Fluorescence

La fluorescence est une luminescence que l’on retrouve surtout comme phénomène optique dans les corps froids, dans lequel l’absorption moléculaire d’un photon à une certaine longueur d’onde déclenche l’émission d’un autre photon de plus grande longueur d’onde. La substance qui fluoresce est appelée fluorophore. La différence d’énergie entre les photons absorbés et émis se transforme en vibrations moléculaires ou en chaleur. Habituellement, le photon absorbé se situe dans le domaine ultraviolet et la lumière émise dans le domaine visible, mais cela dépend du fluorophore utilisé et d’autres facteurs.

La fluorescence doit son nom au minéral fluorite, composé de fluorure de calcium, qui présente souvent ce phénomène. Une variété d’autres minéraux et de matériaux organiques sont également fluorescents, et ils sont utilisés pour un certain nombre d’applications différentes. Par exemple, la fluorescence est utile pour éclairer et marquer les molécules en chimie analytique et en biochimie. Les fluorophores ont été utilisés pour marquer des cellules, des anticorps et d’autres structures biologiques, et pour déterminer leurs structures et leurs modes d’action.

Exemples de matériaux fluorescents

Les pierres précieuses, les minéraux, les fibres et de nombreux autres matériaux que l’on peut rencontrer en médecine légale ou en relation avec divers objets de collection peuvent avoir une fluorescence distinctive ou être fluorescents différemment sous les ultraviolets à ondes courtes, les ultraviolets à ondes longues ou les rayons X.

De nombreux types de calcite et d’ambre seront fluorescents sous les UV à ondes courtes. Les rubis, les émeraudes et le diamant Hope présentent une fluorescence rouge sous les UV à ondes courtes ; les diamants émettent également de la lumière sous les rayons X.

Le pétrole brut (pétrole) présente une fluorescence dans une gamme de couleurs, allant du brun terne pour les huiles lourdes et les goudrons jusqu’au jaune vif et au blanc bleuté pour les huiles très légères et les condensats. Ce phénomène est utilisé dans les forages d’exploration pétrolière pour identifier de très petites quantités de pétrole dans les déblais de forage et les carottes.

Les liquides organiques tels que les mélanges d’anthracène dans le benzène ou le toluène, ou de stilbène dans les mêmes solvants, deviennent fluorescents sous l’effet d’une irradiation aux rayons ultraviolets ou gamma. Les temps de décroissance de cette fluorescence sont de l’ordre de la nanoseconde puisque la durée de la lumière dépend de la durée de vie des états excités de la matière fluorescente, en l’occurrence l’anthracène ou le stilbène.

Applications

Il existe de nombreux composés naturels et synthétiques qui présentent une fluorescence, et ils ont un certain nombre d’applications. Certains animaux des grands fonds, comme la laie grise, utilisent la fluorescence.

L’éclairage

Le tube fluorescent commun repose sur la fluorescence. A l’intérieur du tube en verre se trouve un vide partiel et une petite quantité de mercure. Une décharge électrique dans le tube provoque l’émission de lumière par les atomes de mercure. La lumière émise se situe dans la gamme des ultraviolets (UV), est invisible et est nocive pour la plupart des organismes vivants. Le tube est recouvert d’une couche de matériau fluorescent, appelé phosphore, qui absorbe les ultraviolets et réémet de la lumière visible. L’éclairage fluorescent est très économe en énergie par rapport à la technologie incandescente, mais les spectres produits peuvent faire paraître certaines couleurs peu naturelles.

Au milieu des années 1990, des diodes électroluminescentes blanches (DEL) sont devenues disponibles, qui fonctionnent selon un processus similaire. En général, le semi-conducteur émetteur de lumière proprement dit produit de la lumière dans la partie bleue du spectre, qui frappe un composé phosphoreux déposé sur la puce ; le phosphore émet une fluorescence dans la partie verte à rouge du spectre. La combinaison de la lumière bleue qui traverse le phosphore et de la lumière émise par le phosphore produit une émission nette de lumière blanche.

On dit que le lampadaire moderne à vapeur de mercure a évolué à partir de la lampe fluorescente.

Les bâtons lumineux oxydent l’ester d’oxalate de phényle pour produire de la lumière.

L’éclairage fluorescent compact (CFL) est identique à toute lampe fluorescente typique avec des avantages. Il est auto-ballasté et utilisé pour remplacer les incandescents dans la plupart des applications. Elles produisent un quart de la chaleur par lumen que les ampoules à incandescence et durent environ cinq fois plus longtemps. Ces ampoules contiennent du mercure et doivent être manipulées et éliminées avec soin.

Chimie analytique

La fluorescence dans plusieurs longueurs d’onde peut être détectée par un détecteur à réseau, pour détecter les composés du flux HPLC. De même, les plaques de chromatographie en couche mince (TLC) peuvent être visualisées si les composés ou un réactif colorant sont fluorescents.

Les empreintes digitales peuvent être visualisées avec des composés fluorescents tels que la ninhydrine.

Biochimie et médecine

Les molécules biologiques peuvent être marquées avec un groupe chimique fluorescent (fluorophore) par une réaction chimique simple, et la fluorescence du tag permet une détection sensible et quantitative de la molécule. Exemples :

• La microscopie à fluorescence des tissus, des cellules ou des structures subcellulaires est réalisée en marquant un anticorps avec un fluorophore et en permettant à l’anticorps de trouver son antigène cible dans l’échantillon. Le marquage de plusieurs anticorps avec différents fluorophores permet la visualisation de plusieurs cibles dans une seule image.
• Séquençage automatisé de l’ADN par la méthode de terminaison de chaîne ; chacune des quatre bases différentes de terminaison de chaîne a sa propre étiquette fluorescente spécifique. Lorsque les molécules d’ADN marquées sont séparées, le marqueur fluorescent est excité par une source UV, et l’identité de la base terminant la molécule est identifiée par la longueur d’onde de la lumière émise.
• Détection de l’ADN : le composé bromure d’éthidium, lorsqu’il est libre de changer de conformation en solution, est très peu fluorescent. La fluorescence du bromure d’éthidium est fortement augmentée lorsqu’il se lie à l’ADN, ce composé est donc très utile pour visualiser l’emplacement des fragments d’ADN dans l’électrophorèse sur gel d’agarose. Le bromure d’éthidium peut être toxique ; une alternative plus sûre est le colorant SYBR Green.
• La puce à ADN
• Immunologie : Un anticorps a un groupe chimique fluorescent attaché, et les sites (par exemple, sur un spécimen microscopique) où l’anticorps s’est lié peuvent être vus, et même quantifiés, par la fluorescence.
• FACS (fluorescent-activated cell sorting)
• La fluorescence a été utilisée pour étudier la structure et les conformations de l’ADN et des protéines avec des techniques telles que le transfert d’énergie par résonance de fluorescence, qui mesure la distance au niveau de l’angström. Ceci est particulièrement important dans les complexes de biomolécules multiples.
• L’équorine, de la méduse Aequorea victoria, produit une lueur bleue en présence d’ions Ca2+ (par une réaction chimique). Elle a été utilisée pour imager le flux de calcium dans les cellules en temps réel. Le succès de l’aequorin a incité à poursuivre les recherches sur A. victoria et a conduit à la découverte de la protéine fluorescente verte (GFP), qui est devenue un outil de recherche extrêmement important. La GFP et les protéines apparentées sont utilisées comme indicateurs d’un grand nombre d’événements biologiques, notamment la localisation subcellulaire. Les niveaux d’expression génétique sont parfois mesurés en liant un gène de production de la GFP à un autre gène.

De plus, de nombreuses molécules biologiques ont une fluorescence intrinsèque qui peut parfois être utilisée sans qu’il soit nécessaire d’attacher une étiquette chimique. Parfois, cette fluorescence intrinsèque change lorsque la molécule se trouve dans un environnement spécifique, de sorte que la distribution ou la liaison de la molécule peut être mesurée. La bilirubine, par exemple, est très fluorescente lorsqu’elle est liée à un site spécifique de l’albumine sérique. La protoporphyrine de zinc, formée dans les globules rouges en développement à la place de l’hémoglobine lorsque le fer n’est pas disponible ou que le plomb est présent, a une fluorescence vive et peut être utilisée pour détecter ces problèmes.

En 2006, le nombre d’applications de la fluorescence augmente dans le domaine de la biologie biomédicale et des sciences connexes. Les méthodes d’analyse dans ces domaines se développent également, bien qu’avec une nomenclature de plus en plus malheureuse sous forme d’acronymes tels que : FLIM, FLI, FLIP, CALI, FLIE, FRET, FRAP, FCS, PFRAP, smFRET, FIONA, FRIPS, SHREK, SHRIMP, TIRF. La plupart de ces techniques reposent sur des microscopes à fluorescence. Ces microscopes utilisent des sources lumineuses de haute intensité, généralement des lampes au mercure ou au xénon, des LED ou des lasers, pour exciter la fluorescence dans les échantillons observés. Des filtres optiques séparent ensuite la lumière d’excitation de la fluorescence émise, qui sera détectée à l’œil nu, par une caméra (CCD) ou d’autres détecteurs de lumière (tubes photomultiplicateurs, spectrographes, etc.). De nombreuses recherches sont en cours pour améliorer les capacités de ces microscopes, les sondes fluorescentes utilisées et les applications auxquelles ils sont destinés. Les microscopes confocaux, qui utilisent un trou d’épingle pour réaliser une section optique – offrant une vue quantitative et 3D de l’échantillon – sont particulièrement remarquables.

Sécurité

Les ampoules fluorescentes créent beaucoup moins de chaleur résiduelle que les ampoules à incandescence et halogènes. Les ampoules halogènes sont impliquées dans un grand nombre d’incendies, et les ampoules à incandescence présentent également un risque d’incendie plus élevé que les ampoules fluorescentes, en raison de la chaleur résiduelle. Les lampes peuvent basculer accidentellement, ou parfois par des événements tels que des tremblements de terre. L’utilisation d’ampoules fluorescentes peut donc être un moyen de prévenir les incendies accidentels. Cependant, les ampoules fluorescentes peuvent contenir du mercure, et le bris d’une telle ampoule pourrait entraîner un déversement de mercure coûteux.

Considérations théoriques

Photochimie

La fluorescence se produit lorsqu’une molécule ou un point quantique se relaxe vers son état fondamental après avoir été excité électroniquement.

Excitation : S 0 + h ν → S 1 {\displaystyle S_{0}+h\nu \to S_{1}}

Fluorescence (émission) : S 1 → S 0 + h ν {\displaystyle S_{1}\to S_{0}+h\nu } , ici h ν {\displaystyle h\nu } est un terme générique pour l’énergie des photons où : h = constante de Planck et ν {\displaystyle \nu } = fréquence de la lumière. (Les fréquences spécifiques de la lumière excitante et émise dépendent du système particulier.)

L’état S0 est appelé état fondamental du fluorophore (molécule fluorescente) et S1 est son premier état excité (électroniquement).

Une molécule dans son état excité, S1, peut se relaxer par diverses voies concurrentes. Elle peut subir une  » relaxation non radiative  » dans laquelle l’énergie d’excitation est dissipée sous forme de chaleur (vibrations) vers le solvant. Les molécules organiques excitées peuvent également se relaxer par conversion en un état triplet qui peut ensuite se relaxer par phosphorescence ou par une étape secondaire de relaxation non radiative.

La relaxation d’un état S1 peut également se produire par interaction avec une seconde molécule par extinction de la fluorescence. L’oxygène moléculaire (O2) est un extincteur de fluorescence extrêmement efficace en raison de son état fondamental triplet inhabituel.

Les molécules qui sont excitées par l’absorption de la lumière ou par un processus différent (par exemple en tant que produit d’une réaction) peuvent transférer de l’énergie à une seconde molécule  » sensibilisée « , qui est convertie à son état excité et peut alors fluorescer. Ce processus est utilisé dans les bâtons lumineux.

Rendement quantique de fluorescence

Le rendement quantique de fluorescence donne l’efficacité du processus de fluorescence. Il est défini comme le rapport entre le nombre de photons émis et le nombre de photons absorbés.

Φ = # p h o t o n s e m i t t e d # p h o t o n s a b s o r b e d {\displaystyle \Phi ={\frac {\rm {\#\ photons\ émis}{\rm {\#\ photons\ absorbés}}}}.

Le rendement quantique maximal de fluorescence est de 1,0 (100 %) ; chaque photon absorbé entraîne l’émission d’un photon. Les composés dont le rendement quantique est de 0,10 sont encore considérés comme assez fluorescents. Une autre façon de définir le rendement quantique de la fluorescence, est par les taux de désintégration de l’état excité:

k f ∑ i k i {\displaystyle {\frac {{k}_{f}}{\sum _{i}{k}_{i}}}}

où k f {\displaystyle {k}_{f}} est le taux d’émission spontanée de rayonnement et

∑ i k i {\displaystyle \sum _{i}{k}_{i}}}

est la somme de tous les taux de désintégration des états excités. D’autres taux de désintégration de l’état excité sont causés par des mécanismes autres que l’émission de photons et sont donc souvent appelés « taux non radiatifs », qui peuvent inclure :l’extinction dynamique par collision, l’interaction dipôle-dipôle en champ proche (ou transfert d’énergie par résonance), la conversion interne et le croisement intersystème. Ainsi, si le taux de l’une des voies change, cela affectera à la fois la durée de vie de l’état excité et le rendement quantique de fluorescence.

Le rendement quantique de fluorescence est mesuré par comparaison à un standard dont la quantologie est connue ; le sel de quinine, le sulfate de quinine, dans une solution d’acide sulfurique est un standard de fluorescence commun.

Durée de vie de la fluorescence

La durée de vie de la fluorescence désigne le temps moyen pendant lequel la molécule reste dans son état excité avant d’émettre un photon. La fluorescence suit généralement une cinétique de premier ordre :

= 0 e – Γ t , {\displaystyle \left=\left_{0}e^{-\Gamma t},}

où {\displaystyle \left} est la concentration de molécules à l’état excité au temps t {\displaystyle t} , 0 {\displaystyle \left_{0}} est la concentration initiale et Γ {\displaystyle \Gamma } est le taux de décroissance ou l’inverse de la durée de vie de la fluorescence. Il s’agit d’un exemple de décroissance exponentielle. Divers processus radiatifs et non radiatifs peuvent dépeupler l’état extrait. Dans ce cas, le taux de décroissance total est la somme de tous les taux :

Γ t o t = Γ r a d + Γ n r a d {\displaystyle \Gamma _{tot}=\Gamma _{rad}+\Gamma _{nrad}}.

où Γ t o t {\displaystyle \Gamma _{tot}} est le taux de désintégration total, Γ r a d {\displaystyle \Gamma _{rad}} le taux de désintégration radiative et Γ n r a d {\displaystyle \Gamma _{nrad}} le taux de désintégration non-radiative. Il est similaire à une réaction chimique de premier ordre dans laquelle la constante de vitesse de premier ordre est la somme de toutes les vitesses (un modèle cinétique parallèle). Si le taux d’émission spontanée ou l’un des autres taux est rapide, la durée de vie est courte. Pour les composés fluorescents couramment utilisés, les temps de décroissance typiques des états excités qui émettent des photons avec des énergies allant de l’UV au proche infrarouge sont compris entre 0,5 et 20 nanosecondes. La durée de vie de la fluorescence est un paramètre important pour les applications pratiques de la fluorescence telles que le transfert d’énergie par résonance de fluorescence.

Règles

Il existe plusieurs règles qui traitent de la fluorescence. La règle de Kasha-Vavilov dicte que le rendement quantique de la luminescence est indépendant de la longueur d’onde du rayonnement excitant.

Cette règle n’est pas toujours valable et est violée sévèrement dans de nombreuses molécules simples. Une affirmation un peu plus fiable, bien que comportant encore des exceptions, est que le spectre de fluorescence présente une très faible dépendance à la longueur d’onde du rayonnement d’excitation.

Voir aussi

• Fluorescéine
• Lampe fluorescente
• Lumière
• Phosphorescence
• Rayon X

• Lakowicz, Joseph R. 2006. Principes de la spectroscopie de fluorescence, 3e édition, New York : Springer. ISBN 978-0387312781
• Turro, Nicholas J. 1991. La photochimie moléculaire moderne. Mill Valley, CA : University Science Books. ISBN 0935702717
• Valeur, Bernard. 2002. Fluorescence moléculaire : Principes et applications. Weinheim : Wiley-VCH. ISBN 352729919X

Tous les liens ont été récupérés le 14 avril 2017.

• Fluorophores.org La base de données des colorants fluorescents
• Fluorescence sur Scienceworld
• Concepts de base de la fluorescence