The cnidosac in Cladobranchia
Comparative anatomy of the cnidosac
本研究以前は、クレプトクニドを保有するクラドブランチの間では、cnidosacの形態の均一性について多くの仮定がなされてきた。 特にEdmundsは、刺胞の記載が主目的ではなかったが、Fionidae, Favorinidae, Facelinidae, Aeolidiidaeの種間で驚くほど一貫した図面を提供している。 その出版物では、すべての種が、消化腺と刺胞部をつなぐ明確な入り口（ただし、入り口が水路のようにわずかに伸びているものもある）と、刺胞部の先端で外部とつながる明確な出口を備えている。 さらに、すべての刺胞部がクレプトクニドを持つように描かれ、筋組織の見せ方も非常に画一的である。 これまで、エオロイドの刺胞体に関する最も詳細な研究は、Kälker and Schmekelによって書かれたが、約600種のエオロイドに見られるこの構造のバリエーションについて十分に説明されていない。 また、ハンコック類の刺胞嚢様構造に関する研究は最近始まったばかりである。
本研究では、刺胞嚢への入り口の長さ、大きさ、構造がこれまでの研究で予想されていた以上に異なり、出口（刺胞孔）の構造、刺胞孔を取り巻く筋組織、クレプトクニドの位置と方向も異なることがわかった。 なお、今回、刺胞部の形態的特徴について幅広い分類群の標本を作成したが、多くの種では分析に利用できる標本は1つだけであることに注意が必要である。 そのため，ある種の欠失の観察には注意が必要である。
従来の研究では、短くて単純な刺胞部の入り口（すなわち直接開口）しか示されていなかったが、これは単にこの条件を持つ分類群が偶然に選択されたためと思われる。 しかし、私たちの研究は、これが消化腺と刺胞部の間の最も一般的な移行部であることを示唆している。 しかし、HancockとEmbletonはAeolidia (= Eolis) papillosaの繊毛路の存在に言及し、HerdmanとClubbは現在のFacelina bostoniensis (= Facelina drummondi) に「長く曲がった接続ダクト」の存在に言及している。 また，Aeolidia papillosa, Cerberilla amboinensis, Cratena peregrina, Pteraeolidia ianthina, Paraflabellina ischitana など，繊毛をもつ管路をもつ種がいくつかある。 これらの分類群は近縁種ではないため、チャネルを持つ分類群の間で相同性はなく、チャネルが存在するのは機能的な説明であると考えられる。 A. papillosa, C. amboinensis, P. ianthinaはいずれも長さ20μm以上の大型のクレプトニドを分泌することから、この細長いチャネルはクレプトニドの大きさと関係があるのではないかと当初は考えたが、実際にはクレプトニドの大きさとは無関係であった。 しかし、C. peregrinaとP. ischitanaはより小さな刺胞を取り込んでおり、このことは支持されない。
同様に、増殖帯を持つ分類群と持たない分類群には一貫したパターンがない。 例外はPhyllodesmium属の線虫を封じ込めない分類群に増殖帯がないことである。 Phyllodesmium属の中で増殖帯を確認したのはP. jakobsenaeだけであり、これはクレプトクニドを保有することが知られているPhyllodesmiumの唯一の種である。 なぜ増殖帯がある種とない種があるのかはまだ不明であるが、一部のサンプルの切片化のアーチファクトによってこの領域が破壊され（おそらく保存が困難なため）、一部の種a（例えばCratena peregrina；図4d）の刺胞内に膜片や浮遊するクレプトクニドが生じたのではないかと推測している。 この点については、これらの種からより多くの個体が調査される必要がある。 また、増殖帯がないように見えるのは、調査した個体の成長段階の違い、あるいは再生途中の耳介の違いによる可能性もあるが、いずれの仮説も明確に支持する証拠は見つからなかった。 また、少なくとも1つの先行研究では、この領域の存在に言及しているが、詳細な検討はなされていない。 この領域は、刺胞が刺胞体遠位端に向かって移動する前に、刺胞に取り込まれる場所である。 しかし、この増殖域の正確な範囲はまだ不明である。 ある種では刺胞部に限定されているように見えるが（例えばPteraeolidia ianthina；図4a）、他の種ではこの領域は消化腺の隣接部分にまで及んでいるように見える（例えばDondice occidentalis；図4b）。 刺胞を封じ込める分類群の大部分では、刺胞からの出口は非常に単純で、薄い上皮で覆われている場合もあることがわかった。 この上皮は耳介の表皮に似た細胞を含み、細長い柱状の細胞と多くの特殊な液胞のようなものから構成されている。 単純な出口が最も一般的で、我々の研究でも他の研究でもそうであるように思われる。 しかし、Aeolidia papillosa、Anteaeolidiella chromosoma、Cerberilla amboinensisなど、Aeolidiidaeの中のいくつかの選ばれた分類群では、複雑な刺胞が存在する（図4c）。 この孔は、表皮と連続するように見える上皮の裏打ちを持っている。 この構造は以前から確認されていたが、単に未分化な細胞のゾーンと考えられており、失われた刺胞の予備として機能すると考えられていた。 しかし、刺胞嚢の遠位端に位置し、刺胞孔の一部であることから、そうではないと思われる。 むしろ、この細胞層はイソギンチャクから隔離された例外的に細長い刺胞（長さは最大50〜60μm、幅は<5μm）を放出するための特別な適応であると仮定している。 これまで刺胞孔という用語は刺胞部からのすべての出口を指すものとして無批判に用いられてきたが、ここでは刺胞孔という用語を再定義し、これまでアリドリ科にしか見られなかった構造を指すようにした。 また，刺胞部周辺の筋組織は，EMBLETONIA GRACILIS，EMBLETONIA PULCHRA，Bulbaeolidia ALBAなどごく一部の種で非常に薄いか完全に欠落していることがわかった。 筋がある場合、筋の厚さは種によって異なり、1層に見えるものから複数層に見えるものまである。 このような筋の厚さの違いは、今回示したほど正確ではないが、1つの先行研究でも示されている（表3）。 筋肉の厚さや筋層の数が分類群間で異なることについて、明らかな進化的説明はないが、筋層が厚いほど、クレプトニドをより強力に排出することになると思われる。 筋層の厚さは、捕食圧や組み込まれたクレプトニドの大きさ、あるいは発育段階と関連している可能性がある。
刺胞体が機能的で活発な細胞から刺胞体先端のクレプトニドの「容器または貯蔵所」に分化するのは、プロトン輸送によるクレプトニドの成熟を反映しており、最初に隔離されたときは未熟で機能的でなかった． 成熟後は、細胞の複雑さが減少するため、それ以上の機能はないように見える。 これまでの研究者は、刺胞の膜の起源について考察を試みてきたが、最近では、細胞膜によって形成される特殊な小胞であるファゴソームであると結論付けている . 刺胞動物では、クレプトクナイドの数は分類群内でも分類群間でも異なる可能性がある。 これはクレプトニドの大きさと関係があるようで、ある刺胞動物では、大きなクレプトニド（長さ20μm以下）は、小さなクレプトニド（通常10μm以下）に比べて少ない傾向にある。
Divergences from the general theme
本研究で評価した形態的特徴は科内でかなりばらつきがあるように見えるが、ほとんどの刺胞はAeolidida全体で保存されているテーマに基づいて概ね変化している。 しかし、特定の刺胞構造が失われたものや、刺胞が完全に失われたものもまだ存在する。 刺胞が封じ込められなくなると、刺胞は消化腺や刺胞周囲の筋組織との接続を失うという仮説が成り立つかもしれない。 例えば、Phyllodesmium属の種（P. jakobsenaeを除く）は、クレプトクニドがないように見える筋肉で結合した刺胞部を持つが、消化憩室への入り口や外部環境への出口は明らかに存在しない。 むしろ、これらの種は防御のために化学物質を封じ込めるので、構造化された入口を必ずしも必要としない。 このように，Phyllodesmiumの刺胞は，出口はないが圧縮すると内容物が放出されるCharcotiidaeの外皮形成に類似しているのかもしれない 。 しかし、Favorinus属の種では、刺胞部の全体的な構造（消化腺からの開口部や刺胞部の周囲の筋肉など）は変わらないが、これらの種が他の腹足類の卵を食べる傾向があるため、クレプトクニドが存在しない。 クレプトクニドがないのは、PhyllodesmiumとFavorinusが固定化の過程で刺胞を放出する傾向があると仮定してのことかもしれないが、その可能性は低いと思われる。 Phyllodesmiumの仲間は、クレプトクニドが排出されると予想される上皮をそのまま持っているように見えるからである。 仮に固定中にクレプトクニドが排出されたとすると、上皮の先端が開口した状態で固定されることになり、その結果、クレプトクニドを排出した上皮が固定されることになる。 また、特にPhyllodesmiumではクレプトクニドがないことがよく知られている（P. jakobsenaeを除く）。 Favorinusでは，頭頂部の上皮が開いていることからその可能性もあるが（例えば図2c），kleptocnidesがないことは，本属が腹足類の卵を食べる習性と一致する。
このテーマのさらなるバリエーションはBulbaeolidia alba, Embletonia属やFiona属内の種に見られる。 Bulbaeolidia albaは消化腺の遠位端に袋があり、そこには時々褐虫藻(Symbiodinium)が入っているのみである。 また、この袋には明らかな出入り口は見当たらず、数本の細い筋繊維に囲まれた構造になっているようである。 しかし、Embletonia属やPseudovermis属の小型の分類群にもクレプトクニドが存在することから、B. albaは非常に小型で、そのため防御要求が低いのではないかと推測された。 また、本種が餌とするイソギンチャクに含まれる刺胞の大きさや有用性に関連している可能性も考えられる。 また、B. albaはPhyllodesmiumのように餌から得た、あるいは新たに生産された他の天然化合物をこの嚢内に収容しているのではないかという考え方もある。 この場合も、B. albaにクレプトクニドがないのはサンプル数が少ないことによるアーチファクトである可能性があるが、Phyllodesmiumと同様に、押し出しの証拠は見つからなかった。 エンブルトニオイデス科の仲間は、後述の刺胞部の進化の項で述べるように、進化的に刺胞部の周囲の筋組織を完全に失ったか、刺胞部の進化の中間段階にあるように思われる。 また、これらの分類群では、刺胞部への出入り口は明らかでない。 最後に、フィオナ科のフィオナ属のいくつかの種（本研究）は、表向きはこの属の種が刺胞以外の餌を好むため、刺胞が完全に失われている。 Hancockia californicaでは、各セラの先端にある複数の筋嚢の中で、刺胞のような細胞にクレプトクニドが収容された、刺胞に非常によく似た構造（我々は刺胞様と呼んでいる）を見ることができる。 これらの構造はHancockia uncinataやH. schoefertiでも見つかっており、鼻甲介と鼻甲介鞘の両方にcnidosac様構造が見られる場合もある。
Phyladobranchia and evolution of the cnidosac
Phylogenetic inferences
ここで得られた分子データの多くが既報の研究に由来することから、我々の系統解析（図5）で推定されるトポロジーは最近の系統解析研究で見つかったものと一致している。 しかし、今回の研究では、Phyllodesmium属、Caloria属、Pruvotfolia属、Pteraeolidia属、Cratena属、Facelina属、Glaucus属、Calmella属、Piseinotecus属、Tergipes属、Notaeolidia属、Embbletonia属、Charcotia属という最近の系統樹研究では解析されていないタクシを追加してこれまでの知見を拡張しています。 これらの大部分は、これまでの分子生物学的研究に基づいて予想されるクレードに含まれる。 PhyllodesmiumはAeolidiidaeと姉妹関係にあるfacelinid cladeのDondiceと近縁である；Caloriaは第2facelinid cladeに含まれ、Pruvotfoliaの種と近縁である；Facelina、Glaucus、Cratenaは第2facelinid cladeで近縁である；CalmellaはFlabellinaとParaflabellinaに近い；Tergipesは現在のフィオン科に該当する …等である。 しかし，Pteraeolidia が Palisa や Austraeolis に近縁な第2顔類に属することは本研究で初めて明らかになった．また，今回発表された分子データは，Charcotia が形態学的研究によって以前示唆されたように Aeolidida と姉妹グループに属することを支持するものだった． この2属の正確な位置に対するサポートは乏しく、これらの分類群はAeolididaの基部の低いブートストラップ値に寄与しているように思われる。 これは，NotaeolidiaとFlabellinopsis iodineaの間，およびEmbletoniaとUnidentiaの間の長枝誘引によるものであると思われる。 しかし、形態学的な解析は、少なくともNotaeolidiaがAeolididaの中でより早く分岐したことを支持している。 また、個々の遺伝子ツリー解析（および 3 遺伝子解析）は、過去の大規模な PCR ベースの配列解析と一致することがわかった。 これらのトポロジーと事後確率は、使用した遺伝子（COI、16S、18S）のPCRベースのシーケンスデータは最近の分岐を推測するのにある程度有用であるが、より深い分岐を推測するためにはハイスループットのシーケンスデータが必要であるという考えを支持するものであった。
刺胞動物の進化
刺胞動物の刺胞の隔離は、ここに示した系統樹に基づき、少なくとも2回、ウミウシ科で発生した（図6）。 また、この結果は、刺胞を封じ込めないAeolididaの中の種がこの能力を失ったことを示し、少なくとも3回起こったと思われる。 また、この結果は、刺胞動物の系統の中でエンブルトニダ科が早期に分岐したことを示唆している。エンブルトニダ科内の構造は刺胞であり、刺胞の周りに筋組織がないことは、クレプトニド隔離の進化の中間段階を表している可能性があることを示している。 しかし、これ以上の推論を行うには、Aeolididaの底辺の関係をより強く支持する必要がある。 また、FionaとTergipesのメンバーを含む、いくつかの独立した刺胞嚢の喪失を支持する結果が得られた。 これは、Fionaでは主に甲殻類を捕食するようになったためと思われる。 また、Tergipesのいくつかの種では、ヒドロ虫から他の種類の生物への餌の嗜好性の変化が、刺胞部の喪失につながった可能性がある。
消化腺の遠位端にある袋の存在は、刺胞を封じ込める能力よりも先に生まれたという仮説がある（図6；灰色のボックス）が、この結果はCharcotiidaeとProctonotidaeで見られる末端袋がAeolididaのものと相同であるという仮説に依存している。 この仮説の支持は非常に低いので、今回の復元では可能性が低いと思われる。 しかし、シャコガイ科やプロクトノート科の終糸嚢は排泄器官として機能していると考えられており、エオリダの刺胞嚢はこの終糸嚢が防御のために適応したものとする仮説もある。 相同性は不明であるが、我々の祖先の状態の復元は、遠位嚢が線虫を隔離するために外れたというこの修正仮説を完全に否定するものではない。 この仮説を検証するためには，Charcotiidae + Proctonotidae + Dironidaeの種からさらに形態学的・分子生物学的データを得る必要がある． このことは、今回発表した系統解析や、ハンコキアとエオロイドの種との隔離過程の違いからも支持される。 例えば、Hancockia属の種は、aeolids属の種とは異なり、輸送前に消化管の内腔に線虫を封じ込めるようである
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