本誌のDayanとWraithによる最近の論説は、TGN1412の悲惨な試験の後に新しい免疫療法を開発するための挑戦を強調しました。 9210>
予防的な抗Dによる胎児水腫またはアカゲザルの溶血性疾患（HDFN）の予防は、抗体を介した免疫抑制の最も成功した臨床応用である。 HDFNは、胎児母体出血（FMH）後、D陰性の女性が胎児D陽性赤血球に免疫された後に発症する。産生されたIgG抗Dは胎盤を越えて移行し、脾臓マクロファージによる胎児赤血球の破壊を引き起こす。 この病気の原因が最初に認識された1940年代には、1％の赤ちゃんがHDFNで生まれ、そのうちの40％が死亡していました。 抗Dは最も一般的に関与している抗体である。 赤血球上のRhDポリペプチドは、RHD遺伝子を持たないD陰性者の細胞には存在しないため、血液型抗原の中で最も免疫原性の高い抗原です。
HDFN は現在ではまれな疾患で、胎児および新生児ケアの改善もありますが、主に予防的IgG抗DによるD陰性感受性女性への一次免疫の予防が原因となっています . 1968年以降、英国と米国で行われた臨床試験の成功により、産後に全女性の10％に抗Dが投与され、その結果、本症の発生率は約95％減少した。 現在では、HDFNによる周産期死亡は年間30人以下となっています。 2002年、National Institute of Health and Clinical Excellence (NICE) は、免疫率をさらに下げるために、産後の予防に加え、すべてのD陰性女性に定期的に抗D予防薬を投与することを推奨しました。 また、抗D抗体の静脈内投与は、D陽性の免疫性血小板減少性紫斑病（ITP）患者の治療にも使用されています。
抗D型免疫グロブリンは、プールされた超免疫ヒト血漿から調製されます。 長年にわたり、ウイルス学的安全性の問題や、最近では変異型クロイツフェルト・ヤコブ病（vCJD）の問題が、代替品の探索を刺激してきました。 英国では、英国のドナーがvCJDの潜在的キャリアであることが懸念されるため、分画用の血漿は現在、北米のドナーから供給されている。 ヒトの血漿から調製されたポリクローナル抗Dを、診断用および臨床用のバイオテクノロジー製品に置き換える目的で、何百もの抗Dモノクローナル（mAb）または組み換え（rAb）抗体が生産されてきた。 マウスはRhD抗原を認識しないため、これらはすべてヒトの免疫グロブリン遺伝子またはB細胞に由来しています。 ヒトB細胞株、チャイニーズハムスター卵巣（CHO）細胞、マウス-ヒトヘテロハイブリドーマ、ラットミエローマなどさまざまな発現系が用いられています。
受動的IgG抗Dの投与によるD免疫抑制のメカニズムはまだ解明されていませんが、D陽性赤血球はマクロファージによりIgG Fc受容体（FcγR）相互作用を経て速やかに脾臓に排出されて免疫原性を失っていることが分かっています。 実際、予防的抗Dが大きなFMHへのD免疫に有効である可能性を確認するために、女性は2-3日後に検査を受けて、胎児細胞が循環から除去されていることを確認する 。 それ以外の場合、同種赤血球はFMHまたは輸血後、長い生存期間を持つ。 同種免疫反応の発現は遅く、抗Dについては通常5～15週間です。 これはおそらく（異物からの）危険信号がないため、老化が進むまで免疫系に認識されず、ホスファチジルセリン受容体を介して貪食が刺激されるためであろう . RhD予防薬がなければ、D陰性の女性の約17％が、D陽性の胎児を妊娠した後に免疫されることになります。 この発生率は意図的に免疫された健常者（最大約85％が反応）よりも低いのですが、これはほとんどの女性の場合、FMHの量が少なすぎて赤血球が免疫原性でないためです 。 9210>
過去20年間に、19の抗D mAbsとrAbsが15のファーストインマン試験でテストされた。 これらの試験は最近見直され、ここに要約されている。 重篤な有害事象は発生していない。 ヒトエフェクター細胞を用いたFcγRを介した貪食および溶血のin vitro生物学的アッセイはよく確立されており，スクリーニングに使用された。 臨床試験では、循環中のD陽性赤血球を少量（1％未満）除去する抗体の能力が評価され、いくつかの研究では、D免疫の阻止能力も評価された。 多くのmAbsとrAbsはポリクローナル抗Dと直接比較された。
抗体の効果には大きな異質性が見られた（表1）。 ヒトBリンパ芽球系細胞株由来の2つのmAb、BRAD-3とBRAD-5は、3～4倍の用量を使用したにもかかわらず、ポリクローナル抗Dとほぼ同様に赤血球クリアランスを迅速に行い、D免疫化を阻止した。 BRAD-3とBRAD-5の血漿中半減期は正常であったが，バイオアベイラビリティはポリクローナル抗Dの半分であった． これらの抗体をCHO細胞でrAbsとして発現させた場合、自己のD陽性赤血球のクリアランスは元のmAbsよりも遅かった。 CHO由来の別の抗D rAbであるMonoRhoを用いた大規模な研究では、赤血球クリアランスは極めて多様で、通常は非常に遅く、抗Dの投与量との相関は認められなかったという残念な結果が得られています . MonoRhoの生物学的利用能が非常に低いことが、この理由の一端を担っているかもしれない。 しかし、D免疫の状態を調べるためにD陽性の赤血球をチャレンジ注射したわけでもないのに、被験者は抗Dを産生することはなかった。 マウス骨髄腫細胞株（マウス-ヒトヘテロハイブリドーマとして）が産生するMAbsも赤血球クリアランスに大きなばらつきを示したが、予想外に、半数以上のレシピエントは急速にD免疫を獲得し、赤血球だけの場合の2倍となった . このように、これらの抗Dsはアジュバント効果を持ち、D陽性の赤血球に対する免疫反応を意図したように妨げるのではなく、むしろ増強するのである。 その後、ラットの骨髄腫細胞から作られた抗D rAbsを使った研究では、ポリクローナル抗Dよりも早く、自己赤血球のクリアランスを極めて迅速に促進することが示された。 FOG-1を発現する細胞株をマウスからラットに変更した場合の効果は顕著で、クリアランスは非常に遅く不完全なものから非常に速いものへと変化しました。 後者の研究では、溶血、肝臓へのクリアランス、発熱反応を伴っていた。 このような反応はポリクローナル抗D抗体による予防の後では起こらない。 予想外なことに、FOG-1 rAbの変異体はin vitroでFcγRとの相互作用を欠き、正常な生存が期待できるにもかかわらず、急速な赤血球クリアランスを媒介した。 これらのIgG抗Dsは、IgG FcγR以外の受容体に結合したに違いない。
Table 1
Summary of data from clinical trials of polyclonal anti-D and anti-D mAbs and rAbs.
| 発現に使用した細胞 | クローン | 赤血球クリアランス率（ゼロ～急速。 – から++++） | RhD免疫に及ぼす影響 | 参考文献 |
|---|---|---|---|---|
| ヒトB | Polyclonal | 迅速である。 被験者間のばらつきが少ない (++++) | Prevented | |
| ヒトBリンパ芽球様細胞株 | BRAD-3, BRAD-5 (mAbs) BRAD-3+BRAD-5 (blend) (mAbs) | 迅速、被験者間でばらつきが少ない。 しかし、ポリクローナル抗Dの3倍の投与量（++） | 90％の被験者で予防可能 | |
| CHO | BRAD-3+BRAD-5 (blend) | ブレンドmAbs BRAD-> (rAbs) より低用量。3+BRAD-5 (++) | （未実施） | |
| CHO | MonoRho（rAb） | 被験者間で非常に変動がある（+から++） | 防止されるかどうか？ | |
| マウス骨髄腫 | G7, G12, G17, G48 (mAbs) | 被験者により大きく異なる (- to ++++) | 増加した, rapid anti-D response | |
| マウス骨髄腫 | AD1+AD3 (mAbs) | 緩やかで可変(+) | 増加した。 急速な抗D反応 | |
| マウス骨髄腫 | FOG-…1（mAb） | やや遅く、変動する（＋から＋＋） | （行っていない） | |
| ラットミエローマ | FOG-1 &変異体（rAbs） | 極めて速い。 FcγR結合がない場合でも（++++） | （行っていない） | |
| ラット骨髄腫 | R297 (rAb) | （行っていない） |
すべての臨床試験はばらつきがあった。 直接比較することは困難である。
クリアランススタディーはD陽性（自己）またはD陰性の被験者で行われ、抗Dの前または後に赤血球が注入されました。 赤血球の量は0～5～15mlであった。 抗Dの投与量は様々で（100～1800μg）、抗Dはプレコートされた細胞上に投与されるか、静脈内または体内に注射された。クリアランス試験は1時間から7日間行われ、サンプル収集のタイミングは様々であった。 1人から94人の被験者が登録された。 いくつかの研究では、クリアランス率が計算されました。
抗D反応の検出は、2週間または4週間ごとに採取したサンプル、または3ヶ月または6ヶ月の単一サンプルで決定されました。 また、齧歯類の細胞株から得られたものは、好ましくない免疫反応を引き起こしたものさえあった。 in vivoでの反応は主に抗体を産生する細胞株の種類によって決まり、タンパク質の配列によって決まるものではありませんでした。 このような予期せぬ有害な反応の原因は、動物細胞から産生されたIgG抗Dが自然免疫系の構成要素と相互作用したためであると考えられる。 最も可能性の高い説明は、オリゴ糖組成の変化である。
IgGのグリコシル化のタイプは、それが生産される細胞によって異なり、種特異的である。 ネズミのIgG上のN-グリコリルノイラミン酸や高マンノースオリゴ糖などの構造は、自然免疫パターン認識受容体（PRR）により異物として認識され、炎症反応が起こる可能性がある。 PRRには細胞性のアシアロ糖タンパク質とマンノース受容体が含まれる。 D陽性赤血球の抗Dと結合した後、D抗原に対する抗体反応を刺激している可能性がある。 血漿中では、マンナン結合レクチンが赤血球上の抗Dのマンノース残基と結合すると、補体を介した溶血を引き起こす可能性がある。 マウスIgG上のガラクトース-α1,3-ガラクトースを認識する内在性IgG抗体は、このオリゴ糖を発現する抗Dに結合する可能性がある。 最近、マウスの骨髄腫SP2/0細胞で産生されたセツキシマブ（癌免疫療法薬）を投与された患者の一部に内因性IgE抗ガラクトース-α1,3-ガラクトースによる過敏症反応が見られた。 多くの抗D抗体およびrAbsにシアル酸がないため、FcγRと結合するとIgGは炎症性物質になります。
ポリクローナル抗Dは、さまざまな臨床環境で有益にも致死的にもなり得ます。 対象となる赤血球の用量が大きな要因である。 FMHのように少量の赤血球の除去は、「静かな」、非炎症性、非溶血性のプロセスである。 しかし、RhD溶血性疾患を患う胎児や、まれに抗D抗体を静脈内投与されたITP患者のように、D陽性の人が大量の抗D抗体を投与されると、重度の溶血を起こすことがあります。 これらの時に致命的となる症例では、通常、HDFNでは水腫、ITPでは急性血色素尿、播種性血管内凝固症候群が追加症状として認められます。 急性溶血のほとんどは、血管内溶血ではなく、強固な血管外溶血（マクロファージを介した溶血）によるものと考えられている。 このような重篤な有害事象がない場合でも、ITP患者は抗Ds静注後に炎症反応を示す発熱や悪寒を経験することが少なくない。 TGN1412の第1相試験の後、抗Dの臨床試験のいくつかの側面は、他の免疫治療薬、特に血液中の細胞を標的とする治療薬のファーストインマン試験の将来の開発と規制に役立つと思われます（表2）。 開始用量の選択は特に重要である。 すべてのヒト試験で、低用量の赤血球と抗Dが使用された。 BRAD-3 などの研究では、自己の赤血球（0-5ml）に生体外で抗Dをコーティングし、その後洗浄して注射した。 このように少量の赤血球を同位体標識すれば、その排出を正確に追跡することができる。 この抗体の安全性と有効性が確認された後、抗Dと赤血球を別々に注射することで、より臨床に近い状況を再現することができるようになった。
表2
抗Dの第1相臨床試験のデザイン
抗Dと赤血球の低用量による炎症反応の証拠は、スケールアップ試験において注意を要する。
| 試験と解析 | 詳細とコメント | 今後の開発のポイント | ||||||
|---|---|---|---|---|---|---|---|---|
| 前臨床動物モデル | 抗D型には不向きであった | 前臨床動物モデル | 前臨床モデル | 抗D型には不向きの | 前臨床動物モデル | |||
| In vitro バイオアッセイ | 抗D mAbsおよびrAbs候補の選択は、FcγR機能活性の確立されたテストを用いて行われました。 これらのバイオアッセイの開発には、4つの国際ワークショップで大規模な共同作業が行われた | 試験データの分析から、抗体（または抗体でコーティングされた細胞）と自然免疫系の構成要素の相互作用を研究するための追加のバイオアッセイの開発が有益であることが示唆され、両方の抗がん剤について検討した。Dと免疫系を標的とする他の薬物について | ||||||
| 投与量 | 40年以上前に行われた元の臨床実験でも最近の試験でも、抗Dと標的D陽性赤血球の投与量は少なかった。 FMHが獲得した赤血球を抗Dでクリアにするのが目的 | TGN1412の第1相試験では、抗体の投与量があまりにも多く、すべてのT細胞がターゲットとなり、サイトカインストームにつながった。 このため、試験管内で細胞サンプルに試験用抗体を塗布し、洗浄して注射すれば、抗体と抗原の投与量を最小限に抑えることができた | ||||||
| トレーサー | 51クロムを用いて標的赤血球を生体外でラベル化すると、その生存率を高感度に判定することができるようになった。 51Chromium or other radionuclides or fluorochromes should be considered in future studies of immunotherapeutics to minimize doses and enhance quality of information from trials | |||||||
| Dosing interval | The anti-D study conducted before the economic consideres important.In the study of the anti-Dies in vivo…, 被験者間の投与間隔は1週間で、被験者の副作用をモニターする時間を確保した | ボランティアに治験薬を投与する間隔は、TGN1412試験の被験者間の数分よりかなり長くすべきである | ||||||
| 抗原陰性被験者 | おそらく抗Dの独自の利点は、バイオアベイラビリティを正確に測定できることです。 D陰性者は抗原を持たないため、薬物動態と半減期が可能である | |||||||
| IgGのグリコシル化 | 抗Dのヒト以外のグリコシル化は抗炎症というよりプロ化した可能性がある。 | TGN1412の糖化は生体内での活性に影響を与えた可能性がある | ||||||
| 情報共有 | すべての臨床試験の結果を組み合わせることで、抗D型抗体の免疫活性を分析する上でより有益であった。D抗体は個々の研究だけよりも | Publication advances knowledge |
In conclusion, 抗D型mAbsおよびrAbsのヒトでの研究による広範なデータは、そのグリコシレーションがin vivoでの活性を調節する強力な効果を持っていた可能性を示唆している。 あるrAbsはD免疫の発生を減少させるどころか増加させ、あるものは有害な溶血反応を引き起こし、あるものはバイオアベイラビリティが極端に低いものであった。 これらの影響は、実施されたin vitro試験からは予測されなかった。 今後、ヒト治療用のリコンビナント糖タンパク質を開発する際には、ヒト以外のオリゴ糖と意図したリガンド以外の細胞や分子との相互作用が起こる可能性を考慮する必要がある
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