Essai clinique de phase 1 de Trametes versicolor chez les femmes atteintes d’un cancer du sein

Abstract

Introduction. Des préparations administrées par voie orale à partir du champignon Trametes versicolor (Tv) ont été supposées améliorer la réponse immunitaire chez les femmes atteintes d’un cancer du sein après une chimiothérapie et une radiothérapie standard. Méthodes. Une étude de phase I, bicentrique, avec escalade de dose a été réalisée pour déterminer la dose maximale tolérée d’une préparation de Tv lorsqu’elle est prise quotidiennement en doses divisées pendant 6 semaines après la fin récente de la radiothérapie. Onze participants ont été recrutés et neuf femmes ont terminé l’étude. Chaque cohorte était composée de trois participantes ayant reçu l’une des trois doses de Tv (3, 6 ou 9 grammes). Les données immunitaires ont été recueillies avant et après la radiothérapie, à trois moments du traitement et après une période d’élimination de trois semaines. Résultats. Neuf événements indésirables ont été signalés (7 légers, 1 modéré et 1 grave), ce qui suggère que Tv a été bien toléré. Les résultats immunologiques ont indiqué des tendances à (1) l’augmentation du nombre de lymphocytes à 6 et 9 grammes/jour ; (2) l’augmentation de l’activité fonctionnelle des cellules tueuses naturelles à 6 grammes/jour ; (3) des augmentations liées à la dose des cellules T CD8+ et des cellules B CD19+, mais pas des cellules T CD4+ ou des cellules NK CD16+56+. Conclusion. Ces résultats montrent que jusqu’à 9 grammes/jour d’une préparation Tv est sûre et tolérable chez les femmes atteintes d’un cancer du sein dans le cadre d’un traitement post-primaire. Cette préparation Tv peut améliorer le statut immunitaire des patientes immunodéprimées atteintes d’un cancer du sein après un traitement oncologique primaire standard.

1. Introduction

Trametes versicolor (Tv), également connu sous le nom de Coriolus versicolor et communément appelé queue de dinde, est une espèce de champignon à partir duquel des préparations ont été faites qui ont une longue histoire d’utilisation dans la médecine traditionnelle asiatique . Deux fractions de protéoglycanes, le polysaccharide-K (PSK) et le polysaccharide-peptide (PSP), sont des extraits d’eau chaude similaires de Tv dont l’activité anticancéreuse a été rapportée. Au Japon, le PSK est prescrit de façon routinière aux patients atteints de cancer, pendant et après la radiothérapie et la chimiothérapie. C’est également une pratique courante chez de nombreux médecins naturopathes (NDs) et oncologues intégratifs (MDs) aux États-Unis de prescrire la Tv entière, lyophilisée, aux patientes atteintes d’un cancer du sein. On suppose que l’activité immunologique de Tv est le principal mécanisme sous-jacent responsable de ses effets antitumoraux ainsi que de son impact sur les taux de survie. Le mécanisme d’action de Trametes versicolor implique le renforcement des réponses immunitaires innées et adaptatives, au moins en partie par l’intermédiaire de l’activité agoniste des récepteurs Toll-like 2. Les études précliniques sur les animaux et les données cliniques préliminaires soutiennent l’hypothèse selon laquelle les dérivés de Tv peuvent être bénéfiques dans le traitement des cancers à récepteurs œstrogéniques négatifs et positifs en atténuant les effets dépressifs immunologiques du traitement et en améliorant la survie sans maladie via le renforcement de la surveillance immunologique et le dépassement de la tolérance aux antigènes tumoraux .

Comprendre comment les facteurs immunologiques sont influencés par les traitements du cancer du sein suggère des domaines d’intérêt prometteurs dans le développement de thérapies d’appoint pour renforcer les réponses immunitaires antitumorales. Des données récentes démontrent que certaines classes de médicaments chimiothérapeutiques provoquent la mort immunogène des cellules tumorales, ce qui entraîne une amélioration de la présentation croisée des antigènes et une stimulation de la réponse immunitaire antitumorale. Des preuves suggèrent que les cellules NK jouent un rôle important dans la prévention du cancer du sein précoce et métastatique. On a constaté que certaines patientes atteintes d’un cancer du sein n’avaient pas d’activité des cellules NK contre les cellules cibles K562. Les données actuelles suggèrent que les patientes atteintes d’un cancer du sein qui ont subi une chirurgie, une chimiothérapie et une radiothérapie présentent un déficit immunologique. Andersen et al. ont signalé que les niveaux de stress chez les patientes atteintes d’un cancer du sein prédisaient de manière significative une plus faible lyse des cellules NK ainsi qu’une diminution de la réponse proliférative aux lymphocytes du sang périphérique. Notre étude d’observation précédente faite a confirmé que la lymphopénie et la faible activité des cellules NK étaient présentes tout au long des 6 semaines après la fin de la radiothérapie .

Pour mieux comprendre le bénéfice potentiel de Trametes versicolor chez les femmes atteintes d’un cancer du sein, une étude d’escalade de dose pour évaluer la sécurité et la tolérance était nécessaire. À cette fin, une équipe multidisciplinaire de l’Université du Minnesota et de l’Université Bastyr a réalisé un essai de phase 1 à dose croissante pour déterminer la sécurité et la dose maximale tolérée de Tv chez les femmes diagnostiquées avec un cancer du sein qui ont subi un traitement standard pour le cancer du sein et qui étaient prêtes à participer à une étude de neuf semaines après la radiothérapie.

2. Méthodes

2.1. Escalade de dose de l’étude

Un plan de phase 1 standard a été utilisé avec 3 sujets par niveau de dose jusqu’à ce que la MTD (dose maximale tolérée) soit atteinte. Le calendrier d’escalade de dose pour chaque cohorte de Tv était un 3 grammes (la dose la plus couramment utilisée) ; 6 grammes ; 9 grammes ; 12 grammes ; 18 grammes ; 24 grammes. Cette étude a recruté à travers la cohorte de neuf grammes seulement (𝑁=9).

2.2. Participants à l’étude

Les femmes âgées de 21 à 75 ans, diagnostiquées avec un cancer du sein de stade I, II ou III et qui avaient subi une chirurgie et une chimiothérapie et étaient prêtes à commencer la radiothérapie, ont été inscrites à l’étude après avoir fourni un consentement écrit. L’éligibilité comprenait également la volonté de suivre un régime alimentaire cohérent tout au long de l’étude et d’éviter les sources alimentaires de champignons et d’autres produits à base de plantes ayant des effets immuno-modulateurs signalés pendant la radiothérapie et jusqu’à la fin de l’étude. Les fonctions hématologiques, rénales et hépatiques de base devaient se situer dans les limites normales avant de s’inscrire à l’étude. L’étude a été menée au Cancer Center de l’Université du Minnesota à Minneapolis, Minnesota et à l’Université Bastyr à Ken more, Washington. L’étude a été approuvée par les comités IRB de l’Université du Minnesota et de l’Université Bastyr. Entre janvier 2008 et juin 2010, onze femmes atteintes d’un cancer du sein de stade I-III ont satisfait aux critères étroits de cet essai, ont consenti à y participer et ont été recrutées de manière séquentielle à partir de la cohorte à plus faible dose. Trois participantes de chacune des cohortes 3 gm, 6 gm et 9 gm ont terminé l’étude. Deux des participantes se sont retirées de l’étude après la deuxième visite en raison de difficultés de transport vers la clinique. Les caractéristiques des neuf femmes qui ont terminé l’étude comprenaient une tranche d’âge allant de 38 à 68 ans ; six ER négatifs et trois ER positifs ; trois cancers du sein de stade I ; deux de stade II et quatre de stade III. Une des femmes qui a terminé l’étude n’a pas subi de chimiothérapie avant la radiation, et une violation du protocole d’admissibilité a été signalée à l’IRB.

2.3. Mesures des résultats

L’objectif primaire de l’étude était d’évaluer la sécurité et la tolérance de Trametes versicolor chez les femmes atteintes d’un cancer du sein dans le cadre de la post-radiothérapie. Les neuf participantes à l’étude d’escalade de dose ont été suivies pour les événements indésirables (EI) en utilisant à la fois des méthodes cliniques et de laboratoire et des critères de toxicité limitant la dose (DLT) définis comme toute toxicité liée au traitement de grade 2 ou plus, telle que notée en utilisant les critères de terminologie commune des événements indésirables V 3.0 (CTCAE) du NCI. Les femmes ont été soumises à un dépistage hebdomadaire des effets indésirables pendant l’administration du produit, soit lors de leur visite à la clinique, soit par dépistage téléphonique entre les visites. L’objectif secondaire était de recueillir des données préliminaires comparant les valeurs de base avant et après la radiothérapie, les mesures immunologiques pendant et après le traitement, notamment la formule sanguine complète avec différentiel, l’activité des cellules tueuses naturelles (NK), le dosage des cellules régulatrices T, le dosage des sous-ensembles de cellules T/B/NK, l’indice phagocytaire et les taux de cytokines. L’analyse statistique, y compris les tests t d’échantillons indépendants et les ANOVA à une voie avec comparaison multiple post hoc de Turkey, a été réalisée à l’aide de GraphPad Prism, version 5.04 (GraphPad Software, Inc., La Jolla, CA). Afin d’augmenter la puissance et la taille de l’échantillon, les données d’une étude observationnelle (𝑁=14) menée par nos centres depuis 2006 ont été combinées avec l’étude actuelle d’escalade de dose (𝑁=9). Les critères d’éligibilité étaient identiques pour les deux études (𝑁=23).

2.4. Produit médicamenteux à base de champignons

La poudre mycélienne lyophilisée de Trametes versicolor a été obtenue auprès de Paul Stamets chez Fungi Perfecti, Inc, Olympia, WA et a été encapsulée par Beehive Botanicals (Hayward, WI). Chaque capsule contenait 500 mg de produit. L’approbation FDA IND (# 75,405) a été obtenue en 2007.

2.5. Crises immunitaires

2.5.1. Numération sanguine complète avec différentiel

Les tests de laboratoire clinique (NFS, chimie, tests de grossesse sériques et analyse d’urine) ont été effectués au département de médecine de laboratoire de l’Université de Washington pour les participants recrutés sur le site de l’Université Bastyr et au laboratoire de diagnostic Fairview de l’Université du Minnesota pour les participants recrutés sur le site de l’U du Minnesota.

2.5.2. Activité fonctionnelle des cellules tueuses naturelles

Le sous-ensemble de cellules immunitaires mesuré comprenait l’activité des cellules NK, le dosage des cellules régulatrices T, le dosage du sous-ensemble de cellules T/B/NK, l’indice phagocytaire et les niveaux de cytokines. Les tests immunologiques ont été réalisés au laboratoire de l’Université Bastyr pour les sujets recrutés sur les deux sites. Le sang collecté au Centre général de recherche clinique (GCRC) de l’Université du Minnesota a été envoyé en une nuit à l’Université Bastyr. La qualité du sang transporté de l’Université du Minnesota à Bastyr a été évaluée selon les critères suivants. Pour les échantillons de plus de 48 heures à leur arrivée au laboratoire de Bastyr, les lymphocytes ont été isolés et la viabilité cellulaire a été déterminée par coloration au bleu trypan. Si la viabilité était supérieure à 80%, le test était effectué. Si la viabilité était inférieure à 80%, les spécimens étaient rejetés. Les cellules mononucléaires du sang périphérique (PBMC) ont été isolées par gradient Ficoll-Hypaque (densité = 1,070 g/mL), lavées deux fois dans du PBS et maintenues dans du RPMI 1640, 10% FBS avec 2 mM de L-Gln et de la pénicilline-streptomycine (1000 U/mL ; 1 mg/mL). L’activité des cellules NK de ces échantillons de PBMC, mesurée par la capacité à tuer les cellules cibles de la tumeur K562, a été évaluée en trois exemplaires à des ratios effecteur/cible (E : T) de 50 : 1, 25 : 1 et 12,5 : 1 selon des méthodes publiées. Les cellules cibles ont été marquées avec du perchlorate de 3,3′-dioctadécyloxacarbocyanine (DiOC18) et mises en coculture avec des cellules effectrices PBMC pendant quatre heures. Un échantillon témoin contenant uniquement des cellules K562 a été inclus pour déterminer la mort spontanée des cellules cibles. Après incubation, de l’iodure de propidium a été ajouté pour détecter les cellules mortes. Le pourcentage de cellules cibles tuées a été déterminé en soustrayant le pourcentage de lyse spontanée du pourcentage de lyse spécifique (PSL) du rapport E : T. Pour représenter l’activité normalisée des cellules NK, les unités lytiques ont été calculées par un logiciel publié et validé précédemment, en utilisant les paramètres suivants : cible par puits = 10 000 ; LU par nbre de cellules = 107 ; maximum de la courbe = 48 ; pourcentage de lyses = 20 . Les valeurs LU20, définies comme le rapport E : T auquel 20 % des cellules cibles meurent, ont été extrapolées à partir des courbes dose-réponse de la LPS en fonction du logarithme du rapport E : T pour chaque échantillon de sang analysé .

2.5.3. Immunophénotypage des sous-ensembles de PBMC

Des suspensions de PBMC (5×105 cellules) ont été mises dans 3 tubes, lavées dans du PBS, essorées, surnageants comme piratés et culots cellulaires remis en suspension dans 100 μL de PBS. Les PBMC du tube 1 ont été colorées par CD3-PC5, CD4-PE et CD8-FITC ; tube 2 : CD3-PC5, CD16-FITC et CD56-PE ; tube 3 : CD14-PC5. Les tubes ont été vortexés brièvement, couverts et incubés sur la glace pendant 15 minutes, après quoi les cellules ont été lavées dans du PBS froid deux fois, remises en suspension à 0,5 ml dans du PBS et le pourcentage de sous-ensembles de PBMC déterminé par analyse cytométrique de flux à l’aide d’un Beckman Coulter FC500 et du logiciel CXP.

2.6. Protocole de l’essai clinique

La durée de l’étude était de neuf semaines et commençait après la fin de la radiothérapie. Elle comprenait six semaines d’utilisation du produit suivies d’une période de lavage de trois semaines sans utilisation du produit (figure 1). Les patients ont été sélectionnés et jugés éligibles pour l’étude après la fin de la chimiothérapie et avant le début de la radiothérapie. L’étude a nécessité six visites dans les centres de recherche clinique. La première visite a eu lieu avant le début de la radiothérapie, au cours de laquelle des analyses de base ont été effectuées. Dans la première semaine suivant la fin de la radiothérapie, les participants ont eu leur deuxième visite, au cours de laquelle des analyses ont été effectuées, et l’étude de neuf semaines a commencé. Six semaines de produit Tv ont été fournies au participant, qui est revenu au centre de recherche pour les visites trois, quatre et cinq, à deux semaines d’intervalle, pour des prélèvements de laboratoire et l’évaluation de la tolérance du produit et des effets indésirables. La dernière (sixième) visite a eu lieu à neuf semaines, après trois semaines sans produit, pour un dernier prélèvement de laboratoire et une évaluation de tout événement indésirable prolongé.

Le protocole d’escalade de dose impliquait des cohortes d’un minimum de trois participants ingérant oralement du Tv en doses divisées quotidiennement pendant six semaines. La première cohorte de dose a pris 3 grammes/jour en deux doses divisées ; la deuxième cohorte a pris 6 grammes/jour en deux doses divisées ; la troisième cohorte a pris 9 grammes/jour en trois doses divisées. Trois grammes par jour est la dose la plus couramment utilisée dans la pratique de la médecine naturopathique et jusqu’à 9 grammes est utilisé au Japon. L’objectif de l’étude était de déterminer la dose maximale tolérée (DMT) qui a démontré la sécurité et la tolérabilité (tableau 1).

3. Résultats

3.1. Effets indésirables

Les résultats de cette étude d’escalade de dose ont montré que jusqu’à 9 grammes/jour de préparation Tv était bien tolérée chez les femmes atteintes d’un cancer du sein pendant six semaines dans le cadre d’un traitement post-radiation. Neuf événements indésirables ont été signalés : sept légers, un modéré et un seul de grade 3, à savoir une crise d’angoisse chez une participante, probablement sans rapport avec le médicament étudié (tableau 2). Les autres effets indésirables légers signalés comprenaient une brûlure cardiaque transitoire, des palpitations cardiaques, une constipation, des douleurs thoraciques, de la fièvre, une dermatite de radiation et des symptômes de rhume ou de grippe. Les trois doses ont été bien tolérées, et les participants n’ont pas éprouvé de difficultés à avaler jusqu’à 9 gélules trois fois par jour. Il est à noter que ni nausées ni troubles gastro-intestinaux n’ont été signalés ; deux effets secondaires ont été rapportés lors d’essais cliniques précédents d’autres extraits de Tv.

3.2. Réponse immunitaire

Le compartiment des globules rouges n’a pas été affecté par la radiothérapie (RT) et l’administration de Tv. Le nombre absolu de globules rouges, l’hémoglobine et l’hématocrite étaient normaux lors de la première visite, qui était le jour avant le début de la RT, et ont continué à se situer dans les limites normales pendant le reste de l’étude. La numération absolue des globules blancs et des neutrophiles était généralement dans les limites de la normale pour toutes les femmes, avant et après la RT et pendant les semaines suivant la RT, alors qu’elles prenaient du Tv (données non présentées). Cependant, la numération absolue des lymphocytes a révélé un schéma différent des autres sous-ensembles de la NFS. Comme les critères d’éligibilité étaient identiques dans les études menées par nos centres depuis 2006, afin d’augmenter la puissance, nous avons combiné les données de notre étude observationnelle (𝑁=14) qui a montré que la RT produisait des défauts immunitaires chez les femmes atteintes d’un cancer du sein de stade I-III avec notre étude actuelle d’escalade de dose (𝑁=9). Pour le nombre combiné de 23 femmes dans les deux études avec un cancer du sein de stade I-III après une chirurgie mammaire et une chimiothérapie qui ont ensuite reçu une radiothérapie, les lymphocytes étaient dans les limites normales avant la RT mais ont chuté à des niveaux anormalement bas après la RT. Le nombre moyen de lymphocytes pour les 23 sujets avant la RT était de 1,027±0,298 et a chuté de 20% après la RT à 0,681±0,254, une différence qui était statistiquement significative. Dans l’étude d’escalade de dose, les deux doses orales plus élevées (6 et 9 g) de Tv ont entraîné une récupération plus précoce du nombre de lymphocytes (Figure 2). Le nombre de lymphocytes s’est progressivement rétabli dans le groupe d’observation, mais le nombre moyen de lymphocytes est resté inférieur à celui des cohortes de 6 et 9 g de Tv 6 semaines après la RT. En raison du petit nombre pour chaque cohorte de dose (𝑁=3), une signification statistique n’a été trouvée qu’entre les groupes observationnel et 9 g au point de temps de 2 semaines après la radiothérapie. La radiothérapie a déprimé de manière statistiquement significative le nombre absolu de lymphocytes chez les femmes atteintes d’un cancer du sein de stade I-III ayant subi une chirurgie et une chimiothérapie (voir figure 2).

L’activité fonctionnelle des cellules tueuses naturelles a été considérablement réduite entre la période pré et post-RT pour les 23 patientes atteintes d’un cancer du sein qui ont effectué les deux premières visites de l’étude d’observation (𝑁=14) ou de l’étude d’escalade de dose (𝑁=9). La figure 3 montre que l’activité moyenne des cellules NK était de 19,941±18,959 avant la RT et a diminué à 9,872±13,454 après la RT (𝑁=23). Cette baisse était statistiquement significative (𝑡(44)=2,077, 𝑃=0,043). Une tendance à l’augmentation de l’activité des cellules NK a été observée dans la cohorte ayant reçu la dose de 6 g de Tv.

La radiothérapie a déprimé de manière statistiquement significative la fonction des cellules NK représentée par le LU, qui est calculé par 107 doses divisées par le LU20. Le LU20 est le nombre de cellules effectrices (NK) nécessaires pour obtenir 20% de lyse spécifique sur les cellules cibles (K562). Par conséquent, plus le LU20 est petit, plus les cellules NK sont efficaces. L’interprétation de ce résultat a pu être difficile en raison des réponses différentes des individus lors de la supplémentation en champignons. La tendance à l’augmentation temporaire de l’activité des cellules NK a été observée dans le groupe ayant reçu une dose de 6 g (voir figure 3).

Nous avons également mesuré les effets de la radiothérapie et de l’administration de Tv sur les populations de cellules T, B et NK chez les neuf patients qui ont terminé l’étude de phase I à doses croissantes. A partir des données d’immunophénotypage par le WBC et la cytométrie de flux, la valeur absolue (mm3) a été calculée. La radiothérapie a eu un effet non significatif sur les populations de lymphocytes T CD4+ et CD8+, de lymphocytes B CD19+ et de cellules NK CD16+/56+. L’immunophénotypage n’ayant pas été réalisé dans l’étude observationnelle, les nombres de scores composites (avant et après radiothérapie) étaient ceux des personnes ayant participé à l’étude d’escalade de dose (𝑁=9). Le nombre de cellules T CD8+ n’était pas statistiquement différent avant et après la radiothérapie (figure 4). Cependant, des augmentations des cellules T CD8+ et des cellules B CD19+ ont été observées dans le sang périphérique pour les groupes ayant reçu une supplémentation en Tv. Le nombre de cellules T CD8+ au cours de l’étude d’escalade de dose de 9 semaines était plus élevé dans la cohorte ayant reçu la dose de 9 g de Tv que dans le groupe ayant reçu 3 g ou 6 g de Tv. Une ANOVA à sens unique a été utilisée pour analyser la différence globale entre les groupes de dosage sur la période de traitement (2-4-6 semaines). Elle a montré l’augmentation statistiquement significative des cellules T cytotoxiques CD8+ pour le groupe 9 g par rapport au groupe 3 g et 6 g (𝐹(2,6)=42,04, 𝑃=0,0003). La différence entre les groupes 3 g et 6 g n’était pas significative (voir Figure 4).

Selon les scores composites de huit participants à l’escalade de dose, la radiothérapie n’a pas modifié de manière significative le nombre de cellules B (Figure 5). Cependant, l’administration de Tv a été associée à une augmentation des cellules B CD19+. Une ANOVA à sens unique a été utilisée pour analyser la différence globale entre les groupes de dosage sur la période de traitement (2-4-6 semaines). Elle a montré l’augmentation statistiquement significative des cellules B CD19+ pour le groupe ayant reçu la dose de 6 g par rapport au groupe ayant reçu la dose de 3 g . La différence entre les groupes 3 g et 9 g et également les groupes 6 g et 9 g n’était pas significative (voir figure 5).

En ce qui concerne le nombre de cellules NK CD16+56+, aucun changement significatif dû à la radiothérapie ou à l’administration de Tv n’a été observé (Figure 6). Étant donné que l’activité des cellules NK était à la fois diminuée par la radiothérapie et augmentée dans la cohorte ayant reçu une dose de 6 grammes de Tv (figure 3), mais que les populations de cellules NK ne semblaient pas être influencées de manière significative par ces traitements, les données suggèrent que l’augmentation de l’activité des cellules NK n’est pas due à des modifications du nombre de cellules NK induites par le traitement. La population de cellules NK n’a été affectée ni par la radiothérapie ni par les doses orales de Tv (voir figure 6).