, embriologii au efectuat evaluări ale calității și morfologiei embrionare prin scoaterea embrionilor din incubator și plasarea lor sub microscop. Pe lângă observarea morfologiei, cercetătorii sunt interesați de o serie de studii privind schimbarea nucleului celular, activarea și expresia genelor, expresia proteinelor citoplasmatice, diferențierea blastomerilor și așa mai departe. Cu toate acestea, aceste studii duc adesea la moartea embrionilor. De exemplu, în studiul nostru timpuriu care a observat schimbarea microspindlelor după intrarea spermatozoizilor în ovul sau activarea ovocitelor, zigoții fertilizați sau ovulele activate trebuiau fixate pe lamă și colorate cu fluoresceină imunocitochimică și microscopie confocală cu laser . Cercetările noastre au arătat în mod clar alterarea microtubulilor și a cromatinei după activarea ovocitului bovin și injectarea introcitoplasmatică a spermatozoizilor (ICSI; figura 1). Spermatozoizii în ovocit sau ionoforul de calciu și etanolul pot activa ovocitul și pot provoca extruzia celui de-al doilea corp polar. Pentru a observa momentul apariției celui de-al doilea corp polar, am colorat diferite stadii ale ovocitelor după activare. Rezultatul a arătat că, după 5 ore postactivare, al doilea corp polar poate fi complet extrudat (figura 2).
Microscopie confocală cu scanare laser a modificărilor fusului și cromatinei la diferite momente post-activare și injecție intracitoplasmatică de spermatozoizi (ICSI) la bovine. Literele majuscule (stânga) indică schimbarea post-activare, iar literele mici (dreapta) indică după ICSI. A/a a arătat la 0,5 h, B/b este la 2 h, C/c este la 3 h, iar D/d este la 7 h după activare sau ICSI. Prenucleul din ovulul activat și prenucleul din ovulul ICSI au apărut cu culoare roșie.
Microscopie confocală cu scanare laser a modificărilor fusiforme și ale cromatinei la diferite momente după activare la bovine. La 0,5 h după activare, cromozomii fusului încep să se dividă, iar finalizarea diviziunii fusului necesită aproximativ 3 ore, iar al doilea corp polar poate fi extrudat la aproximativ 5 ore. Roșul și verdele împreună indică fusul, iar punctul roșu indică primul corp polar.
Studiul expresiei genice necesită adesea izolarea ARNm sau a proteinelor din embrioni ; prin urmare, embrionii trebuiau să fie lichidați și niciun embrion nu ar fi supraviețuit. Pentru a studia diferențierea celulară pe embrionii în stadiu moral și blastocist, a fost utilizată o metodă de colorare dublă cu microscopie cu fluoresceină pentru a distinge masa celulară internă (MCI) de trofoectoderm (TE). Numărul celor două celule diferite poate fi numărat pe baza culorilor diferite (ICM ca albastru și TE ca roz, figura 3).
Figura 3.
Distincția diferitelor celule în embrionii de blastocist bovin cu colorare dublă. Figura de sus prezintă un embrion blastocist cu masa celulară internă (ICM) marcată și în jurul celulelor trophectodermului (TE). Figura de jos prezintă un embrion de blastocist bovin cu dublă colorare, cu albastru pentru ICM și roz pentru celulele TE. Imaginea din partea de sus provine din căutarea pe o pagină web, iar autorul apreciază foarte mult curtoazia profesorului Fuliang Du pentru fotografia de jos nepublicată.
Aceste metode de cercetare deteriorează în cele din urmă toți embrionii și este imposibil de aplicat aceste metode în practica clinică. Astfel, evaluarea actuală a calității embrionilor se bazează în principal pe criteriile morfologice ale embrionilor transferați, care includ trei parametri majori, cum ar fi regularitatea blastomerilor, fragmentarea și granularitatea citoplasmei . De asemenea, numărul de celule embrionare în diferite zile de cultură și multinuclearitatea pot fi luate în considerare pentru a evalua calitatea embrionară . Mai multe rapoarte au documentat asocierea dintre caracteristicile morfologice ale embrionilor în stadiul de clivaj cu succesul sarcinii. Astfel, aceasta este în prezent metoda de bază pentru evaluarea calității embrionilor în FIV umană și în producția de embrioni in vitro la animale. Cu toate acestea, deși este ușor de practicat, această metodă scoate frecvent embrionii din incubator, ceea ce duce la preocupări privind siguranța și stabilitatea condițiilor de cultură . De asemenea, este posibil ca unele puncte cheie ale dezvoltării embrionare să nu fie observate în timpul observației. Evaluarea embrionilor de clivaj în timpul culturii și înainte de transferul embrionar este o practică clinică importantă. În prezent, principala evaluare a embrionilor fertilizați in vitro este observarea vizuală cu ajutorul microscopiei. În ultimii ani, în clinica de FIV umană sunt utilizate diverse incubatoare cu microscopie în timp real pentru a monitoriza toate etapele creșterii și dezvoltării embrionului. Deși tehnologiile de diagnosticare și screening al embrionilor preimplantare (PGD/PGS) au fost aplicate în practica de selecție a embrionilor umani pentru a îmbunătăți rata de sarcină, aceste tehnici sunt invazive pentru embrioni. Găsirea unei alte metode neinvazive pentru a selecta un embrion bun va fi foarte utilă în practica ART umană. Sallam et al. au trecut în revistă metodele neinvazive de selecție a embrionilor și au evaluat aceste metode în lumina celor mai bune dovezi disponibile în prezent pentru a afla dacă vreuna dintre ele este pregătită să înlocuiască sau să completeze metoda consacrată a evaluării morfologice. Astfel, avem nevoie de instrumente mai puternice pentru a estima markerii morfocinetici ai embrionilor.
2.1. Morfocinetica clivajului embrionar bazată pe imagistica time-lapse
De decenii, cercetătorii au încercat să urmărească dezvoltarea organismelor multicelulare de la ouăle fertilizate până la adulți. Deși oamenii de știință au explorat etape individuale ale acestui proces, nu exista nicio metodă care să le permită să modeleze în direct întregul proces de dezvoltare. În prezent, progresele în domeniul microscopiei cu foaie de lumină raportate în două Nature Methodspapers au permis cercetătorilor să vizualizeze dezvoltarea timpurie în mare detaliu . Microscoapele recente cu foaie de lumină folosesc o foaie de lumină laser pentru a ilumina o secțiune subțire a unui eșantion și pentru a capta întregul plan într-un singur instantaneu. Acest lucru le permite să utilizeze mult mai puțină lumină decât microscoapele confocale sau cu doi fotoni. Este foarte rapid, dar și foarte delicat pentru a funcționa extrem de bine în mai multe moduri critice în același timp . Pentru imagistica dezvoltării unor embrioni întregi, cum ar fi cei de Drosophila, pește zebră și șoareci, această nouă tehnică de imagistică multiview este fantastică.
Imagistica time-lapse este o altă tehnologie emergentă, neinvazivă, care permite monitorizarea 24 de ore din 24 a dezvoltării embrionului, oferind posibilitatea de a crește cantitatea și calitatea informațiilor morfologice fără a perturba condițiile de cultură . Microscopul time-lapse este foarte util pentru observarea dezvoltării embrionare. În ultimul deceniu, multe clinici sau centre de FIV umană au început să utilizeze imagistica time-lapse pentru a monitoriza creșterea și diviziunea embrionară în timpul culturii in vitro și, în cele din urmă, pentru a selecta embrionul de bună calitate pentru transfer în funcție de datele și imaginile înregistrate. S-a raportat că această tehnică este capabilă să îmbunătățească implantarea și sarcina embrionului transferat. Pe baza înregistrării în timp a scindării embrionului, se poate determina viteza normală de scindare a embrionului. Astfel, în cel de-al doilea capitol al acestei cărți, a fost subliniat momentul clivajului embrionar pe baza markerilor morfocinetici prin intermediul monitorului time-lapse. În conformitate cu această schemă de sincronizare a clivajului embrionar, embriologii pot ști în mod clar în ce stadiu ar trebui să se afle un embrion în diferite momente. Astfel, un embrion de calitate optimă sau un embrion cu potențial ridicat de implantare poate fi selectat pentru transfer pentru a obține o rată de sarcină mai mare. Utilizând sistemul de înregistrare continuă și frecventă a timpului, unii markeri morfocinetici pot fi evidențiați în sistemul time-lapse. De exemplu, diviziunea rapidă a celulelor embrionare la un moment dat duce adesea la o rată de implantare mai mică. În mod normal, diviziunea de la zigot în 2-3 celule necesită aproximativ 10-11 ore, dar Rubio et al. au constatat că unii embrioni au nevoie doar de aproximativ 5 ore pentru a finaliza această diviziune, iar acești embrioni au o rată de implantare mult mai mică decât cea a embrionilor cu diviziune normală (1,2 % față de 20 %). De asemenea, scindarea inegală a embrionului, care este definită ca o ruptură a unui blastomer în trei blastomeri fiice sau un interval al ciclului celular mai mic de 5 ore, produce adesea un potențial de implantare semnificativ mai scăzut . Astfel, putem folosi acești markeri morfocinetici mai preciși pentru a distinge calitatea embrionară.
Cel de-al treilea capitol examinează și verifică în continuare dacă tehnologia imagistică time-lapse este utilă pentru selectarea embrionilor de „calitate superioară” pentru transfer în vederea îmbunătățirii rezultatelor ART, mai degrabă decât evaluarea morfologică convențională. În mod interesant, posibilele corelații dintre sexul embrionului, fragmentarea embrionară, protocoalele de tratament, diferitele medii de cultură și morfocinetica embrionară au fost evaluate pe baza unor noi cercetări privind instalațiile de imagistică time-lapse. În plus, se discută, de asemenea, diverși algoritmi și modele predictive concepute în ciclurile ART cu imagistică time-lapse. De exemplu, o mulțime de cercetări privind viteza de dezvoltare embrionară la animale și oameni prin observarea morfologică obișnuită au arătat că embrionii masculi cresc mai repede decât embrionii feminini . Cu toate acestea, observarea actuală a imagisticii time-lapse poate oferi mai multe detalii și informații exacte despre diferența dintre embrionii masculi și femele în timpul primelor diviziuni. Deși embrionii de sex feminin au prezentat parametrii morfocinetici ai stadiului de clivaj târziu (t8), morula (tM) și blastocist, aceștia au prezentat o expansiune mai devreme decât bărbații. Astfel, punctele temporale cheie de observare sunt legate de dezvoltarea genului embrionului. În mod interesant, autorii au conceput un model în funcție de momentul celei de-a doua sincronii și al formării morulei cu patru subgrupuri pentru a prezice probabilitatea ca un embrion să fie de sex feminin.
Pentru a studia și explora în continuare morfocinetica clivajului embrionar, cel de-al patrulea capitol discută câteva metode de analiză spațio-temporală a clivajului embrionar in vitro.Analiza time-lapse automatizată sau semiautomatizată a imaginilor embrionare din stadiul timpuriu în timpul clivajului poate oferi informații despre momentul mitozei, regularitatea atât a momentului cât și a modelului de diviziune, precum și despre linia celulară. Monitorizarea simultană a proceselor moleculare permite studierea conexiunilor dintre expresia genetică și fiziologia și dezvoltarea celulelor. Prin date de imagistică în timp și software analitic, se poate crea cu ușurință o secvențiere video cvadridimensională a embrionilor, astfel încât embrionii în creștere să afișeze noi perspective asupra dezvoltării temporale a embrionului. În acest capitol, autorii descriu trei metode cu variații în ceea ce privește analiza hardware și software, dând câteva exemple de rezultate pentru a deschide o fereastră către noi informații în embriologia dezvoltării, deoarece modelul de diviziune embrionară și linia genetică sunt studiate in vivo.
2.2. Expresia genică a embrionului de clivaj și evaluarea neinvazivă a viabilității embrionului prin analiza mediilor de cultură
Dezvoltarea embrionului preimplantat cunoaște o serie de evenimente critice și modificări epigenetice remarcabile, iar reprogramarea expresiei genice are loc pentru a activa genomul embrionar. În etapele timpurii ale dezvoltării embrionului preimplantat, ARNm matern conduce dezvoltarea embrionară. De-a lungul dezvoltării embrionare timpurii, se menține un model de metilare diferențială, deși unele prezintă modificări specifice fiecărui stadiu. Studii recente au arătat că procesul de demetilare diferențială are ca rezultat o expresie diferențială a genelor parentale în embrionii în curs de dezvoltare timpurie, care poate avea un impact asupra dezvoltării corecte . De asemenea, s-a demonstrat că ARN-urile necodificatoare, ARN-urile necodificatoare lungi (lncRNA) și ARN-urile necodificatoare scurte, microARN-urile (miARN-uri), joacă un rol important în reglarea ARNm și, prin urmare, rolul lor în dezvoltarea preimplantară a căpătat importanță. Capitolul cinci trece în revistă diferiții factori care afectează expresia genică în timpul dezvoltării embrionului preimplantat, care include factorii epigenetici, concentrându-se pe profilurile de metilare, ale gameților și embrionilor preimplantați. Efectele ARN-urilor necodificatoare asupra expresiei genelor au fost evaluate în profunzime.
Pentru că apariția expresiei genelor în timpul dezvoltării embrionare în cultura in vitro, embrionii preimplantați necesită adesea medii de cultură cu nutriție bogată. Embrionul în timpul creșterii și dezvoltării sale trebuie să absoarbă unele componente nutritive importante din mediul de cultură și să producă metabolic unele subproduse ca rezultate ale expresiei genice. Din acest punct de vedere, cultivarea in vitro a embrionilor oferă, de asemenea, un material foarte important pentru evaluarea neinvazivă ulterioară a embrionilor prin examinarea biomarkerilor din mediul de cultură embrionară uzat. Metodele dezvoltate în prezent se concentrează pe măsurarea compușilor metabolici secretați de embrionii în curs de dezvoltare. Aceste studii utilizează în principal instrumentele analitice și proteomice moderne. Unele studii sugerează că profilarea metabolică a mediilor de cultură embrionară cu ajutorul spectroscopiilor optice și neoptice ar putea constitui o completare utilă a strategiilor actuale de evaluare a embrionilor și ar putea oferi o perspectivă asupra fenotipului embrionilor cu potențial reproductiv în creștere .
În cel de-al șaselea capitol, autorii descriu noua lor descoperire, lanțul alfa-1 al moleculei de haptoglobină umană ca biomarker cantitativ al viabilității embrionare. Într-o serie de experimente retrospective, în orb, au obținut o rată de succes de peste 50%. Acest capitol rezumă abordările metabolice și proteomice disponibile în prezent pentru evaluarea moleculară neinvazivă a viabilității embrionare. Studii recente au arătat că evaluarea componentelor moleculare ale mediilor nutritive este un domeniu promițător în căutarea markerilor de implantare embrionară reușită, cu dezvoltarea ulterioară a unei sarcini clinice și nașterea unui copil sănătos, pentru a spori eficiența tratamentului cu ajutorul tehnicilor ART . În cazul în care compoziția moleculară a mediilor de cultivare poate fi utilizată ca o procedură neinvazivă suplimentară pentru a alege un embrion pentru transferul selectiv, aceasta va fi foarte utilă pentru a îmbunătăți rezultatul sarcinii FIV umane.