DNA ポリメラーゼによる二リン酸基質からの DNA 合成

DNAポリメラーゼによるデオキシヌクレオシド二リン酸の利用。 (A)一リン酸基質を用いた標準的なPCRは阻害されるが、4つの二リン酸または三リン酸ヌクレオチドがすべて存在するとDNA増幅が支持される。 好熱性ポリメラーゼTaq, Vent (exo-), Pfuや、B, Deep Vent, Q5 DNAポリメラーゼも、二リン酸基を利用する。 (CとD) 表示された時点で採取した短い鋳型を用いたプライマー伸長反応。 Bsu反応を除き、すべての反応は100 µMのdNDPsを用いて60℃で行った。 伸長した配列はゲルとともに示し、CとDでは明瞭であった。プライマーバンドは”-P “で示した。 休止は主にdAとdCの取り込みの前に現れ、ポリメラーゼ間で変動がある。 (E）dCTP、dGTP、dTTP、および濃度の増加したdADPを用いたプライマー伸長アッセイ。 プライマー（P）と全長（F.L.、706 nt）生成物は、変性ポリアクリルアミドゲルで分解された。 休止は、dADPを取り込んだ場合のみ観察された。 この反応の機構を理解するために、まずTaq酵素を用いてその効率を調べた。 伸長温度を50℃から72℃まで変化させても、全長生成物の量に観察できるほどの差はなかった。 速度論的解析を簡単にするため、すべてのPCR反応は2段階の温度サイクリングプロトコルで行った。第1段階ではプライマーを72℃でアニーリングして伸長し、第2段階では95℃で二重鎖を融解した（図S1A）。 dNDPの利用率を正規のdNTPと比較するために、伸長時間を15秒から120秒まで変化させた。15秒の伸長時間では、dNDPを含む2分間の伸長時間の反応と比較して、dNTP反応は約4倍の生成物を生じた（Fig. S1B）。 これらのデータは、dNDPの基底状態エネルギーが低いことを考慮すると予想されるように、二リン酸の組み込み速度が従来の三リン酸の組み込み速度より遅いことを示唆した。 次に、組み込まれる速度が遅いのは、1つのdNDPのせいなのか、それとも4つのdNDPのせいなのかを検討した。 産物形成の正確な測定のために定量的PCR（qPCR）を使用した。 各二リン酸は、0.2 mMの他の3つのdNTPと組み合わせて長いDNAテンプレートを増幅することにより、独立して照会された。 これらの反応は、4つのdNTPをすべて0.2 mM含む対照反応に対して正規化された（Fig. S1C）。 1の値は、二リン酸がその三リン酸アナログと同じくらい効率的に取り込まれることを示す。 これらの結果から、dADPの取り込み効率が最も低く（1 mM dADPで0.2 mM dATPの約60%が得られた）、次いでデオキシチミジン二リン酸（dTDP）、デオキシシチジン二リン酸（dCDP）であることが示唆された。 一方、dGTP対照反応と同じPCR効率を得るためには、dGDPの濃度を2倍にするだけでよい。

DNA重合を直接解析するために、32P標識プライマーと長い（706 nt）鋳型のプライマー延長反応を行なった。 二リン酸濃度を0.1〜1.0 mMに変化させ、前述のqPCR反応と同様に他の3種のdNTPを0.2 mMに組み合わせて行った。 予想通り、dADPの濃度を上げると、完全長生成物の生成に必要な時間が減少した（Fig. 1E）。 鋳型DNAの長さに沿った休止はdADPの場合のみ観察され、ポリメラーゼがdADP基質の取り込み中に失速することが示唆された(Fig. 1E)。 一方、dTDP反応では休止が見られないことから、qPCR解析（図S1A）と同様に、dTDPがdADPよりも効率的に利用されていることが示唆された（図S2A）。 生成物形成の解析から、半減期の最大値に達するために必要なdADP濃度は約420 µMであり（図S2B）、以前に測定したdNTPのKM（16および24 µM）よりも一桁以上高いことが示唆された（5, 6）。 706 ntの配列には182個のアデノシンが含まれていることから、dADPの平均利用速度は少なくとも約6 s-1であると考えられる。 これはTaqポリメラーゼによるdNTPの平均利用速度（kcat = 47 s-1）よりも約1桁遅く、Pfuのkcatの1.5倍以内である（7）。

dNDPとdNTPからの長い鋳型でのDNA合成の動態をさらに比較するために、7249 ntの一本鎖DNA (ssDNA) M13mp18 plasmidを鋳型にして行った(8)。 Bsu (37 ℃), Bst, Taq (60 ℃) ポリメラーゼは dNDP から強固な DNA 合成を示した (Fig. S2C)。 我々は、SYTO9インターカレーターの蛍光を利用して、dNDPとdNTPの濃度を変化させてリアルタイムサーマルサイクラーで観測したDNA合成速度を測定した（図S2D）(9)。 これらの速度をヌクレオチド濃度に対してプロットすると、dNDPの見かけのKMは約0.4 mMであり、合成速度の最大値はdNDPの方がdNTPよりも約17倍低いことがわかった（Fig. S2E）。 これらの結果から、同一条件下での直接比較では、dNDPからのDNA合成速度はdNTPからのそれよりも1桁強低く、したがってVmax/KMはdNDPの方がdNTPよりも約400倍低いことがわかった。

通常の三リン酸基による重合反応では、新生DNA鎖の長さを1塩基分長くしてPPiが放出される(3)。 逆反応であるピロリン酸分解反応では、プライマーが1ヌクレオチド短くなり、dNTPが遊離される。 同様に、dNDPを基質とする場合、ポリメラーゼはリン酸を遊離し、その逆反応がDNAのリン酸化である（図2A）。 ポリメラーゼがdNDPを直接利用し、2つのdNDPをdNTPとdNMPに変換するこれまで知られていない酵素活性（または共ヌクレオチド二リン酸キナーゼ）を利用していないことを確認するために、精製dNDPを用い、プライマー伸長反応の生成物を分析した。 リン酸の生成は、細菌のリン酸結合タンパク質に由来し、リン酸に対して高い特異性を示す蛍光センサーを用いて測定した(10)。 その結果、精製したdNDPとTaq DNAポリメラーゼの存在下ではリン酸が蓄積されるが（図2B）、ポリメラーゼを欠く実験ではリン酸は蓄積されないことが判明した。 dNTPを用いた対照実験では、リン酸の生成が観察されたが、その速度は遅く、酵素に依存しないことから、検出されたリン酸はdNTPからdNDPとリン酸への分解に起因し、DNA合成とは関係ないことが示唆された。 これらの結果から、TaqはdNDPを基質として直接利用し、DNA合成の副産物としてリン酸を遊離していることが確認された。 上記の7,249 ntのM13 ssDNAのプライマー伸長で生成するリン酸の量を測定したところ、1.6 nMの鋳型を用いて、dNDP分解によるバックグラウンドのリン酸生成量を上回る約11 μmのリン酸を生成した（Fig. S3A）。 このリン酸濃度はDNAあたり約2〜6,000分子に相当し、dNDPを使用してコピーした鋳型の約0.1〜0.9に相当する。 この広い範囲は、出発物質中の比較的大きなリン酸塩のバックグラウンドと、プライマー伸長反応のシグナルから差し引かれるバックグラウンド反応から生じる

この反応がdNDPからdNTPを生成しないことを検証するために、Taqポリメラーゼと250μMのdCDPとdTDPをインキュベートして、イオン交換クロマトグラフィーによって反応を分解した (Fig. S3B). この分析では、酵素を含む反応では、酵素を含まない反応と比較して、モノまたはトリリン酸化ヌクレオチドに相当する新しい分子種は見つからなかった。このことは、酵素調製物にホスホリルトランスフェラーゼ活性がないことを示し、DNA合成におけるdNDPの直接利用がさらに支持された。

上記のようにdNDP基質の反応は、無機リン酸（Pi）を放出し、逆作用はDNAのリン酸化分解となった（図2A）。 この逆反応の効率を調べるために、鋳型鎖にアニールした5′32P標識プライマーを酵素と10mM Piとインキュベートして、リン酸化反応を調べた。 図2Cは、PiとPPiの存在下でTaq DNAポリメラーゼがプライマー鎖から末端の3′ヌクレオチドを除去する様子を示しており、Taq DNAポリメラーゼがdNTPとdNDPの両方からDNA重合の逆反応を起こせることを実証しています。 好熱性Bst、Deep Vent、KOD（図S4A）、9°N、Tgo、および中温性Bsuポリメラーゼの分析でも、程度は低いものの、DNAのリン酸化分解が見られた（図S4B）。 dNDPを基質として受け入れない大腸菌DNAポリメラーゼIのKlenowフラグメントを用いたコントロール反応も調べたが（図S4C）、PiではなくPPiが存在するとプライマーが短縮することが示された。

さらに逆反応を解析するために、α-32P-dATPを用いてプライマー延長反応を行い32P-リン酸で内部ラベルしたdsDNAを調製し、その後PAGE精製を行った。 逆反応の生成物を陰イオン交換（ポリエチレンイミン）TLCで分析した。 予想通り、内部標識したDNAをTaqポリメラーゼとピロリン酸でインキュベートすると、dATPと一致した生成物が得られた。 リン酸存在下での反応では、dADPに対応する高速移動種が得られ、リン酸やピロリン酸のない反応では移動種が得られなかった。このことは、Taqポリメラーゼのみの存在下ではDNAは無傷のままであり（図2D）、逆反応がDNAのリン酸化であることを確認するものである。

最後に、逆反応の基質依存性動態を解析したところ、リン酸マグネシウムの溶解度が10 mMを超えると正確な測定ができなくなるが、リン酸およびピロリン酸のKMはそれぞれ約10±5 mM（n = 9）および57±5 μM（n = 5）だった（Fig. 2E）。 ピロリン酸やホスホノフォルム酸を活性部位に持つDNAポリメラーゼの結晶構造では、タンパク質とのクーロン相互作用が見られる（11⇓-13）。 この結合エネルギーは、リン酸とタンパク質上のカチオンとのイオン的相互作用にほぼ等しく、リン酸/ピロリン酸が主に電荷-電荷相互作用によって認識されるというモデルを支持している。 逆反応の最大速度の推定値も同様の傾向を示した。この条件では、Vmaxはリン酸で0.0010 ± 0.0005 s-1、ピロリン酸で0.205 ± 0.005 s-1となり、やはり2つの活性には約200倍の比があることが明らかにされた。

低エネルギー基質（dNDPsとPi）からのDNA合成についてさらに理解を深めるために、順反応と逆反応のアレニウス解析により活性化エネルギーを測定した。 正しいdNTPの認識と取り込みに伴う構造変化を1分子で測定したところ、観察された反応速度よりも速いタンパク質運動が見られたことから（14）、Taqポリメラーゼの前進反応の律速段階は、化学反応段階または基質リン酸との相互作用に依存する触媒前の活性部位再配列に関連していると思われた。 我々は、dNTPとピロリン酸に比べ、dNDPとリン酸では順方向反応と逆方向反応の両方のVmaxが低いことを観察し、律速段階が基質のリン酸化状態に対して敏感であることを示唆した。 しかし、触媒前転移（活性部位残基の配列や触媒用Mg2+イオンの結合など）と化学反応は、いずれも基質のリン酸化に影響される。したがって、dNDPが存在する場合、機構に新たな低速の構造変化段階を導入しないと仮定すれば、どちらの段階も律速となり得る。 Pol βでは、これら2つのステップは類似した速度定数を持つことが以前に提案されており(15)、高エネルギー基質（dNTPsとピロリン酸）を利用した順反応と逆反応の活性化エネルギーの計算値は15 kJ/molとわずかな差であった(4)。 好熱菌のTaqとKlentaq1酵素の場合、順反応の活性化エネルギーは実験条件や反応するヌクレオチドの種類によって90から125 kJ/molと大きく異なるが（8、16）、ピロリン酸化の活性化エネルギーは我々の知る限り、実験的に決定されてはいない。

プライマー伸長反応において、dCDP、dADP、dTDPをそれぞれ50μMのdA、dC、dAに積層した場合の1塩基取り込み率を解析した。 アレニウス解析の結果、60℃以下の実験ではln(kobs)の1/Tに対する線形依存性が見られ、3つのヌクレオチドの活性化エネルギーは85 ± 14, 108 ± 11, 112 ± 15 kJ/molとなった（図3 A, B; n = 6 for each nucleotide）。 0.4 mMのリン酸を用いた逆反応のアレニウス解析では、138 ± 10 kJ/mol (n = 5) という大きな活性化エネルギーが得られ、これはTaqによるDNAリン酸化の遅い速度（図3 AとB）と一致し、ピロリン酸化の活性化エネルギー（Pol βでは92 kJ/mol) (4) より大幅に増加したことに相当します。 このように、dADPの順反応と逆反応の活性化エネルギーは約30 kJ/mol異なり、DNA合成に強いバイアスがかかっていることがわかる。 この順方向反応への偏りは、dNTPを用いたDNA合成や無機ピロホスファターゼによるピロリン酸加水分解とは対照的に、下流の代謝経路によるリン酸生成物の隔離の必要性が低いことを意味する。 さらに、Taq ポリメラーゼの触媒反応前の構造変化が低エネルギー基質の影響を受けず、化学反応のステップが律速となる場合、dNDP とリン酸塩の利用は、DNA 合成の酵素触媒反応に関する新しい実験的洞察をもたらすと考えられる

我々の研究は、Taq、および好熱菌と好中球の複製酵素を含むDNAポリメラーゼのAおよびBファミリーの他のいくつかの酵素が、通常の三リン酸基質を二リン酸アナログで置換できることを示している。 ヌクレオチド基質中のγ-リン酸が消耗品であることを示す初期の証拠は、HIV-1逆転写酵素とバクテリオファージRB69 DNAポリメラーゼgp43の研究から得られたものである。 HIV-1逆転写酵素の変異体は、流入するdNTPのγ-リン酸とポリメラーゼの間の静電的相互作用を消失させ、はるかに遅い速度ではあるが活性を保持した（17⇓-19）。バクテリアファージRB69のDNAポリメラーゼgp43も同様の活性を示した（20）。 これらのウイルス酵素はいずれもdNDPを基質として受け入れるが、HIV-1 RTとRB69 gp43によるdNTPの場合と比較して、KM（またはKD）はそれぞれ500倍と17倍高く、速度定数は100倍と400倍低い（20, 21）。 我々の研究は、細胞内の複製ポリメラーゼがこの活性を持つことを示し、順反応と逆反応の両方における基質親和性と活性化エネルギーを記述し、dNDPからのDNA合成が、特に耐熱性酵素において合理的に効率的であることを示唆するものである

我々の結果は、DNA複製がdNDPを基質として達成できることを示唆している。 好熱菌では、耐熱性ポリメラーゼが三リン酸基だけでなく二リン酸基も受け入れることができるため、中温菌に比べてゲノム複製が細胞のエネルギーチャージに影響されにくいのかもしれない。 このため、DNA複製は細胞内のATP/ADP比の影響を受けにくく、また、高温でDNAが比較的高い効率で合成されることから、好熱菌は三リン酸基を完全に除去できる可能性がある。 さらに、古生物学的な証拠から、我々の生物圏の最後の共通祖先は好熱菌であったと考えられており（22⇓-24）、我々の研究は、初期の生物のゲノム複製には二リン酸化基が十分で、高エネルギーの三リン酸化代謝中間体の必要性を緩和していた可能性を示唆している。 その場合、二リン酸は高エネルギー代謝物の進化における中間体であると考えられ、リボヌクレオチドやより単純な核酸など、初期のゲノムの祖先の構成要素を含む可能性がある

DNA ポリメラーゼは、多くのバイオテクノロジーにおいて重要な役割を果たす。 今回報告された二リン酸基質の使用は、同位体標識や化学修飾されたヌクレオチドなどの高価なアナログの組み込みを実用化する可能性があり、難しい三リン酸合成の必要性を排除することができます。 また、このDNAポリメラーゼの特徴は、ハイスループットDNAシーケンシングに用いられるヌクレオチドを検出する方法を提供する可能性もある。 プライマー伸長に伴うPPi脱離基の検出には、二次化学発光アッセイや局所pHの変化をモニターする方法が一般的である(25, 26)。 dNDP基質を使用すると、Piが得られるので、組み込まれたヌクレオチドを区別する機会がさらに増えます。 このようにDNAポリメラーゼの能力を理解することは、他の三リン酸依存性酵素を調べると、進化の中間体として、より低エネルギーでアクセスしやすい二リン酸基質への耐性が明らかになることも示唆している

。