El reciente editorial de Dayan y Wraith en esta revista puso de manifiesto los retos para el desarrollo de nuevas inmunoterapias tras el desastroso ensayo del TGN1412. Este resumen presenta algunos de los conocimientos adquiridos en muchos ensayos clínicos de anti-D que pueden ser relevantes para la inmunología traslacional.
La prevención de la hidropesía fetal o enfermedad hemolítica del feto y del recién nacido (HDFN) mediante anti-D profiláctico es la aplicación clínica más exitosa de la inmunosupresión mediada por anticuerpos. La HDFN se produce después de que una mujer D-negativa se inmunice contra los glóbulos rojos fetales D-positivos tras una hemorragia fetomaterna (FMH); la IgG anti-D producida se transfiere a través de la placenta causando la destrucción de los glóbulos rojos fetales por los macrófagos esplénicos. En la década de 1940, cuando se reconoció por primera vez la causa de esta enfermedad, el 1% de los bebés nacían con HDFN y el 40% de ellos morían. El anticuerpo anti-D es el más comúnmente implicado. El polipéptido RhD de los glóbulos rojos es el más inmunogénico de los antígenos del grupo sanguíneo, ya que está ausente en las células de los individuos D-negativos que carecen del gen RHD.
La HDFN es ahora rara, en parte debido a la mejora de los cuidados fetales y neonatales, pero sobre todo a la prevención de la inmunización primaria de las mujeres D-negativas susceptibles mediante la profilaxis con IgG anti-D . Desde 1968, tras el éxito de los ensayos clínicos realizados en el Reino Unido y EE.UU., el anti-D se ha administrado al 10% de todas las mujeres en el período postnatal, lo que ha dado lugar a una reducción de la incidencia de la enfermedad de aproximadamente el 95%. En la actualidad, menos de 30 muertes perinatales al año son causadas por la HDFN. En 2002, el Instituto Nacional de Salud y Excelencia Clínica (NICE) recomendó que se administrara la profilaxis prenatal rutinaria contra la D a todas las mujeres D-negativas, además de la profilaxis postnatal, para reducir aún más la tasa de inmunización. El anti-D intravenoso (IV) también se utiliza ahora terapéuticamente para tratar a algunos pacientes D-positivos con púrpura trombocitopénica inmune (PTI) . Así pues, la demanda de anti-D está aumentando.
La inmunoglobulina anti-D se prepara a partir de plasma humano hiperinmune agrupado. Durante muchos años, los problemas de seguridad virológica y, más recientemente, la variante de la enfermedad de Creutzfeld Jacob (vCJD) han estimulado la búsqueda de suministros alternativos. En el Reino Unido, el plasma para el fraccionamiento se obtiene ahora de donantes norteamericanos debido a la preocupación de que los donantes del Reino Unido sean portadores latentes de la vECJ. Con el objetivo de sustituir los anticuerpos policlonales preparados a partir de plasma humano por versiones biotecnológicas tanto para el diagnóstico como para el uso clínico, se han producido cientos de anticuerpos monoclonales anti-D (mAb) o recombinantes (rAb). Todos ellos derivan de genes de inmunoglobulinas humanas o de células B, ya que los ratones no reconocen el antígeno RhD. Se han utilizado varios sistemas de expresión, incluyendo líneas de células B humanas, células de ovario de hámster chino (CHO), heterohibridomas de ratón-humano y mielomas de rata.
Aunque el mecanismo exacto de la supresión de la inmunización D mediante la administración de IgG anti-D pasiva aún está por dilucidar, se sabe que los glóbulos rojos D-positivos son eliminados rápidamente hacia el bazo por los macrófagos a través de las interacciones del receptor Fc de IgG (FcγR) y se convierten en no inmunogénicos. De hecho, para garantizar que la profilaxis anti-D sea probablemente eficaz para evitar la inmunización con D a una gran FMH, las mujeres se someten a pruebas 2-3 días después para comprobar que las células fetales se eliminan de la circulación . Por lo demás, los hematíes alogénicos tienen una larga supervivencia tras la HFM o la transfusión. Las respuestas aloinmunes tardan en desarrollarse, normalmente entre 5 y 15 semanas para el anti-D . Esto se debe probablemente a su falta de señales de peligro (de moléculas extrañas), de modo que no son reconocidas por el sistema inmunitario hasta que se vuelven senescentes, lo que estimula entonces su fagocitosis a través de los receptores de fosfatidil serina . Sin la profilaxis del RhD, aproximadamente el 17% de las mujeres D-negativas se inmunizan después del embarazo con un feto D-positivo . Esta incidencia es inferior a la de los sujetos normales deliberadamente inmunizados (hasta aproximadamente el 85% responden ) porque para la mayoría de las mujeres los volúmenes de FMH son demasiado pequeños para que los glóbulos rojos sean inmunogénicos . Las mujeres embarazadas pueden generar respuestas aloinmunes robustas mientras toleran a su feto semialogénico.
En los últimos 20 años, se han probado 19 mAbs y rAbs anti-D en 15 estudios first-in-man. Estos fueron revisados recientemente y se resumen aquí. No se produjeron efectos adversos graves. Los ensayos biológicos in vitro de fagocitosis y hemólisis mediada por FcγR utilizando células efectoras humanas están bien establecidos y se utilizaron para la selección. En los ensayos clínicos se evaluó la capacidad de los anticuerpos para eliminar pequeños volúmenes (menos del 1%) de eritrocitos D-positivos de la circulación y, en algunos estudios, también se determinó la capacidad de los anti-D para evitar la inmunización con D. Muchos de los mAbs y rAbs se compararon directamente con los anti-D policlonales.
Se observó una gran heterogeneidad en la eficacia de los anticuerpos (Tabla 1). Dos mAbs derivados de líneas celulares B-linfoblastoides humanas, BRAD-3 y BRAD-5, mediaron una rápida eliminación de los glóbulos rojos e impidieron la inmunización con D casi con la misma eficacia que el anti-D policlonal, aunque se utilizó una dosis de tres a cuatro veces mayor. Las vidas medias plasmáticas de BRAD-3 y BRAD-5 eran normales, pero la biodisponibilidad era la mitad de la del anti-D policlonal. Cuando estos anticuerpos se expresaron como rAbs en células CHO, la eliminación de glóbulos rojos D-positivos autólogos fue más lenta que la de los mAbs originales. Un amplio estudio en el que se utilizó otro rAb anti-D derivado de CHO, el MonoRho, arrojó resultados decepcionantes, ya que el aclaramiento de los eritrocitos fue extremadamente variable, generalmente muy lento y sin correlación con la dosis de anti-D . La bajísima biodisponibilidad del MonoRho podría explicar en parte este hecho. Sin embargo, los sujetos no produjeron anti-D, aunque no se les administraron inyecciones de desafío de glóbulos rojos D-positivos para determinar su estado de inmunización D . Los MAbs producidos por líneas celulares de mieloma murino (como heterohibridomas de ratón-humano) también mostraron una gran variabilidad en el aclaramiento de los glóbulos rojos, pero inesperadamente, más de la mitad de los receptores se inmunizaron rápidamente contra D, el doble de lo que ocurriría sólo con los glóbulos rojos. Así pues, estos anti-D tuvieron un efecto adyuvante, potenciando la respuesta inmunitaria a los eritrocitos D-positivos en lugar de impedirla como se pretendía. Estudios posteriores en los que se utilizaron rAbs anti-D producidos por células de mieloma de rata demostraron que promovían una eliminación extremadamente rápida de los hematíes autólogos, más rápida que los anti-D policlonales. El efecto de la alteración de la línea celular que expresa el FOG-1 de ratón a rata fue sorprendente, cambiando el aclaramiento de muy lento e incompleto a muy rápido . En este último estudio, esto se asoció a la hemólisis, a un cierto aclaramiento en el hígado y a reacciones febriles. Estas respuestas no se producen tras la profilaxis con anti-D policlonal. Inesperadamente, los mutantes de FOG-1 rAb, que carecen de interacciones FcγR in vitro, también mediaron una rápida eliminación de los eritrocitos, aunque se esperaba una supervivencia normal. Estos anti-D de IgG deben haberse unido a receptores distintos del FcγR de IgG.
Tabla 1
Resumen de datos de ensayos clínicos de anti-D policlonales y mAbs y rAbs anti-D.
| Célula utilizada para la expresión | Clon | Tasa de eliminación de eritrocitos (de cero a rápida: – a +++++) | Efecto en la inmunización RhD | Referencia |
|---|---|---|---|---|
| Humano B | Policlonal | Rápido, poca variación entre sujetos (++++) | Prevenido | |
| Línea celular linfoblastoide B humana | BRAD-3, BRAD-5 (mAbs) BRAD-3+BRAD-5 (mezcla) (mAbs) | Rápido, poca variación entre sujetos, pero una dosis 3 veces superior a la del anti-D policlonal utilizado (+++) | Prevenido en el 90% de los sujetos | |
| CHO | BRAD-3+BRAD-5 (mezcla) (rAbs) | Menos que la mezcla de mAbs BRAD-3+BRAD-5 (++) | (No se ha hecho) | |
| CHO | MonoRho (rAb) | Muy variable entre sujetos (de + a +++) | ¿Prevenido? | |
| Mieloma de ratón | G7, G12, G17, G48 (mAbs) | Muy variable entre sujetos (- a ++++) | Aumentada, respuesta rápida anti-D | |
| Mieloma de ratón | AD1+AD3 (mAbs) | Lenta y variable (+) | Aumentada, rápida respuesta anti-D | |
| Mieloma de ratón | FOG-1 (mAb) | Más bien lenta y variable (de + a ++) | (No realizada) | |
| Mieloma de rata | FOG-1 &mutantes (rAbs) | Extremadamente rápida, incluso en ausencia de unión a FcγR (+++++) | (No realizado) | |
| Mieloma de rata | R297 (rAb) | Extremadamente rápido (+++++) | (No se ha hecho) |
Todos los ensayos clínicos variaron, lo que dificulta la comparación directa.
Los estudios de aclaración se realizaron en sujetos D-positivos (autólogos) o D-negativos, inyectándose glóbulos rojos antes o después del anti-D. Los volúmenes de glóbulos rojos oscilaron entre 0-5 y 15 ml. Las dosis de anti-D variaron (entre 100 y 1800 µg) y el anti-D se administró en células pre-revestidas o se inyectó por vía i.v. o i.m. Los estudios de depuración se realizaron durante un periodo de entre 1 h y 7 días, con tiempos variados de recogida de muestras. Se inscribieron de uno a 94 sujetos. En algunos estudios, se calcularon las tasas de eliminación.
La detección de respuestas anti-D se determinó en muestras tomadas cada 2 ó 4 semanas o en una única muestra de 3 ó 6 meses; sólo en dos estudios se administraron inyecciones de desafío de glóbulos rojos (inmunización secundaria).
Muchos de los mAbs y rAbs anti-D no se comportaron como los anti-D policlonales. Ninguno fue tan eficaz y algunos procedentes de líneas celulares de roedores incluso dieron lugar a respuestas inmunitarias no deseadas. Las respuestas in vivo estaban determinadas principalmente por la especie de la línea celular que producía los anticuerpos y no por las secuencias proteicas. La causa de estas reacciones inesperadas y posiblemente perjudiciales puede deberse a que las IgG anti-D producidas a partir de células animales interactuaron con componentes del sistema inmunitario innato. La explicación más probable es la variación en su composición de oligosacáridos.
El tipo de glicosilación de la IgG depende de la célula en la que se produce y es específico de cada especie. Estructuras como el ácido N-glicolil neuramínico y los oligosacáridos de alta manosa en las IgG de roedores pueden ser reconocidas como extrañas por los receptores de reconocimiento de patrones (PRR) de la inmunidad innata, con las consiguientes respuestas proinflamatorias. Los PRR incluyen la asialoglicoproteína celular y los receptores de manosa. Tras unirse al anti-D en los glóbulos rojos D-positivos, podrían haber estimulado respuestas de anticuerpos al antígeno D. En el plasma, la lectina de unión a manano puede provocar una hemólisis mediada por el complemento cuando se une a los residuos de manosa del anti-D en un glóbulo rojo. Los anticuerpos IgG endógenos que reconocen la galactosa-α1,3-galactosa en la IgG murina podrían unirse al anti-D que expresa este oligosacárido. Recientemente, la IgE endógena anti-galactosa-α1,3-galactosa ha causado reacciones de hipersensibilidad en algunos pacientes a los que se les administró cetuximab (un inmunoterápico contra el cáncer) producido en células SP2/0 de mieloma de ratón. La falta de ácido siálico en muchos mAbs y rAbs anti-D haría que la IgG fuera proinflamatoria al unirse al FcγR.
Los anti-D policlonales pueden ser beneficiosos o letales en diferentes contextos clínicos. La dosis de glóbulos rojos objetivo es un factor importante. La eliminación de pequeños volúmenes de eritrocitos, como en la HFM, es un proceso «silencioso», no inflamatorio y no hemolítico. Sin embargo, si un individuo D-positivo recibe grandes dosis de anti-D, como en el caso de un feto que padece una enfermedad hemolítica RhD o, en raras ocasiones, en pacientes con PTI tratados con anti-D por vía intravenosa, puede producirse una hemólisis grave. En estos casos, ocasionalmente mortales, los síntomas adicionales suelen ser hidropesía (edema) en la HDFN y hemoglobinemia aguda, hemoglobinuria y coagulación intravascular diseminada en los pacientes con PTI . La mayoría de los casos de hemólisis aguda se consideraron debidos a una fuerte hemólisis extravascular (mediada por macrófagos) más que a una hemólisis intravascular . Incluso en ausencia de estos efectos adversos graves, los pacientes con PTI experimentan con frecuencia fiebre y escalofríos tras la infusión de anti-D intravenoso, lo que indica reacciones inflamatorias. Por lo tanto, si los pacientes con PTI fueran tratados con mAbs o rAbs anti-D proinflamatorios en lugar de los actuales anti-D policlonales, podría producirse una compleja serie de reacciones no deseadas y potencialmente peligrosas.
Tras el estudio de fase 1 del TGN1412, algunos aspectos de los ensayos clínicos con anti-D pueden ser útiles para el futuro desarrollo y regulación de los estudios first-in-man de otros inmunoterapéuticos, especialmente los dirigidos a las células de la sangre (Tabla 2). La elección de la dosis inicial es especialmente importante. En todos los trabajos en humanos se utilizaron dosis bajas de glóbulos rojos y de anti-D. En algunos estudios, por ejemplo para el BRAD-3 , se recubrieron glóbulos rojos autólogos (0-5 ml) con anti-D ex vivo y luego se lavaron e inyectaron, minimizando así la dosis de anticuerpo y mitigando la posibilidad de efectos adversos. La eliminación de estos pequeños volúmenes de glóbulos rojos pudo seguirse con precisión cuando se marcaron isotópicamente. Cuando este anticuerpo demostró ser seguro y eficaz, el anti-D y los glóbulos rojos se inyectaron por separado para simular mejor la situación clínica. La evidencia de reacciones inflamatorias con dosis bajas de anti-D y glóbulos rojos debería garantizar la precaución en los estudios de ampliación.
Tabla 2
Diseño de ensayos clínicos de fase 1 de anti-D.
| Pruebas y análisis | Detalles y comentarios | Puntos a tener en cuenta para el desarrollo futuro |
|---|---|---|
| Modelos animales preclínicos | No son adecuados para los antiD ya que el antígeno RhD está restringido a los seres humanos | |
| Bioensayos in vitro | La selección de los mAbs y rAbs anti-D candidatos se realizó utilizando pruebas bien establecidas de la actividad funcional de los FcγR. Se colaboró ampliamente en el desarrollo de estos bioensayos en cuatro talleres internacionales | El análisis de los datos del ensayo sugiere que sería beneficioso desarrollar bioensayos adicionales para estudiar las interacciones de los anticuerpos (o de las células recubiertas de anticuerpos) con los componentes del sistema inmunitario innato tanto para los antiD como para otros fármacos dirigidos al sistema inmunitario |
| Dosis | Las dosis tanto de anti-D como de glóbulos rojos D-positivos fueron bajas tanto en los experimentos clínicos originales realizados hace más de 40 años como en los ensayos recientes. El objetivo era que el anti-D limpiara los glóbulos rojos adquiridos por la FMH | En el estudio de fase 1 del TGN1412, la cantidad de anticuerpo administrada era demasiado alta y todas las células T eran objetivos, lo que provocó la tormenta de citoquinas. La dosis de anticuerpo y antígeno podría minimizarse si se recubriera una muestra de células con el anticuerpo de prueba in vitro, se lavara y se inyectara |
| Tracers | El uso de 51cromo para etiquetar glóbulos rojos diana ex vivo permitió determinar con gran sensibilidad su distribución tisular y hemólisis in vivo | El 51cromo u otros radionúclidos o fluorocromos deberían considerarse en futuros estudios de inmunoterapias tanto para minimizar las dosis como para mejorar la calidad de la información de los ensayos |
| Intervalo de dosificación | En un estudio anti-D realizado antes de que las consideraciones económicas fueran importantes, el intervalo de dosificación entre los sujetos era de 1 semana, lo que daba tiempo a monitorizar a los sujetos en busca de efectos adversos | Los periodos de tiempo entre la administración de las sustancias del ensayo a los voluntarios deberían ser considerablemente más largos que los pocos minutos entre los sujetos del ensayo TGN1412 |
| Sujetos con antígeno negativo | Una ventaja posiblemente única del anti-D es que la determinación precisa de su biodisponibilidad la farmacocinética y la vida media es posible porque los individuos D-negativos carecen del antígeno | |
| La glicosilación de la IgG | Es probable que la glicosilación no humana del anti-D lo haga pro- en lugar de antiinflamatorio. Se observaron efectos biológicos incluso a dosis muy bajas | La glicosilación del TGN1412 puede haber afectado a su actividad in vivo |
| Compartición de información | Combinar los resultados de todos los ensayos clínicos fue más informativo para analizar la actividad inmunológica de los anticuerpos antiD que los estudios individuales por separado | La publicación hace avanzar el conocimiento |
En conclusión, los amplios datos de los estudios en humanos de los mAbs y rAbs anti-D sugieren que su glicosilación podría haber tenido un poderoso efecto en la modulación de sus actividades in vivo. Algunos rAbs aumentaron, en lugar de disminuir, la incidencia de la inmunización contra el D, uno de ellos provocó reacciones hemolíticas perjudiciales y otro tuvo una biodisponibilidad extremadamente baja. Estos efectos no se predijeron a partir de los estudios in vitro realizados. En el futuro, cuando se desarrollen glicoproteínas recombinantes para la terapia humana, deberá tenerse en cuenta la posibilidad de que se produzcan interacciones entre oligosacáridos no humanos y células o moléculas distintas del ligando previsto.