Neurogenetic analysis of childhood disintegrative disorder

Study subjects

CDDコホートの臨床的特徴および各研究様式による検査対象者数は表1に示すとおりである。 性比は男性3.25人/女性1人で，ASDで報告されているのと同様である。 発症時年齢は平均46カ月、中央値40カ月で、28カ月から84カ月の範囲であった。 被験者の70％が不安と恐怖の前兆を経験した。 30％の被験者が複数回の退行期を経験した。 最初の退行エピソードの長さは、2ヶ月から7年近くに及ぶ被験者がいた。 ほとんどの被験者が重度から深度のIDを持ち、IQの平均値と中央値はそれぞれ30と26で、範囲は8から74であった。 全員に言語能力の低下、社会性または適応行動の喪失、遊びの技能の喪失がみられた。 また、65％の人が腸や膀胱のコントロールを失い、同じ割合で運動能力も失われていました。 CDDはほとんど散発的であると報告されているが、我々の被験者の中には、ASDまたは自閉症的特徴を持つ肉親を持つ者が数名おり、その中には2組の一卵性双生児が含まれている。

Genetics

ほとんどのCDD症例で見られる希少性，重症度，散発的な伝播から，影響の大きい稀な変異が病因に寄与していると仮定した。 実際，ASDに希少バリアントが寄与していることを示す証拠は豊富にある。 表2に示すように、1人のプロバンドを除くすべてのプロバンドで1つ以上の希少バリアントが見つかり、それらは罹患していない兄弟姉妹のコントロールでは共有されていなかった（追加ファイル2: 表S2）。 また、de novo variantsの影響を受ける遺伝子の変異を追加で検索して、被験者の複合ヘテロ接合型バリアントを探したが、見つからなかった。 すべての高確率（ベイズ品質スコア≧50）de novo variantsの割合は、0.80/proband exomeおよび0.92/sibling exome（追加ファイル2：表S3）で、これは神経発達障害に関する最近の11件のWES研究から計算した全体の割合と同様であった。 1.00/プロバンドエクソーム、n = 2358; 0.82/コントロールエクソーム、n = 731 。 非同義de novo、ホモ接合、ヘミ接合バリアントの割合（Additional file 2: Table S3）、影響を受けた脳発現遺伝子の割合、バリアント位置の系統的P値（PhyloP）保存スコア、残留変動不寛容スコア（RVIS）、多型表現型v2（PolyPhen-2）スコアにプロバンドときょうだい間で大きな違いはなかった（Additional file 2: Table S2）。

我々はプロバンドにデノボジェニックCNVを1つ見つけた（表2、 0.07/proband） これは以前にASDについて報告した割合と同じで、同胞には1つもなく、同胞はCDDプロバンドに特異的であった（表2）。 このCNVは神経変性に関与するミトコンドリアタンパク質複合体の構成要素をコードするOGDHLの3′UTRの2kbヘテロ接合性欠失であった。 1つの遺伝子、SUPT20HL2、2つの遺伝子ファミリー、USPとBBSは、複数のCDDプロバンドに影響を受けている。 SUPT20HL2は、UniProtKBデータベース(http://www.uniprot.org/)によると、転写因子をコードしているが偽遺伝子の可能性がある2つのhemizygous missense variantsが同定された。 USP（ユビキチン特異的ペプチダーゼ）遺伝子ファミリーの3つのメンバーがCDDのプロブジェクトで影響を受けている。 USP9X（ヘミ接合型ミスセンス）、USP9Y（父性遺伝型ノンセンス）、USP26（ヘミ接合型ミスセンス）である。 これらは、タンパク質の分解を阻止する脱ユビキチン化酵素をコードしている。 毛細管形成に関与するバルデ・ビーデル症候群（BBS）遺伝子ファミリーの2つのメンバーには、CDDプロバンドにおいてde novoのミスセンス変異がある。 BBS5とBBS9である。 CDD対象者に同定された特定のタンパク質変化バリアントはまれであり，以前に疾患と関連したことはなかったが，文献を検討したところ，CDD候補遺伝子と他の神経疾患と関連する可能性のある遺伝子との間に重複が見られた（表2）

CDDプロバンドに明らかに劇症的なバリアントはなかった． 潜在的な病原性のあるバリアントを同定するために、我々はいくつかの要因を組み合わせて検討した。 (1) 脳内発現が陽性、(2) PhyloP score ≥ 1.30 (P = 0.05 for conservation), (3) RVISが陰性 (gene intolerant of variation), (4) PolyPhen-2 classification of probably damaging missense (or n/a due to a variant other than missense) である。 47個のCDD候補遺伝子のうち、14個がこれらの基準をすべて満たした。 NRK、TBC1D8B、TRRAP、NAV2、OGDHL、ZNF236、PRKCSH、MTMR8、BCOR、SRPK3、USP9Y、KIAA2018、CXorf57、ALG13（表2）であった。 このリストをさらに洗練させるために、Exome Aggregation Consortium（http://exac.broadinstitute.org/）のシークエンスデータを検査したところ、以下のことが明らかになった。 (NAV2、MTMR8、ALG13を除くすべての遺伝子の変異体は、新規またはデータセット中にせいぜい1度しか見つかっていない。 TRRAP (transformation/transcription domain-associated protein)は、男性のCDDプロバンドにおいてde novoミスセンス変異により影響を受け、ヒストンアセチルトランスフェラーゼ複合体の構成要素をコードし、DNA転写と修復に関与している。 ヒストンアセチルトランスフェラーゼ複合体の構成要素をコードし、DNAの転写と修復に関与する。OMIM障害との関連はないが、de novo変異体は他の神経疾患において同定されている（表2）。 ZNF236 (Zinc Finger Protein 236)も男性のプロバンドにおけるde novoのミスセンス変異によって影響を受けている；転写制御に関与していると思われるが（UniProtKB）、既知の障害との関連はない。 BCOR (BCL6 Corepressor)は、CDDの男性プロブランドのヘミジグースミスセンスバリアントによって影響を受けている；それは転写コアプレッサーをコードしている。 この疾患は、IDの特徴を持つことがありますが、それ以外はCDDプローバンドの特徴ではなく、通常、女性の切断変異によって引き起こされる症候群性小眼球症と関連しています。 KIAA2018は、男性のCDDプローバントにおけるホモ接合性の1アミノ酸欠失により影響を受ける。それはまた、USF3（上流転写因子3）としても知られている。 OMIM疾患との関連はないが、de novo変異は他の神経疾患において同定されている（表2）。 注目すべきは、これらの上位候補遺伝子のすべてが、ASD関連遺伝子の多くを特徴づける転写の役割を担っているか、あるいは転写に関与している可能性があることである。

ヒトBrainSpanエクソンアレイ・トランスクリプトームデータセットを用いて、胚期から成体後期までのすべての脳領域について、CDD候補遺伝子の発現レベルの中央値をグループとしてプロットした（n = 40 gene represented once in the core probe set, Additional file 2: Table S4）。 図1の発現プロファイルに示すように、CDD候補遺伝子は、生涯を通じて新皮質領域と比較して非新皮質領域でより高発現している（Additional file 2: Table S5）。 さらに、我々のCDDコホートの発症年齢を含む10期（1-6歳）と11期（6-12歳）において、AMY、STR、HIPでの発現量が増加していることがわかった。 1

この観察を踏まえ、CDD プロバンドにおける非同義および同義バリアントの影響を受ける遺伝子について非新皮質領域と新皮質領域の発現レベルの中央値の差異を比較検討した。 Simons Simplex Collection（SSC）から、性別、評価時年齢、IQ、自閉症症状の重症度をマッチさせた、回帰のあるなしにかかわらず、ASDプロバンドとその影響を受けていない兄弟姉妹（Additional file 1参照。 コホート選択の詳細については、補足情報を参照のこと）。 CDD候補遺伝子の発現プロファイルは、他の遺伝子セットとは定性的に異なる。ただし、NAV2という1つの遺伝子しか共通していないにもかかわらず、回帰を伴うSSCプロバンドの非同義バリアントの影響を受ける遺伝子のプロファイルと類似している（図2、追加ファイル2：表S4およびS6）。 非皮質の発現量から新皮質を引いた発現量の差は、胎児中期に最大正値に達する。 CDD候補遺伝子の場合、これは第6期に起こる。BrainSpanデータセットからランダムに選んだ40の遺伝子について10万回の順列検定を行い、この発現差の有意性を確認した（P = 0.0022）。 さらに、SSCのプロバンドや同胞の非同義、同義、LGDバリアント、最近の3つの大規模なWESおよびCNV研究によってASDと最も有意に関連付けられた遺伝子、BrainSpanデータセットのすべての遺伝子など、他のいくつかの遺伝子セットにも解析を拡張した。 CDDプロバンドおよび回帰を伴うSSCプロバンドにおける非同義バリアントの影響を受ける遺伝子の発現プロファイルは、これらの他のセットとも定性的に異なる（追加ファイル1：図S1、追加ファイル2：表S4およびS6）

また、CDDの候補遺伝子同士が共発現しているかどうかについても検討した。 40個の候補遺伝子のうち、11個はすべての脳領域と時間帯で少なくとも1個の他の候補遺伝子と共発現しており、ピアソン相関係数r≧0.7であった（図3、追加ファイル2: 表S7）。 このような接続は23個あり、平均相関は2.09個/遺伝子、平均係数は0.779であった。 BrainSpanデータセットからランダムに選んだ40個の遺伝子について10万回の置換検定を行った結果、少なくとも2.09相関/遺伝子を持つ11個の遺伝子を観察することは有意であり（P = 0.036）、少なくとも0.779の平均相関係数を持つ11個の遺伝子を観察することも同様（P = 0.019）であることが判明した。 また、両方の閾値を満たすことも有意である(P = 0.0059)。 共発現している11個のCDD候補遺伝子は、BrainSpanのデータセット通り全て正の脳内発現を有しているので、BrainSpanからランダムに選んだ40個の脳内発現遺伝子についても10万回の繰り返しによる並べ替え検定を実施した。 その結果、少なくとも2.09相関/遺伝子を持つ11遺伝子を観測しても有意ではない（P = 0.066）が、少なくとも0.779の平均相関係数を持つ11遺伝子を観測すれば、両方の閾値を満たす場合と同様に有意（P = 0.022）となった（P = 0.011 ）。 共発現している11個のCDD候補遺伝子のセットと共発現していない残りの29個のセットを比較すると、脳内発現遺伝子の割合、PhyloPスコア、PolyPhen-2スコアに有意差はなかったが、共発現遺伝子は変動に対して有意により不寛容であった（平均RVIS -1.42 対 -0.15, t(35) = -2.91, P = 0.0062, 独立 t テスト, 無条件両側)。 CDD候補遺伝子の全セット、および11の共発現遺伝子のサブセットについてDatabase for Annotation, Visualization and Integrated Discovery v6.8（https://david.ncifcrf.gov/）を用いた遺伝子オントロジーエンリッチメント解析では、P値のベンジャミニ・ホーチバーグ補正後にGO用語の著しい濃縮を確認できなかった

Neural systems

ASDにおける社会的障害の普遍性を考えると、顔の知覚を含む社会知覚に関わる脳システムの機能障害は、ASD研究の主要な焦点であると言える。 顔や家の視覚刺激は，社会情動的な情報処理（怖い顔）と非社会情動的な情報処理（家）に関わる系を確実に活性化・解離させることが分かっている。 我々は4つのコホートを研究した。 CDD (n = 7), LFASD (n = 7), HFASD (n = 14), およびTD (n = 19). LFASDはCDDよりも数が多いとはいえ、低機能の被験者で高品質の神経画像（およびアイトラッキング）データを得るのは困難であるため、サンプルサイズは制限された。 そのため，ASDや顕著なIDを持つ人の非鎮静fMRIデータの発表は，我々の知る限り初めてである。

4つのコホート間で，性別，年齢，頭蓋内容積，スキャナでの頭部の動きには有意差はなかった。 また，CDD群とLFASD群はIQや自閉症重症度による有意差もなく，HFASD群とTD群はIQによる有意差もなかった（追加ファイル2：表S8，S9）。 まず、19人のTD被験者のうち12人の発見サンプルを用いて全脳解析を行い、家屋に対する顔の処理に関与する関心領域の独立した局在を明らかにした。 図4aは、TD被験者が顔>家の有意な活性化を示した腹外側後頭側頭葉の領域を示している（Additional file 2: Table S10）。 これらの領域は、牙状顔領域や後頭部顔領域を含む後頭側頭葉の顔感受性ネットワークのよく知られたノードの予想される位置を含んでいた。 図4bと追加ファイル2：表S11に示すように、4群それぞれの平均信号変化率（顔＜2616＞家）を抽出すると、TD：検証群とHFASD群、LFASD群とCDD群の比較では、これらの独立に定義した関心領域において顔対家への反応に群差がないことが示された . CDD群における顔>家反応はゼロより有意に大きくはなく、後頭側頭顔感受性のネットワーク全体として顔に対する感受性の欠如が示唆された。 また、TDに比べHFASDでは右側中窩洞が顔に対して低活性であるという確立された知見がある。 私たちのコホートではこの所見を再現することができた。 しかし、TDとCDDの顔>家の活動を比較すると、LFASD群とTD群の比較と同様に、有意な差は見られなかった（追加ファイル1：図S2、追加ファイル2：表S12）。

CDDでは後頭側頭葉腹側皮質の顔に対する感度が低い可能性を考慮して、次にCDD対象者の全脳評価を行い、これらの人たちの顔知覚の神経解剖学的基質を局限することを試みた。 図5aに示すように、CDD患者は中前頭回、前頭前野、尾状核（線条体）、視床、海馬、小脳で顔>家の活動を示した（追加ファイル2: 表S13）。 これらは、CDD候補遺伝子の発現量が最も多いと判定された脳領域と重なる（図1）。 図5bおよびAdditional file 2: Table S14に示すように、これらの関心領域の平均シグナル変化率（面>家）を比較すると、CDDとHFASDの間に有意差があったが、CDDとLFASDの間には有意差はなかった。 図5

Eye-gaze behavior

我々は、4つのコホートの社会的表現型を定量化するために、感情顔を見るときのアイトラッキングデータを収集した。 追加ファイル2: 表S15およびS16に示すように、各群は性別、年齢、および画像上の総固定時間による有意な差はなかった。 また、CDD群とLFASD群はIQと自閉症重症度による有意な差はなく、HFASD群とTD群はIQによる有意な差はない。 Fig.6に示すように、HFASDではTDに比べて目への固視が減少し、口への固視が増加するという先行知見を再現している。 しかし、LFASDの被験者が目を見る時間の割合はHFASD群と有意な差はなかったが、CDDの被験者はHFASD群に比べ有意に目を固定する時間が長い。 また、CDDとLFASDでは、視線に費やされる時間に有意な差はなかった。 fMRIの結果（図5b）と同様に、LFASD群はHFASD群とCDD群の中間的な表現型（眼球口比率、追加ファイル2：表S16）を示した。

である。