序章。 胚割裂の研究のための新技術

受精卵から割裂胚への観察

1912年に最初のウサギ胚培養が報告されて以来、マウスの接合子は体外で培養して胚盤胞期胚を形成できるようになりました。 胚の質は、移植された胚の子宮への着床に密接な相関があるため、体外受精卵を子宮に移植した後の妊娠にとって重要な因子となっています。 1978年7月に最初の「試験管」ベビー、ルイーズ・ブラウンが誕生して以来、体外受精（IVF）と胚移植（ET）を開発し、卵管のない女性の不妊症を治療したとして、2010年のノーベル生理学・医学賞はロバート・エドワーズに授与されましたが、体外胚培養はヒト不妊治療や動物の繁殖・増殖に広く利用されています。 しかし、生殖補助医療技術の成功は、主に着床能の高い生存可能な胚の生産に依存しています。 さらに重要なことは、移植に最適な胚を選択することが、体外受精の大きな課題となっていることです。 初期の胚培養では、胚の品質評価は主に移植された胚の形態的基準に基づいていました。 そのため、胚の形態を連続的に観察することは、胚培養士が胚を評価するための一般的な手法であり、着床と妊娠の重要な予測因子と考えられてきました 。 胚培養士は、胚を培養器から取り出して顕微鏡下に置き、胚の品質と形態の評価を長期にわたって行ってきた。 形態観察以外にも、細胞核の変化、遺伝子の活性化と発現、細胞質タンパク質の発現、胚盤胞の分化など、一連の研究に興味をもっています。 しかし、これらの研究はしばしば胚の死滅につながる。 例えば、精子が卵に侵入した後や卵子が活性化した後の微小紡錘体の変化を観察した我々の初期の研究では、受精卵や活性化卵をスライド上に固定し、免疫細胞化学的蛍光染色やレーザー共焦点顕微鏡による染色が必要であった。 私たちの研究では、ウシ卵子の活性化および顕微授精（ICSI）後に微小管とクロマチンが変化していることが明らかになりました（図1）。 精子が卵子に注入されたり、カルシウムイオノフォアやエタノールによって卵子が活性化され、第二極体が押し出される可能性があります。 そこで、第二極体の出現時期を観察するために、活性化後の卵子を様々なステージで染色した。 その結果、活性化後5時間経過すると、第二極体が完全に押し出される可能性があることがわかった（図2）

遺伝子発現の研究では、しばしば胚からmRNAやタンパク質を分離する必要があり、胚を溶解しなければならず、胚が生き残ることはない。 モルモット期や胚盤胞期の胚の細胞分化を研究するために、フルオレセイン顕微鏡による二重染色法で内細胞塊（ICM）と栄養外胚葉（TE）を区別してきた。

これらの研究方法は最終的にすべての胚を損傷してしまい、臨床に応用することは不可能である。 したがって、現在の胚の品質評価は、主に移植胚の形態学的基準に基づいており、これには、胚盤の規則性、断片化、および細胞質粒状性などの3つの主要なパラメーターが含まれる 。 また、培養日の異なる胚の細胞数、多核性も胚の品質を評価するために考慮されます。 いくつかの報告では、開存期胚の形態的特徴と妊娠成立の関連性が報告されています。 現在、ヒトの体外受精や動物の体外胚生産において、胚の品質評価の基本的な方法として用いられています。 しかし、手軽に行える反面、インキュベーターから胚を取り出すことが多く、培養条件の安全性や安定性に懸念があります。 また、観察中に胚発生の重要なポイントを見逃してしまうこともあります。 培養中および胚移植前の分割胚の評価は臨床上重要である。 現在、体外受精胚の評価は、顕微鏡を用いた目視観察が主流となっています。 近年、ヒト体外受精クリニックでは、胚の成長・発生の全ステップを観察するために、様々なタイムラプス顕微鏡インキュベータが使用されています。 着床前胚診断とスクリーニング（PGD/PGS）技術は、妊娠率向上のためにヒトの胚選択診療に応用されていますが、これらの技術は胚への侵襲性があります。 非侵襲的に良好な胚を選択する方法を見つけることは、ヒトのART実践に非常に有用であると考えられます。 Sallamらは、非侵襲的な胚選択法をレビューし、現在利用可能な最善のエビデンスに照らしてこれらの方法を評価し、どれかが昔からある形態学的評価に取って代わる、あるいは補完する時期に来ているのかどうかを調べました。 このように，胚の形態運動学的マーカーを推定するための，より強力なツールが必要である． タイムラプスイメージングに基づく胚の裂開の形態動態

何十年もの間、研究者は受精卵から成体への多細胞生物の発生を追跡することを試みてきた。 しかし、このプロセスの個々のステップを探ることはできても、発生の全過程をライブでモデル化できるような方法は存在しなかった。 現在、2つのNature Methodspaperで報告されているライトシート顕微鏡の進歩により、研究者は初期発生を非常に詳細に可視化することができるようになった。 最近のライトシート顕微鏡は、レーザー光のシートを使って試料の薄い部分を照らし、平面全体を1枚の写真に収める。 そのため、共焦点顕微鏡や二光子顕微鏡よりもはるかに少ない光量で撮影することができます。 非常に高速でありながら、同時に複数の重要な点で極めて優れた性能を発揮する優しい顕微鏡です . ショウジョウバエ、ゼブラフィッシュ、マウスなどの胚全体の発生をイメージングする場合、この新しいマルチビューイメージング技術は素晴らしいものです。

タイムラプスイメージングは、胚の発生を 24 時間監視できる非侵襲型の新しい技術で、培養状態を乱すことなく形態情報の量と質を向上できる可能性を提供します . タイムラプス顕微鏡は、胚の発生を観察するのに非常に有効である。 この10年間、多くの体外受精クリニックやセンターでは、体外培養中の胚の成長と分裂をモニターし、最終的に記録データと写真に従って移植用の良質な胚を選択するためにタイムラプスイメージングを使用するようになりました。 この技術は、移植された胚の着床や妊娠を改善することができることが報告されています。 また、胚割断のタイムラプス記録をもとに、正常な胚割断速度を決定することができます。 そこで、本書の第2章では、タイムラプスモニターによる形態学的マーカーをもとに、胚割れのタイミングを概説しました。 この胚割裂時期の概要によれば、胚がどの段階にあるべきかが明確にわかるようになる。 そのため、最適な品質の胚や着床の可能性の高い胚を選択して移植することができ、より高い妊娠率を得ることができます。 タイムラプスを用いた連続的かつ高頻度な記録システムにより，いくつかの形態運動学的マーカーを明らかにすることができる． 例えば，ある時間帯に胚細胞が急激に分裂すると，着床率が低下することが多い． 通常、接合体から2-3個の細胞への分割には10-11時間程度を要するが、Rubioらは、この分割を5時間程度で完了する胚があり、これらの胚は通常の分割胚に比べて着床率が大幅に低いことを発見した（1.2％ vs 20％）。 また，不等割胚（1つの胚盤が3つの娘胚盤に分裂すること，あるいは細胞周期の間隔が5時間未満であること）と定義される胚は，着床率が著しく低下することが多い． 第3章では、さらにタイムラプスイメージング技術が、従来の形態学的評価ではなく、ARTの結果を改善するために移植する「最高品質」の胚の選択に有用であるかどうかを検討し、検証している。 また、胚の性別、胚の断片化、治療プロトコル、異なる培養液、胚の形態動態との相関をタイムラプスイメージング設備の新しい研究に基づいて評価したことは興味深い。 さらに、タイムラプスイメージングを用いたARTサイクルで設計された様々なアルゴリズムや予測モデルについても議論しています。 例えば、通常の形態観察による動物やヒトの胚の発生速度に関する多くの研究から、雄の胚は雌の胚よりも速く成長することが分かっています。 しかし、現在のタイムラプスイメージング観察では、初期分割におけるオスとメスの胚の違いについて、より詳細かつ正確な情報を得ることができるかもしれません。 しかし，今回のタイムラプスイメージング観察により，初期分割における雌雄の差の詳細が明らかになると思われる． このように，胚の性差に関連した観察が重要であることがわかった． 興味深いことに，著者らは胚が雌である確率を予測するために，秒同期とモルラ形成の時間に従って4つのサブグループからなるモデルを設計した．

さらに胚の裂開の形態動態を研究・探索するために，第4章では試験管内での胚の裂開の時空間的解析方法についていくつか論じた．割球期の初期胚の画像を自動あるいは半自動でタイムラプス解析することにより、有糸分裂のタイミング、分裂タイミングとパターンの規則性、さらに細胞系列についての知見を得ることができる。 また、分子プロセスの同時モニタリングにより、遺伝子発現と細胞の生理・発生との関連性を研究することができます。 タイムラプスイメージングデータと解析ソフトウェアにより、胚の4次元ビデオシーケンスを容易に作成することができ、成長する胚が時間的な胚の発達に関する新しい洞察を示すことができる。 本章では，胚の分割パターンや系統をin vivoで研究することで，発生学に新しい情報をもたらす3つの方法について，ハードウェアとソフトウェアの解析のバリエーションを示しながら，その成果の一例を紹介する。 割球胚の遺伝子発現と培養液分析による胚の生存率の非侵襲的評価

着床前胚の発生は一連の重要なイベントと顕著なエピジェネティック修飾を経験し、遺伝子発現の再プログラミングが起こって胚ゲノムを活性化させる。 着床前胚の発生初期には、母体のmRNAが胚の発生を指令する。 初期胚の発生を通じて、メチル化パターンの差は維持されているが、一部は段階特異的な変化を示している。 最近の研究では、脱メチル化過程の差は、初期発生胚の親遺伝子発現の差となり、正しい発生に影響を与える可能性があることが示されている 。 また、ノンコーディングRNA、ロングノンコーディングRNA（lncRNA）、ショートノンコーディングRNA、マイクロRNA（miRNA）は、mRNAの制御に重要な役割を果たすことが明らかにされており、着床前発生におけるその役割は重要性を増してきています。 第5章では、着床前胚の発生における遺伝子発現に影響を与える様々な要因について、配偶子および着床前胚のメチル化プロファイルを中心としたエピジェネティックな要因も含めて概説している。 9800＞＜1205＞着床前胚は体外培養で胚を発生させる際に遺伝子発現が現れるため、栄養価の高い培養液が必要とされることが多い。 胚は成長・発達の過程で培地から重要な栄養成分を吸収し、遺伝子発現の結果として副産物を代謝的に生産する必要がある。 このような観点から、胚の体外培養は、使用済み胚培養液中のバイオマーカーを調べることにより、さらに非侵襲的に胚を評価するための非常に重要な材料となる。 現在開発されている方法は、発達中の胚から分泌される代謝化合物の測定に集中している。 これらの研究では、主に最新の分析法とプロテオミクスのツールを利用しています。 いくつかの研究は、光学および非光学分光法を用いた胚培養液の代謝プロファイリングが、現在の胚評価戦略の有用な補助となり、生殖能力の増加する胚の表現型についての洞察を提供することを示唆している。

第6章では、著者らは、胚の生存率の定量バイオマーカーとしてのヒトハプトグロビン分子のα1鎖という新しい発見について説明している。 一連のレトロスペクティブな盲検実験で、50％以上の成功率を達成した。 本章では、胚の生存率を非侵襲的に分子レベルで評価する方法として、現在利用可能な代謝およびプロテオミクス的アプローチを概説する。 最近の研究により、栄養培地の分子成分の評価は、胚の着床の成功、その後の臨床妊娠の発展、健康な赤ちゃんの誕生を示すマーカーを探索し、ART技術を用いた治療の効率を高めるための有望な分野であることが示された。 培養液の分子組成が選択的移植のための胚を選択する追加の非侵襲的手順として使用できれば、ヒト体外受精の妊娠成績を改善するのに非常に有用である。