Abstract
Arnica montana 6cHによるラットの急性炎症動態の個別変調の効果を評価した。 Wistar系成熟雄ラットの足蹠に1％カラギーナンを接種し，刺激物接種後30～180分の間に1回15分間，Arnica montana 6cH，dexamethasone（4.0mg/kg；陽性対照）または5％水酸化アルコール溶液（陰性対照）で処置した。 CD3（Tリンパ球）、CD45RA（Bリンパ球）、CD18（β2インテグリン）、CD163（ED2タンパク質）、CD54（ICAM-1）、MAC 387（単球とマクロファージ）について炎症陽性細胞のパネルを得るため、病理組織学的および免疫組織化学的処置を施した。 データの統計的処理には、各グループの動物を、自発的な早発性浮腫または遅発性浮腫を呈する2つのサブグループに事後的に分類することが含まれた。 早発性水腫を呈した動物は、血行動態の変化との関連でArnica montana 6cHに対する責任が小さかった。 その代わりに、遅い水腫を示したラットは、より弱い水腫（）、低いマスト細胞の脱顆粒の割合（）、およびリンパ管の直径の増加（）を示した。 これらのデータは、Arnica montana 6cHによる炎症性血管事象の個別的かつ定性的な調整を示唆している。 はじめに
ホメオパシー薬の効果について最も議論されている論争の一つは、患者と薬物の病原体の間の完全な症状の類似性を識別する必要性、すなわちsimilia原理に従って個々の処方を行う必要性である。 この特徴は、実験的に証明することが技術的に難しいため、この分野の科学研究において最も困難な課題の一つとなっている。 実際、この分野に関する実験的研究は、文献上ほとんど見あたらない。 したがって、この特殊性を実験的に実証し、そのメカニズムを理解することは、臨床試験でしばしば見られる、ホメオパシーの効果に関する慢性的な論争を解決するための有用なツールとなり得るのです。 最近、癌細胞に対する細胞毒性効果を誘発するホメオパシーレメディの大きさにおいて、制御および適応細胞メカニズムの重要性が、エレガントなin vitro研究によって証明されました
1997年から2008年にかけて、我々は、動物モデルを用いて、ホメオパシーのアルニカ・モンタナ、特にアルニカ・モンタナ6cHの生物学的作用について段階的研究を展開してきました . つまり、これらの研究で得られた結果から、アルニカモンターナ6cHは、リンパ水腫の吸収と局所血流を増加させ、多形核細胞の移動の配列を促進するので、ラットの急性炎症過程を調節することができることがわかりました。 これらの実験はすべて.5988>
アルニカ・モンタナは、東・中央ヨーロッパの丘陵地帯に生育するコンポジット科に属する植物である。 葉、花、根にアルコール、タンニン、フラボノイド、セスキルテルペンラクトン、特にヘレナリンなどいくつかの活性化合物が確認されている。 ヘレナリンの主な作用は、コルチコイドステロイドと同様に、転写因子NFκβを阻害することである。 偶発的に摂取した場合、血管拡張、血液のうっ滞、出血、水腫、痛みなどを引き起こすことがある。 これらの作用は、Arnica montana materia medicaに記載されている主なトピックである . そのため、外傷痛や水腫の吸収は、アルニカモンタナのホメオパシー製剤の臨床的・実験的使用の主な適応症となっています。 最近、アルニカを高濃度に希釈した他の用途が提案されている。例えば、植物の成長を改善するために、アルニカの力価3、6、12cHを農学的に使用することが提案されている
本研究の目的は、2つの仮説を確認することであった。 (a)急性炎症における血管および細胞イベントのアルニカによる推定的調節。炎症部位に存在する好中球、単球、TおよびBリンパ球の割合、および炎症結合組織における接着分子の発現強度に着目し、免疫組織化学および組織形態計測の技術を使用すること。
2 材料と方法
2.1. 動物
体重250～300gのWistar成体雄ラットを用いた。 ラットは従来の実験用ポリプロピレン製ケージ(1ケージあたり5〜7匹)で、温度(25±3℃)と光周期(午前6時から午後6時まで点灯)を制御しながら飼育した。 水と餌はアドリビタムを提供した。 実験開始前に、動物を無作為に秤量し、分離し、20匹ずつの3つのグループに識別した。 急性炎症の誘発
急性炎症過程は、あらかじめマイクロメーター（MYTUTOYO）で厚さを測定した足蹠に、滅菌生理食塩水で希釈した1％カッパカラギーナン（SIGMA）を皮下接種することにより誘発した。
30分および180分後、時間の関数で治療前および後の水腫進展を評価するために、新たに測定が行われた。 したがって、最初の30分間は自発的な水腫形成を測定し、残りの150分間は、30分間の測定後に治療を行ったので、薬物の効果を測定した。 180分後、動物を深部麻酔下で頸部牽引により安楽死させ、足蹠を採取し、緩衝10％ホルムアルデヒドで最大24時間固定した後、パラフィン包埋、ヘマトキシリン・エオジン、トルイジンブルー染色などの通常の組織学的手法により処理した。 同じパラフィンブロックを免疫組織化学的処置の実施に使用した。 各足蹠について、1枚のスライドが行われた
2.3. グループと処置
ラットの各グループは、表1に従って、特定の物質で処置された。 同じ供給者から得たアルニカ・モンタナ6cH（実験）および未発泡5％ハイドロアルコール溶液（陰性対照）で処理したラットは、すべての処理および測定がブラインドで行われるように、コードによって識別した。 これらのコードは、研究に参加していない実験技師によって作成され、統計解析まで封印されたシートに保管され、その時点で明らかになった。
Table 1
群及び治療法について。 デキサメタゾン処理ラット（陽性対照）は、使用した製剤の物理的特性から、公開されました；それはホメオパシーのものとは全く異なり、したがって、容易に認識することができたのです。 処理と試料の顕微鏡分析は、独立した2人の担当者が行い、常に盲検化した。 抗炎症効果を得るために使用したデキサメタゾンの総量は、先に定義した基準に従って、4mg/kgであった。 この分画プロトコルは、通常のホメオパシーの急性炎症治療の臨床状態を再現するように設計されており、我々のグループが行った以前の研究でも使用されたものである。 デキサメタゾンは、その作用メカニズムがアルニカモンタナの主な活性原理であるヘレナリンのメカニズムに類似しているため、陽性対照群として選択された。 市販のアルニカモンタナ6cHは、ブラジル国立衛生監視機関（ANVISA）により認定された薬局（サンパウロのFarmácia Sensitiva）で5％アルコール溶液として準備されました。 調製に使用した技術は、Brazilian Homeopathic Pharmacopea, 2nd Edition, 1997に従ったものである 2.4. データ分析前処理期間（0分から30分まで）に得られた水腫強度の最初のプロットの後、データは、各グループについて、自発的に低い水腫強度を示した10匹（50％）と高い水腫強度を示した10匹（50％）を分けることができるように、Excel 2003ソフトウェアを使用して三日月順序で分類された。 こうして、各実験群に10匹の2つのサブグループが形成され、炎症動態パターンに応じて2つの異なるラット亜集団が特徴づけられた(Table 2)。 実験計画全体をフローチャートで説明する（図7）。
表2
最初の水腫測定（30分）の後に分類したグループおよびサブグループのスケジュール。
カラギーナンによる水腫の古典的な曲線は接種後6時間までであるため、両方の時間（30分と180分）の選択は、その既知のプラトーに基づいて行われた。 さらに、アルニカ6cHのカラギーナン誘発性水腫への効果に関する先行研究では、この時間以降には効果がないことが示されている。 カラギーナンの注入後の炎症過程の評価の動態は、70年代に開発された古典的な実験モデルである。 したがって、この場合に使用する信頼できる基準である。 データ（図1（a）および1（b））をプロットすると、両方の動態パターンは容易に識別できるようになった。 (a)最初の前処理30分間にあまり強い浮腫を示さなかった動物は、30分から180分の間にピークを示した(後期浮腫と呼ぶ)、(b)最初の30分間に強い浮腫を示したものは、この期間の後に減少した(初期浮腫と呼ぶ)。  (a)  (b)  (c)  (d) (a) (b) (c) (d) 図1
異なるグループとサブグループにおける浮腫（mm）． (a)早期浮腫サブグループにおける時間の関数としての浮腫の進展；(b)後期浮腫サブグループにおける時間の関数としての浮腫の進展；(c)早期浮腫サブグループの実験終了時の浮腫の強度；(d)後期浮腫サブグループの実験終了時の浮腫の強度。 コントロールに対する、ANOVA、タッキークランメル、。 値は平均±標準偏差を表す。
すべての結果は、6つのサブグループ間で比較された。 この事後的な選択は、マテリア・メディカに記載されているアルニカ・モンタナの症状の中で、水腫の寛解の速さが最も知られているものであることから、シミリアの原則に従って、アルニカ効果における個人の特質の役割を確認するために行われた。 免疫組織化学的分析 すべてのスライドを1 : 1アルコール-エーテル溶液で5分間洗浄した後、柔らかい紙で乾燥し、1 : 10ポリ-L-リジン（SIGMA）で処理した。 その後、5ミクロンのパラフィン包埋組織切片を40℃の組織浴で表面に移した。 次に、絶対キシロールで2分間、絶対アルコールで3分間、2回のバス処理を行い、スライスを脱パラフィンした。 免疫組織化学的処置のために、抗原賦活のための第一段階は、試料の熱処理を用いて行われた。 pH=6.0、0.5% tween20（DAKO）を含むクエン酸バッファーバス（SIGMA）にスライドを入れ、80℃（PANASONIC）の電気ポットで20分加熱した。 その後、スライドをPBS, pH = 7.2 (SIGMA)で6分間洗浄し、柔らかい吸収紙で乾燥させ、適切なペン (Pap-pen, AbCam) を用いて組織サンプルを区切った。 内因性パーオキシダーゼ活性は、メタノール (ISOFAR) で希釈した 3% H2O2 液で組織を室温で15分間インキュベートしてブロッキングした。 その後、PBS（SIGMA）で6分間洗浄し、非特異的なタンパク質結合部位をブロックするために、25℃で20分間、2.5％の馬正常血清（VECTOR）で処理した。 この工程の直後に、組織を一次抗体で処理し（表3の希釈と仕様を参照）、湿度の高い室内で4℃、一晩静置した。 一次抗体の希釈はすべて1％ウシ血清アルブミン（BSA）中で行った。
Table 3
免疫組織化学に使用したマーカー。
翌日、切り口をPBS（シグマ）で6分間洗浄し、ポリマーペルオキシダーゼ標識二次抗体（IMPRESS UNIVERSAL、VECTOR）で、25℃で30分間処理した。 PBSで新たに洗浄（6分）した後、DAB（DAKO）に3秒間暴露し、水道水でもう一度洗浄し、Harris hematoxylinで染色（01分）し、マウントした 2.6. 組織形態計測マスト細胞の脱顆粒率については、トルイジンブルー法で染色したスライド1枚あたり200個の細胞を、連続したフィールドを用いて、脱顆粒したものとそうでないものとを区別してカウントした。 リンパ管径の評価は、200倍の対物レンズを用い、無作為に選んだ5フィールドを評価した。 各フィールドの顕微鏡写真を作成し（CANNON）、デジタル画像解析システム（Image Tool 3.0）によりフィールドあたりのリンパ管面積の割合を決定した。 リンパ管の直径は、これまでの観察によると、リンパ水腫の吸収を評価するための良いパラメータと考えることができる 。 抗CD45RA、CD3、CD18、CD163、MAC 387マーカーについては、無作為に選んだ10個の顕微鏡視野を、浸漬対物レンズを用いて1スライドにつき観察した（倍率1000倍）。 これらはパッドの皮下血管結合組織のほぼすべてを含み、フィールドあたりの陽性細胞数を記録した。 Anti-MAC 387の場合、単核陽性細胞のみを考慮した。 ヘマトキシリン・エオジン染色したスライドを用いて、1フィールドあたりのPMN細胞数を数えた。 この場合、細胞の認識は形態学的基準のみによってなされた。 CD163の発現はマクロファージの成熟度に比例するため、これらの結果はCD163/MAC 387単核陽性細胞/フィールドの比率で表した。 抗CD54については、内皮細胞表面の陽性強度を1〜4のスコアシステムで評価した。 スライドごとに無作為に選んだ5フィールドを浸漬対物レンズ（1000倍）で評価し、解析における主観的解釈を避けるため、独立した2人のオブザーバーがブラインド方式でスコアをつけた。 各スライドの最終スコアは、部分スコアの合計に等しかった。 スコアの採点基準は表4の通りである。
表4
内皮細胞マーキングの異なるパターンのスコア帰属の基準
2.7. 統計解析Bartlett testは、まず大多数のデータポイントのガウス分布を決定するために採用された。 次に、Bartlettの結果に従って、ANOVA/Tuckey-KrammerまたはKruskall-Wallis/Dunnが実行された。 マスト細胞の脱顆粒の評価は、代わりに、検定によって評価された。 の値を有意とした。 すべての統計分析は、INSTAT 3ソフトウェアを使用して行われた。 浮腫に関連して、追加のグループ内統計分析も行われ、30分後のサブグループ間の浮腫強度（自然浮腫）の比較により有意差（タッキー-クラマー、）が示され、提案した実験計画が検証された。 Bioethical Criteria プロトコルは、São Paulo State law no.11.977/05 (Animal protection code of São Paulo State, Brazil) に基づき、Universidade Paulistaの生命倫理委員会によって承認された（プロトコル011-07）。 この手順は、実験その他の科学的目的のために使用される脊椎動物の保護に関する欧州条約およびその付録に従っている。 結果 炎症を起こした足蹠の組織学的側面は、典型的な初期の急性炎症の古典的な枠組みを示した：水腫と細胞浸潤、2/3のPMN細胞および1/3の単核細胞に相当するもの。 しかし、グループ内の統計処理を考慮すると、時間の経過とともに異なるパターンの炎症過程の存在が確認された（表5および表6）。 したがって、Arnica montana 6cHの効果を分析する前に、これらのパターンを体系化し、分類する必要性があった。
Table 5
1% カラギーナンを足蹠に注入後0分から30分の間に水腫の自然ピークを生じたラット（初期水腫サブグループ）で得られた結果の一般的な見方。 *Kruskal-Wallis、 ; #、コントロールとの関係で。 ##ANOVA, Tuckey-Krammer、後期水腫サブグループとの関係において（表6）。
表6
1％カラギーナンを足蹠に注入後30分から180分の間に水腫の自然ピークを生じたラットで得られた結果の概観（晩発水腫のサブグループ）。 *それによると、アルニカモンターナ6cHの有意な抗浮腫効果は、カラギーナンを足蹠に注入してから30分から180分の間に浮腫のピークを示したラットのサブグループ（late subgroupと呼ぶ）においてのみ見られた（ANOVA、）（図1）。 また、トルイジンブルーで染色したスライドの組織形態学的解析の結果、late subgroupでは、肥満細胞の脱顆粒（、）が少なく、リンパ管の直径平均が大きいことも明らかになった（Kruskal-Wallis、）。 その代わりに、早期サブグループ（30分前に浮腫のピーク）では、内皮細胞によるCD54発現のスコアの増加（Kruskal-Wallis）と同様に、マスト細胞の脱顆粒の離散的だが有意な増加のみが観察された（表5および6、図2および5）。
 (a)  (b) (a) (b) 図2
1フィールドあたりの脱顆粒したマスト細胞の割合とリンパ節面積（ピクセル）を表すヒストグラム。 (a)早期に水腫を発症したサブグループ、(b)後期に水腫を発症したサブグループ。 コントロールとの比較。
PMN細胞およびCD 163+/MAC 387+細胞比を含む免疫組織化学分析で使用したすべてのマーカーを考慮すると、細胞移動に関してグループおよびサブグループ間の差は認められなかった（表5および6、図3、4、および5）。  (a)  (b) (a) (b)> 図3 フィールドあたりの MAC387 プラス細胞の数 を表すヒストグラムである。 CD163/MAC387比と1フィールドあたりの多核球数。 (a)早期に水腫を発症したサブグループ、(b)後期に水腫を発症したサブグループ。 ANOVA、有意差なし。
 (a)  (b) (a) (b)； (b)；
(a) (b) 図4
1フィールドあたりのCD3およびCD45R陽性細胞数を表すヒストグラム。 (a)早期に水腫を発症したサブグループ、(b)後期に水腫を発症したサブグループ。 ANOVA、有意差なし。
 (a)  (b) (a) (b) 図5 1フィールドあたりのCD18（β2インテグリン）陽性細胞数とCD54（ICAM）標識のスコアの中央値（間隔）を表したヒストグラムです。 (a)早期に水腫を発症したサブグループ、(b)後期に水腫を発症したサブグループ。 ANOVA、有意性なし；＊Kruskal-Wallis／Dunn、コントロールとの関係において。
すべてのデータを一緒にして、アルニカ・モンタナ6cHでの処置後に、グループおよびサブグループ間の異なる傾向が見られる水腫強度の散布グラフによって、主要結論を説明することが可能である（図6）。 アルニカで処置され、遅い水腫を示す動物（遅いサブグループ）は、他のグループとの関係でベースラインに変位していることに留意されたい。  (a)  (b) (a) (b) Figure 6
Scattering plotting は、両サブグループ間で水腫の時間発展の傾向が異なることを示した。 白い点はコントロール、黒い点はアルニカモンタナ6cH、灰色の点はデキサメタゾンを表す。 各図において、-軸はカラギーナン注入30分前の浮腫を、-軸は実験終了時の浮腫を示す。 LATE = 後期水腫サブグループ、EARLY = 初期水腫サブグループ。 浮腫の後期ピークを呈し、アルニカ・モンタナ6cHで処置された動物は、他のグループとの関係でベースラインに変位することに留意されたい。
 図7
Flowchart of the experimental steps, determining two subgroups of rat according to the oedema kinetic.
4 Discussionホメオパシー薬の中で、アルニカモンタナは炎症コントロールに特に関心を持つ、最も研究されている薬の一つである。 しかし、ホメオパシーに関する最近の科学文献では、その効果を実証しようとする研究は多いが、動物をこれらの薬に暴露した後の組織の生理病理学的変化の把握に専念した研究は少ない。 このような観点から、本研究は、アルニカ・モンタナ6cHの作用下で、炎症を起こした結合組織を詳細に研究し、そこに移動する細胞のサブセット、血管の挙動、およびこのプロセスの時間依存的な動態を考慮したものである。 興味深いことに、観察されたいくつかの効果は、リンパ管の開口とその結果としての水腫の減少のような、以前に観察された結果と一致する。 この場合、水腫は対照群およびデキサメタゾン投与群よりもさらに弱く、この事実は、肥満細胞の脱顆粒およびリンパ管径の増加の有意な減少に伴っていた。 この2つの現象は巨視的な浮腫の減少に寄与していると考えられ、図2に示すように浮腫の減少とともにリンパ管面積が受動的に減少するdexamethasoneパターンとは異なっている。 この効果は、以前.5988> カラギーナンは、海藻Chondrus crispusから得られる多糖類であり、全身に影響を与えずに局所的な炎症を誘発する能力を持っている。 カラギーナンの皮下注射により水腫が形成される際、遊走する好中球によりプロスタグランジンが生成されることが古くから知られている。 アルニカモンタナ6cHの抗浮腫作用が急性炎症の後期パターンを示す動物にのみ観察されたことは、以前に.NETで示されたように、制御経路に異なるケミカルメディエーターが関与していることを示唆している。 この意味で、ヒスタミンとプロスタグランジンは、作用のピークが15～30分後に起こるメディエーターで、ブラジキニンのように放出後10分程度でピークを迎える早発性のメディエーターではなく、遅い水腫のサブグループでこのプロセスを調節していると思われます。 ホメオパシー医学において、個体差は特異性を意味する。ロシャ2008では、オープンフィールド装置での行動に関して、自然過敏ラットにのみRhus toxicodendron 200cHの投与が有効であったという。 一方、Soares 2007では、低活性のラットのみがBryonia alba 200cHに反応することが観察されています。 これらの相補的な研究は、それぞれのマテリアメディカに適合する結果を示している。 両研究の系統的な比較などは、 PMNと単核白血球のサブタイプの細胞移動については、グループ間およびサブグループ間の差は見られず、CD163+/MAC387+比は炎症部位のマクロファージの成熟のダイナミズムに変化を明らかにした。 CD163は、175kDの膜貫通型糖タンパク質I型で、ED2タンパク質としても知られている。 CD163は、成熟したマクロファージ表面に存在するが、ヒトの未熟な単球や他の単核細胞にもあまり強くない形で存在することが報告されている。 ED 2の発現は、鉄代謝に関連し、炎症の後期に増加する。これは、陽性細胞がモジュレーターの役割を果たし、オートクラインIL10を放出するためである。 接着分子CD54（ICAM-1）の発現は、炎症の初期パターンを示すArnica montana 6cHで処理した動物で大きく、炎症組織内の脱顆粒マスト細胞の割合と関連していたが、白血球の移動の大きさとは関連がなかった。 本研究のこの段階では、メカニズム的な説明はできなかったが、グローバルな結果は、2つの主要なパターンに分かれているように思われる：後期水腫のサブグループに顕著な血管力学の調節のものと、早期水腫のサブグループに顕著な細胞イベントの調節のもので、図6で見られるように、アルニカモンタナ6cHによる血管および細胞炎症イベントの個人依存的な質的調節が示唆される。 これらの異なる変動パターンは、試験された生物学的システムの以前の状態に従って振動し、異なるホメオパシー調剤を用いた他の実験コンテキストで実験的に記述されている 結論として、提案した2つの仮説が強調される可能性がある。 (a)アルニカモンタナ6cH治療による白血球サブセットの移動の選択的調節はなく、リンパ吸収、CD54発現、ヒスタミン脱顆粒に関する血管調節のみである。(b)アルニカモンタナ6cH治療後の血管事象における個々の速度的変動に明確な干渉が存在する。 Conflict of Interests本研究に関連する利害関係はない。 Acknowledgements著者らは、CAPES-PROSUP ProgramとFAPESP Proc.に感謝する。 no. 2007/59661-5による財政支援、Farmacia SensitivaのMarcia Gutierrezによる医薬品の提供、Fernanda Ferrari, Paulo Ailton Valdovato, Lika Osuguiによる技術支援に感謝の意を表する 。 |
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