概要
はじめに。 Trametes versicolor（Tv）キノコの経口投与製剤は，標準化学療法および放射線療法後の乳癌女性患者の免疫反応を改善するという仮説が立てられている。 方法 放射線療法終了後6週間、Tv製剤を毎日分割して服用した場合の最大耐容量を決定するため、2施設による第I相用量漸増試験が行われた。 11人の参加者が募集され、9人の女性が研究を完了した。 各コホートは、Tvの3つの用量（3、6、9グラム）のうちの1つを与えられた3人の参加者で構成されていた。 免疫データは、放射線照射の前後、治療中の3つの時点、および3週間のウォッシュアウト後に収集された。 結果 9件の有害事象が報告され（軽度7件、中等度1件、重度1件）、Tvの忍容性が良好であることが示唆された。 免疫学的結果は、（1）6グラム／日と9グラム／日でリンパ球数の増加傾向、（2）6グラム／日でナチュラルキラー細胞の機能活性の増加、（3）CD8+ T細胞とCD19+ B細胞の用量依存的増加、しかしCD4+ T細胞とCD16+56+ NK細胞の増加はなかった。 結論 これらの知見は、9グラム/日までのTv製剤は、一次治療後の設定において、乳癌の女性において安全かつ忍容性があることを示すものである。 このTv製剤は、標準的な腫瘍学的一次治療後の免疫不全乳癌患者の免疫状態を改善する可能性がある。
1. はじめに
Trametes versicolor (Tv) は、Coriolus versicolor および一般に Turkey Tail とも呼ばれるキノコの一種で、アジアの伝統医学で長い間使用されてきた製剤が作られてきました。 Tvの熱水抽出物には、ポリサッカライド-K（PSK）とポリサッカライド-ペプチド（PSP）という2つのプロテオグリカン画分があり、抗がん作用が報告されています。 日本では、PSKは放射線療法や化学療法中やその後に、がん患者に日常的に処方されています。 また、米国の多くの自然療法医（ND）や統合腫瘍医（MD）の間では、乳がん患者に丸ごと凍結乾燥したTvを処方することが一般的に行われている … Tvの免疫活性が、抗腫瘍効果や生存率への影響をもたらす主な基礎的メカニズムであると仮定されている。 Trametes versicolor の作用機序には、少なくとも部分的に Toll-like 2 受容体アゴニスト活性を介した自然免疫と適応免疫の両方の反応の増強が含まれる . 前臨床動物試験と予備的な臨床データは、Tv誘導体がエストロゲン受容体陰性および陽性の癌の治療において有益であるという仮説を支持しており、治療による免疫抑制効果を緩和し、免疫監視の強化および腫瘍抗原耐性の克服を介して無病生存率を高めることができる。 最近のデータでは、ある種の化学療法剤が免疫原性の腫瘍細胞死を引き起こし、それが抗原交差提示の増強と抗腫瘍免疫応答の刺激につながることが示されている。 NK細胞は、早期および転移性乳がんの予防に重要な役割を果たすことを示す証拠がある。 乳癌患者の中には、K562標的細胞に対するNK細胞活性を欠く者がいることが報告されている 。 現在のデータでは、手術、化学療法、放射線療法を終了した乳癌患者は、免疫学的な欠損を抱えていることが示唆されている . Andersen らは、乳癌患者のストレスレベルが、NK 細胞溶解能の低下および末梢血リンパ球の増殖反応の低下を有意に予測することを報告している . 乳がん患者におけるTrametes versicolorの有用性をより理解するために、安全性と忍容性を評価するための用量漸増試験が必要であった。 この目的のために、ミネソタ大学とバスティア大学の学際的なチームは、乳がんの標準治療を受け、放射線治療後に9週間の研究に参加する意思のある乳がんと診断された女性におけるTvの安全性と最大耐容量を決定するための第1相用量漸増試験を完了しました
2. 試験用量エスカレーション
MTD（最大耐容量）に達するまで、各用量レベルにつき3人の被験者からなる標準的な第1相試験デザインを使用しました。 Tvの各コホートにおける用量エスカレーションスケジュールは、3gm（最も一般的に使用される用量）、6gm、9gm、12gm、18gm、24gmとしました。 本試験では、9グラムのコホート（𝑁=9）のみで募集を行いました。 研究参加者
ステージI、II、またはIIIの乳がんと診断され、手術と化学療法を受け、放射線療法を開始する準備ができている21歳から75歳の女性が、書面による同意を提供した後に本研究に登録されました。 参加資格には、試験期間中一貫した食事を摂ること、放射線治療中および試験終了まで免疫調節作用が報告されているキノコ類やその他のハーブ製品の摂取を控えることも含まれた。 また、血液、腎臓、肝臓の各機能が正常範囲内であることが、本試験への登録前に要求されました。 本試験は、ミネソタ州ミネアポリスのミネソタ大学がんセンターおよびワシントン州ケンモアのBastyr大学で実施されました。 この研究は、ミネソタ大学とバスティア大学のIRB委員会によって承認されました。 2008年1月から2010年6月にかけて、ステージI-IIIの乳がん患者11名がこの試験の狭義の基準を満たし、参加に同意し、最小投与量のコホートから順次登録されました。 3gm、6gm、9gmの各コホートで3名の参加者が試験を完了しました。 参加者のうち2名は、通院が困難であったため、2回目の受診後に試験を辞退した。 研究を完了した9人の女性の特徴は、年齢が38歳から68歳、ER陰性6人、ER陽性3人、ステージI3人、ステージII2人、ステージIII4人の乳がんであった。 研究を完了した女性のうち1人は放射線照射の前に化学療法を受けず、IRBに適格性プロトコル違反が報告された。
2.3. 成果測定
本試験の主要目的は、放射線治療後の設定において、乳がん女性におけるTrametes versicolorの安全性と忍容性を評価することであった。 NCI’s Common Terminology Criteria for Adverse Events V 3.0 (CTCAE)を用いてスコア化されたグレード2以上の治療関連毒性と定義された用量制限毒性（DLT）基準と臨床および実験室の両方の方法で、用量漸増試験の9人の参加者の有害事象（AE）をモニターした。 女性は、製品投与中の有害事象について、毎週、診療時または診療と診療の間の電話によるスクリーニングを受けました。 副次的目的は、放射線治療前後のベースライン、治療中および治療後の免疫学的測定値（全血球数（鑑別付き）、ナチュラルキラー（NK）細胞活性、T制御細胞アッセイ、T/B/NK細胞サブセットアッセイ、食細胞指数、サイトカインレベル）を比較する予備データを収集することであった。 独立標本t検定および一元配置分散分析（Turkey post hoc多重比較付き）を含む統計分析は、GraphPad Prism, Version 5.04 (GraphPad Software, Inc., La Jolla, CA) を使用して実施した。 検出力とサンプルサイズを上げるため、2006年から当センターで実施された観察研究（𝑁=14）のデータを、今回の用量漸増試験（𝑁=9）に組み入れました。 参加資格は両試験とも同一であった(𝑁=23)
2.4. キノコ医薬品
Trametes versicolor凍結乾燥菌糸体粉末は、Fungi Perfecti, Inc, Olympia, WA の Paul Stamets から入手し、Beehive Botanicals (Hayward, WI) がカプセル化した。 各カプセルは500 mgの製品を含んでいた。 FDA IND承認（#75,405）は2007年に取得しました。
2.5. 免疫性発作
2.5.1. Complete Blood Count with Differential
臨床検査（CBC、化学、血清妊娠検査、尿検査）は、Bastyr大学サイトで募集した参加者はワシントン大学検査医学部で、ミネソタ大学サイトで募集した参加者はミネソタ大学フェアビュー診断研究所で行われました
2.5.2。 ナチュラルキラー細胞機能活性
測定された免疫細胞サブセットには、NK細胞活性、T制御細胞アッセイ、T/B/NK細胞サブセットアッセイ、食作用指数、サイトカインレベルが含まれる。 免疫学的アッセイは、両施設から募集した被験者を対象にバスティア大学の研究所で実施されました。 ミネソタ大学総合臨床研究センター（GCRC）で採取された血液は、夜間にBastyr大学へ輸送された。 ミネソタ大学からBastyr大学への輸送血液の品質は、以下の基準で評価された。 Bastyr研究室に到着した時点で48時間以上経過した検体については、リンパ球を分離し、トリパンブルー染色により細胞生存率を測定した。 生存率が80％以上であれば、アッセイを実施した。 生存率が80％未満の場合、検体は拒否された。 末梢血単核細胞（PBMC）をFicoll-Hypaque勾配（密度＝1.070g/mL）により分離し、PBSで2回洗浄し、RPMI1640、10％FBS、2mM L-Glnおよびペニシリン-ストレプトマイシン（1000 U/mL; 1 mg/mL）中にて維持管理した。 これらのPBMCサンプルのNK細胞活性を、K562腫瘍標的細胞を殺す能力によって測定し、公表されている方法に従って、50 : 1、25 : 1、および12.5 : 1のエフェクター対標的（E : T）比で3連単で評価した。 標的細胞は3,3′-dioctadecyloxacarbocyanine perchlorate (DiOC18) で標識し、PBMCエフェクター細胞と4時間共培養した。 標的細胞の自然死を判定するために、K562細胞のみの対照試料を含めた。 インキュベーション後、死んだ細胞を検出するためにpropidium iodideを添加した。 標的細胞が死滅した割合は、それぞれのE .I.の特異的溶血率（PSL）から自発的溶血率を差し引くことによって決定した。 T比。 標準化されたNK細胞活性を表すために、溶解単位は、以下のパラメータを用いて、以前に発表され検証されたソフトウェアプログラムによって計算された：ウェルあたりの標的＝10,000；細胞数あたりのLU＝107；曲線最大＝48；溶解パーセント＝20 ……。 LU20値は、E : LU20 値は、標的細胞の 20%が死滅する E : T 比として定義され、PSL と log E : T 比の用量反応曲線から外挿された。 LU20値は、測定された各血液サンプルのPSL対log E : T ratioの用量反応曲線から推定した。 イムノフェノタイピング PBMCサブセット
PBMC 懸濁液 (5×105 cells) を3本のチューブに入れ、PBSで洗浄、スピンダウンし、上清をピルアウトして細胞ペレットを100μL PBSに再懸濁した。 チューブ1のPBMCはCD3-PC5, CD4-PE, CD8-FITCで、チューブ2はCD3-PC5, CD16-FITC, CD56-PEで、チューブ3はCD14-PC5で染色された。 その後、細胞を冷PBSで2回洗浄し、PBSに0.5mLまで再懸濁し、Beckman Coulter FC500とCXPソフトウェアを用いたフローサイトメトリー分析によりPBMCサブセットのパーセントを決定した
2.6. 臨床試験プロトコル
試験期間は9週間で、放射線療法終了後に開始した。 6週間の製品使用期間の後、3週間の製品未使用期間が設けられました（図1）。 患者さんは、化学療法終了後、放射線療法を開始する前にスクリーニングされ、本試験に参加することが決定されました。 本試験では、6回の臨床研究センターへの来院が必要とされました。 最初の来院は、放射線治療開始前に行われ、ベースラインの検査値が採取された。 放射線治療終了後1週間以内に、参加者は2回目の来院をし、この時に検査値が採取され、9週間の試験が開始された。 6週間分のTv製品が提供され、参加者は2週間間隔で3、4、5回目の来院時に検査値を採取し、製品の忍容性と有害事象を評価した。
Phase I dose escalation study protocol.の項参照。
用量漸増プロトコルは、最低3人の参加者のコホートが6週間、毎日分割でTvを経口摂取するものであった。 最初のコホートは3グラム/日を2回に分けて摂取し、2番目のコホートは6グラム/日を2回に分けて摂取し、3番目のコホートは9グラム/日を3回に分けて摂取した。 1日3グラムは自然療法で最もよく使われる量であり、日本では9グラムも使われている。 この試験の目的は、安全性と忍容性を示す最大耐量（MTD）を決定することでした（表1）。
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表1
3. 結果
3.1. 有害事象
この用量漸増試験の結果、乳癌女性の放射線治療後の設定において、最大9グラム/日のTv製剤は6週間にわたり良好な忍容性を示しました。 有害事象は9件で、7件は軽度、1件は中等度、グレード3の有害事象は1名で不安発作でしたが、試験薬とは無関係であったと思われます（表2）。 その他の軽度有害事象として、一過性の心筋梗塞、心悸亢進、便秘、胸痛、発熱、放射線皮膚炎、風邪/インフルエンザ症状などが報告されています。 3回の投与量すべてにおいて忍容性が高く、参加者は1日3回、最大9カプセルを飲み込むのに困難を感じなかった。 特筆すべきは、吐き気や消化器系の不調が報告されなかったことです。この2つの副作用は、他のTvエキスの以前の臨床試験で報告されています。
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有害事象報告の例………………………………..1.0.0…………………..0.0.0.0.0.0
3.2. 免疫反応
赤血球区画は放射線療法(RT)とTv投与の両方に影響を受けなかった。 絶対赤血球数、ヘモグロビン、ヘマトクリットは、RT開始前日の第1診察時に正常であり、試験の残りの期間中、正常範囲内で下がり続けた。 絶対白血球数および好中球数は、RT前後およびRT後のTv服用中の数週間、すべての女性で概して正常範囲内であった（データは示していない）。 しかし、リンパ球数の絶対値は他のCBCサブセットとは異なるパターンを示した。 2006年以降に我々の施設で行われた研究では、適格基準は同一であったため、検出力を高めるために、RTがステージI-IIIの乳癌女性に免疫異常をもたらすことを示した我々の観察研究（𝑁=14）のデータと我々の現在の用量漸増研究（𝑁=9）のデータを統合しました。 乳房手術と化学療法後にステージI-IIIの乳癌状態になり、その後放射線治療を受けた両研究の合計23人の女性について、リンパ球はRT前は正常範囲内だったが、RT後は異常な低レベルに低下していた。 23人の被験者全員の平均リンパ球数は、放射線治療前は1.027±0.298で、放射線治療後は0.681±0.254と20％減少し、その差は統計的に有意であった。 用量漸増試験では、Tvの2つの高用量（6gと9g）の経口投与により、リンパ球数の回復が早かった（図2）。 観察群では、リンパ球数は徐々に回復したが、平均リンパ球数は、治療後6週間でTv6 gmと9 gmのコホートより低いままであった。 各線量コホートの数が少ないため（𝑁=3）、統計的有意性は放射線治療後2週間の時点で観察群と9g群との間にのみ認められた。 放射線療法は、手術と化学療法を終了したI-III期乳癌の女性において、リンパ球の絶対数を統計的に有意に減少させた（図2参照）。
ナチュラルキラー細胞の機能活性は、手術前より劇的に低下しました。 観察研究（14名）または用量漸増試験（9名）の最初の2回の訪問を完了した乳がん患者23名全員について、RT後に 図3は、平均NK細胞活性が、再臨床前に19.941±18.959であり、再臨床後（𝑁=23）9.872±13.454に減少していることを示している。 この減少は統計的に有意であった（𝑡(44)=2.077, 𝑃=0.043）。 6gTv投与群ではNK細胞活性の増加傾向が見られた。
放射線療法は107分割線量をLU20で計算したLUによって表されるNK細胞機能を統計的に有意に低下させることがわかった。 LU20は、標的細胞（K562）に対して20％の特異的溶解を達成するために必要なエフェクター細胞（NK）の数である。 したがって、LU20が小さいほど、NK細胞の効果が高いということになる。 この結果の解釈は、キノコを補給した際の個人差のある反応により困難であったかもしれない。 6g投与群では一時的にNK細胞活性が上昇する傾向が見られた（図3参照）
また、第I相用量漸増試験を終了した9名の患者において、放射線治療とTv投与がT、B、NK細胞集団に及ぼす影響も測定した。 WBCとフローサイトメトリーのイムノフェノタイピングデータから、絶対値（mm3）を算出した。 放射線療法は、CD4+ と CD8+ T 細胞、CD19+ B 細胞、および CD16+/56+ NK 細胞集団に対して、重要な影響を及ぼさなかった。 観察研究ではイムノフェノタイピングが行われなかったので、複合（放射線照射前と後）スコアの数は、線量漸増試験に参加した人の数である（𝑁=9）。 CD8+T細胞の数は、放射線治療の前後で統計的な差はなかった（図4）。 しかし、Tv補充群では末梢血中のCD8+ T細胞およびCD19+ B細胞の増加が観察された。 9週間の用量漸増試験におけるCD8+ T細胞数は、3gまたは6gの両群と比較して、9gmのTv用量コホートで増強された。 一元配置分散分析（One-way ANOVA）を用いて、治療期間（2-4-6週間）における投与量グループ間の全体的な差異を分析した。 その結果、CD8+細胞傷害性T細胞は、3gと6gの両群と比較して、9g群では統計的に有意に増加した（𝐹(2,6)=42.04, 𝑃=0.0003）。 3g群と6g群の差は有意ではなかった（図4参照）。
8名の用量漸増者の合成スコアによると、放射線療法はB細胞数を有意に変化させていない（図5）。 しかし、Tv投与はCD19+ B細胞の増加と関連していた。 治療期間（2-4-6週間）における投与量群間の総合的な差異を分析するために一元配置分散分析（One-way ANOVA）が使用された。 その結果、6g投与群では3g投与群に比べ、CD19+ B細胞が統計的に有意に増加した。 3g投与群と9g投与群、6g投与群と9g投与群の間には有意な差は見られなかった（図5参照）。
CD16+56+NK細胞数に関して、放射線治療またはTv投与による著しい変化は認められなかった（図6）。 NK細胞活性はRTによって減少し、6グラムTv投与コホートでは増加したが（図3）、NK細胞集団はこれらの治療によって有意な影響を受けないようなので、このデータはNK細胞活性の増強はNK細胞数の治療誘発性変化によるものではないことを示唆している。 NK細胞集団は、放射線治療またはTvの経口投与によって影響を受けなかった（図6参照）
4. 考察
この研究から得られた知見は、乳がん治療のための放射線療法後の女性において、3、6、および9グラムの用量のTrametes versicolor（Tv）製剤の経口投与の安全性とこの療法の重大な有害事象がないことを立証した。 本研究は、乳癌に対する標準的な胸部放射線療法が赤血球区画や好中球に影響を与えないが、リンパ球減少やNK細胞機能低下などの特異的な免疫不全を誘発するという我々の以前の報告を確認するものである 。 NK細胞療法は、NKエフェクターの迅速な細胞溶解作用と、幅広い悪性腫瘍に適用できる可能性を利用して、有望な抗がん治療法として世界的に台頭してきている。 私たちは、NK細胞活性の低下は、NK細胞の数とは無関係であることを新たに発見した。 ここで、我々は、RTがNK細胞1個あたりのNK細胞活性を低下させることを明らかにした。 Tvを6g/dayと9g/dayの高用量で経口投与すると、リンパ球とNK細胞活性の回復が早く、CD8+T細胞とCD19+B細胞の数が増加した。 CD16+/56+NK細胞の数にはTvの明らかな効果はなく、その機能的活性にのみ効果があった。 Tvの用量が高いほど免疫活性が顕著になる傾向があるが、この第I相用量漸増試験は、免疫マーカーの用量依存的な変化を評価するようにはデザインされていない。 線量に関連した傾向を示す、各用量コホート群につき3人の乳がん患者の少量サンプルによる予備データから、6グラムのTvは放射線治療後の免疫回復を早めるかもしれないという検証可能な仮説が導き出された。 この第I相試験の結果は、第II相ランダム化比較用量反応試験を進めるための基盤となるものである。
この試験はTrametes versicolorの1日9グラムまでの安全性を示したが、用量漸増試験は最大耐量（MDT）を評価するために設計されており、したがってこの試験では最高用量での安全性と耐性を決定していない。 12g以上のコホートへの女性の採用は、複数の制限要因により達成されませんでした。 まず、女性がこの試験に登録するためには、非常に厳しい適格基準を満たし、治療プロトコルで手術、化学療法、放射線治療を受けている必要がありました。 現在、乳がんと診断された多くの女性は、3剤併用療法を受けていません。 多くの女性はステージ1の乳がんと診断され、乳腺摘出術と放射線治療を受け、オンコタイプスコアが低ければ、化学療法を受けません。 さらに、多くの女性が他の研究に勧誘され、追加の研究への登録依頼が飽和状態になっていました。 最も重要なことは、化学療法と放射線療法という長期の治療レジメンを終えた女性は、さらに6回の大学訪問を必要とする9週間の研究への参加に消極的であることがわかりました。
第1相試験のデータは、Tvが乳がん患者にとって放射線療法関連の免疫不全を修正しうる安全な免疫療法であることを示唆するものです。 我々の知見に基づき、放射線治療後にTvキノコ療法を経口投与すると、リンパ球数およびNK細胞の殺腫瘍活性を高める可能性があります。 乳がん初回治療後の再発は、自然免疫系と適応免疫系の欠陥が関係している可能性があります。 当センターの研究により、Trametes versicolorはがん治療において重要な応用性を持つ新規の免疫療法であることが示されつつあります。
利益相反
著者らは利益相反がないことを宣言する。
謝辞
この研究は、国立衛生研究所/国立補完代替医療センター（U19 AT 1998）およびGateway for Cancer Research Grant no.による資金の支援により行われたものである。 G-04-002. また、MN大学家庭医学科のRebekah Pratt氏の編集支援とDaniel Strenge氏の貢献に感謝する
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