- Observation des embryons fécondés jusqu’aux embryons de clivage
- Figure 1.
- Figure 2.
- Figure 3.
- 2.1. Morphocinétique du clivage de l’embryon basée sur l’imagerie time-lapse
- 2.2. Expression génétique de l’embryon de clivage et évaluation non invasive de la viabilité de l’embryon via l’analyse du milieu de culture
Observation des embryons fécondés jusqu’aux embryons de clivage
Depuis que la première culture d’embryon de lapin a été décrite en 1912 et que le zygote de souris a pu être cultivé in vitro pour former des embryons de stade blastocyste , la qualité de l’embryon est devenue un facteur important pour la grossesse après le transfert de l’embryon in vitro dans l’utérus car la qualité de l’embryon a une corrélation étroite avec l’implantation de l’embryon transféré dans l’utérus. Depuis la naissance du premier bébé « éprouvette », Louise Brown, en juillet 1978, pour laquelle le prix Nobel de physiologie ou de médecine 2010 a été décerné à Robert Edwards pour avoir mis au point la fécondation in vitro (FIV) et le transfert d’embryons (TE) afin de traiter l’infertilité chez les femmes dont l’oviducte n’est pas ouvert, la production d’embryons in vitro (PIV) a été largement utilisée dans le traitement de l’infertilité humaine et dans la reproduction et l’expansion des populations animales. Cependant, le succès de la technologie de reproduction assistée dépend principalement de la production d’embryons viables à fort potentiel d’implantation. Plus important encore, le choix du meilleur embryon pour le transfert est devenu le défi majeur de la FIV. Au début de la culture embryonnaire, l’évaluation de la qualité de l’embryon était principalement basée sur les critères morphologiques de l’embryon transféré. Ainsi, l’observation en série de la morphologie de l’embryon est une technique courante d’évaluation des embryons par les embryologistes et a été considérée comme un indicateur clé de l’implantation et de la grossesse. Pendant une longue période, les embryologistes ont évalué la qualité et la morphologie des embryons en les sortant de l’incubateur et en les plaçant sous un microscope. Outre l’observation de la morphologie, les chercheurs s’intéressent à une série d’études sur le changement nucléaire des cellules, l’activation et l’expression des gènes, l’expression des protéines cytoplasmiques, la différenciation des blastomères, etc. Cependant, ces études entraînent souvent la mort des embryons. Par exemple, dans notre première étude qui observait la modification du microfuseau après l’entrée du spermatozoïde dans l’ovule ou l’activation de l’ovule, les zygotes fécondés ou les ovules activés devaient être fixés sur la lame et colorés par immunocytochimie à la fluorescéine et par microscopie confocale laser . Nos recherches ont clairement montré l’altération des microtubules et de la chromatine après l’activation de l’ovocyte bovin et l’injection de sperme introcytoplasmique (ICSI ; figure 1). Le sperme dans l’ovocyte ou l’ionophore de calcium et l’éthanol peuvent activer l’ovocyte et provoquer l’extrusion du deuxième corps polaire. Afin d’observer le moment de l’apparition du deuxième corps polaire, nous avons coloré différents stades des ovocytes après l’activation. Le résultat a montré qu’après 5 heures de post-activation, le deuxième corps polaire peut être complètement extrudé (Figure 2).
Figure 1.
Microscopie confocale à balayage laser des modifications du fuseau et de la chromatine aux différents temps post-activation et injection intracytoplasmique de sperme (ICSI) chez le bovin. Les lettres majuscules (à gauche) indiquent les changements après l’activation et les lettres minuscules (à droite) après l’ICSI. A/a montre à 0,5 h, B/b à 2 h, C/c à 3 h et D/d à 7 h après l’activation ou l’ICSI. Le prénoyau dans l’œuf activé et les prénoyaux dans l’œuf ICSI sont apparus avec une couleur rouge.
Figure 2.
Microscopie confocale à balayage laser des changements du fuseau et de la chromatine aux différents moments post activation chez le bovin. À 0,5 h après l’activation, les chromosomes du fuseau commencent à se diviser, et l’achèvement de la division du fuseau nécessite environ 3 heures et le deuxième corps polaire peut être extrudé à environ 5 heures. Le rouge et le vert indiquent ensemble le fuseau, et le point rouge indique le premier corps polaire.
L’étude de l’expression des gènes nécessite souvent d’isoler l’ARNm ou les protéines des embryons ; par conséquent, les embryons devaient être lysés et aucun embryon ne survivrait. Afin d’étudier la différenciation cellulaire sur les embryons au stade moral et blastocyste, une méthode de microscopie à double coloration à la fluorescéine a été utilisée pour distinguer la masse cellulaire interne (MCI) du trophoectoderme (TE). Les nombres de deux cellules différentes peuvent être comptés sur la base de couleurs différentes (ICM en bleu et TE en rose, figure 3).
Figure 3.
Distinction des différentes cellules dans les embryons blastocystes bovins avec une double coloration. La figure supérieure montre un embryon blastocyste avec une masse cellulaire interne (MCI) marquée et autour des cellules du trophectoderme (TE). La figure du bas montre un embryon de blastocyste bovin à double coloration avec du bleu pour la MCI et du rose pour les cellules TE. La photo du haut provient d’une recherche sur une page web, et l’auteur apprécie grandement la courtoisie du Prof. Fuliang Du pour la photo du bas non publiée.
Ces méthodes de recherche endommagent finalement tous les embryons, et il est impossible d’appliquer ces méthodes à la pratique clinique. Ainsi, l’évaluation actuelle de la qualité des embryons repose principalement sur les critères morphologiques des embryons transférés, qui comprennent trois paramètres majeurs tels que la régularité des blastomères, la fragmentation et la granularité cytoplasmique . Le nombre de cellules embryonnaires à différents jours de culture et la multinucléarité peuvent également être pris en compte pour évaluer la qualité des embryons. Plusieurs rapports ont documenté l’association entre les caractéristiques morphologiques des embryons au stade de clivage et le succès de la grossesse. Il s’agit donc actuellement de la méthode de base pour l’évaluation de la qualité des embryons dans la FIV humaine et la production d’embryons in vitro chez l’animal. Cependant, bien que cette méthode soit facile à mettre en œuvre, elle nécessite souvent de sortir les embryons de l’incubateur, ce qui suscite des inquiétudes quant à la sécurité et à la stabilité des conditions de culture. En outre, certains points clés du développement embryonnaire peuvent être manqués pendant l’observation. L’évaluation des embryons de clivage pendant la culture et avant le transfert d’embryon est une pratique clinique importante. Actuellement, la principale évaluation des embryons fécondés in vitro est l’observation visuelle par microscopie. Ces dernières années, divers incubateurs à microscopie time-lapse sont utilisés dans les cliniques de FIV humaine pour surveiller toutes les étapes de la croissance et du développement des embryons. Bien que les technologies de diagnostic et de sélection des embryons préimplantatoires (PGD/PGS) aient été appliquées dans la pratique de la sélection des embryons humains pour améliorer le taux de grossesse, ces techniques sont invasives pour les embryons. Trouver une autre méthode non invasive pour sélectionner un bon embryon sera très utile dans la pratique de l’ART humaine. Sallam et al. ont passé en revue les méthodes non invasives de sélection des embryons et les ont évaluées à la lumière des meilleures preuves actuellement disponibles afin de déterminer si l’une d’entre elles est prête à remplacer ou à compléter la méthode traditionnelle de l’évaluation morphologique. Ainsi, nous avons besoin d’outils plus puissants pour estimer les marqueurs morphocinétiques des embryons.
2.1. Morphocinétique du clivage de l’embryon basée sur l’imagerie time-lapse
Depuis des décennies, les chercheurs tentent de suivre le développement des organismes multicellulaires de l’œuf fécondé à l’adulte. Si les scientifiques avaient exploré les étapes individuelles de ce processus, aucune méthode n’existait pour leur permettre de modéliser en direct l’ensemble du processus de développement. À l’heure actuelle, les progrès réalisés dans le domaine de la microscopie à feuillets lumineux, rapportés dans deux articles de Nature Methodspapers, ont permis aux chercheurs de visualiser les premiers stades du développement de manière très détaillée. Les récents microscopes à feuillets lumineux utilisent une feuille de lumière laser pour éclairer une fine section d’un échantillon et capturer le plan entier en un seul cliché. Cela leur permet d’utiliser beaucoup moins de lumière que les microscopes confocaux ou à deux photons. Il est très rapide mais aussi très doux pour être extrêmement performant dans plusieurs domaines critiques en même temps . Pour l’imagerie du développement d’embryons entiers comme ceux de la drosophile, du poisson-zèbre et de la souris, cette nouvelle technique d’imagerie multivue est fantastique.
L’imagerie time-lapse est une autre technologie émergente non invasive qui permet de suivre le développement de l’embryon pendant 24 heures, offrant la possibilité d’augmenter la quantité et la qualité des informations morphologiques sans perturber les conditions de culture . Le microscope time-lapse est très utile pour l’observation du développement embryonnaire. Au cours de la dernière décennie, de nombreuses cliniques ou centres de FIV ont commencé à utiliser l’imagerie time-lapse pour surveiller la croissance et la division des embryons pendant la culture in vitro et, finalement, pour sélectionner les embryons de bonne qualité à transférer en fonction des données et des images enregistrées. Cette technique a été rapportée comme étant capable d’améliorer l’implantation des embryons transférés et la grossesse. La vitesse normale de clivage de l’embryon peut être déterminée à partir de l’enregistrement chronologique du clivage de l’embryon. Ainsi, dans le deuxième chapitre de ce livre, le moment du clivage embryonnaire a été décrit sur la base des marqueurs morphocinétiques par le moniteur time-lapse. Grâce à ce schéma de clivage embryonnaire, les embryologistes peuvent savoir clairement à quel stade un embryon doit se trouver à différents moments. Ainsi, un embryon de qualité optimale ou un embryon à fort potentiel d’implantation peut être sélectionné pour le transfert afin d’obtenir un taux de grossesse plus élevé. En utilisant un système d’enregistrement continu et fréquent, certains marqueurs morphocinétiques peuvent être révélés dans le système time-lapse. Par exemple, la division rapide des cellules embryonnaires à un moment donné entraîne souvent un taux d’implantation plus faible. Dans une situation normale, la division du zygote en 2 ou 3 cellules prend environ 10 à 11 heures, mais Rubio et al. ont découvert que certains embryons ne prennent que 5 heures pour compléter cette division, et ces embryons ont un taux d’implantation beaucoup plus faible que les embryons à division normale (1,2% contre 20%). De même, le clivage inégal de l’embryon, qui est défini comme une rupture d’un blastomère en trois blastomères filles ou un intervalle de cycle cellulaire inférieur à 5 heures, produit souvent un potentiel d’implantation nettement inférieur. Ainsi, nous pouvons utiliser ces marqueurs morphocinétiques plus précis pour distinguer la qualité de l’embryon.
Le troisième chapitre examine et vérifie en outre si la technologie d’imagerie time-lapse est utile pour la sélection d’embryons de « qualité supérieure » pour le transfert afin d’améliorer le résultat de l’ART plutôt que l’évaluation morphologique conventionnelle. Il est intéressant de noter que les corrélations possibles entre le sexe de l’embryon, la fragmentation de l’embryon, les protocoles de traitement, les différents milieux de culture et la morphocinétique de l’embryon ont été évaluées sur la base de nouvelles recherches sur les installations d’imagerie time-lapse. En outre, divers algorithmes et modèles prédictifs conçus pour les cycles de procréation assistée avec l’imagerie time-lapse sont également discutés. Par exemple, de nombreuses recherches sur la vitesse de développement de l’embryon animal et humain par observation morphologique ordinaire ont montré que les embryons mâles se développent plus rapidement que les embryons femelles. Cependant, l’observation actuelle par imagerie time-lapse peut fournir des informations plus détaillées et exactes sur la différence entre les embryons mâles et femelles au cours des premières divisions. Bien que les embryons femelles présentent des paramètres morphocinétiques de stade clivage (t8), morula (tM) et blastocyste tardifs, ils présentent une expansion plus précoce que les mâles. Ainsi, les moments clés de l’observation sont liés au développement du sexe de l’embryon. De manière intéressante, les auteurs ont conçu un modèle en fonction du moment de la deuxième synchronie et de la formation de la morula avec quatre sous-groupes pour prédire la probabilité qu’un embryon soit de sexe féminin.
Afin d’étudier et d’explorer davantage la morphocinétique du clivage embryonnaire, le quatrième chapitre aborde certaines méthodes d’analyse spatio-temporelle du clivage embryonnaire in vitro.L’analyse time-lapse automatisée ou semi-automatisée d’images d’embryons de stade précoce pendant la phase de clivage peut donner un aperçu du moment de la mitose, de la régularité du moment et du modèle de division, ainsi que du lignage cellulaire. Le suivi simultané des processus moléculaires permet d’étudier les liens entre l’expression génétique, la physiologie cellulaire et le développement. Grâce aux données d’imagerie time-lapse et aux logiciels d’analyse, il est facile de créer un séquençage vidéo quadridimensionnel des embryons, de sorte que les embryons en croissance présentent de nouvelles perspectives sur le développement embryonnaire temporel. Dans ce chapitre, les auteurs décrivent trois méthodes avec des variations dans l’analyse du matériel et du logiciel en donnant quelques exemples des résultats pour ouvrir une fenêtre à de nouvelles informations dans l’embryologie de développement, comme le modèle de division de l’embryon et le lignage sont étudiés in vivo.
2.2. Expression génétique de l’embryon de clivage et évaluation non invasive de la viabilité de l’embryon via l’analyse du milieu de culture
Le développement de l’embryon préimplantatoire connaît une série d’événements critiques et de modifications épigénétiques remarquables, et une reprogrammation de l’expression des gènes se produit pour activer le génome embryonnaire. Dans les premiers stades du développement embryonnaire préimplantatoire, les ARNm maternels dirigent le développement embryonnaire. Tout au long du développement embryonnaire précoce, un schéma de méthylation différentielle est maintenu, bien que certains présentent des modifications spécifiques à chaque stade. Des études récentes ont montré que le processus de déméthylation différentielle entraîne une expression différentielle des gènes parentaux dans les embryons en développement précoce, ce qui peut avoir un impact sur le développement correct. De plus, il a été démontré que les ARN non codants, les ARN non codants longs (ARNlc) et les ARN non codants courts, les microARN (miARN), jouent un rôle important dans la régulation des ARNm, et leur rôle dans le développement préimplantatoire a donc gagné en importance. Le chapitre cinq passe en revue les différents facteurs affectant l’expression des gènes au cours du développement de l’embryon préimplantatoire, ce qui inclut les facteurs épigénétiques, en se concentrant sur les profils de méthylation, des gamètes et des embryons préimplantatoires. Les effets des ARN non codants sur l’expression des gènes ont été évalués de manière approfondie.
Parce que l’apparition de l’expression des gènes au cours du développement de l’embryon en culture in vitro, les embryons préimplantatoires nécessitent souvent des milieux de culture à nutrition riche. L’embryon pendant sa croissance et son développement doit absorber certains composants nutritifs importants du milieu de culture et produire métaboliquement certains sous-produits comme les résultats de l’expression génique. De ce point de vue, la culture in vitro d’embryons fournit également un matériau très important pour une évaluation non invasive de l’embryon par l’examen de biomarqueurs dans le milieu de culture de l’embryon usagé. Les méthodes actuellement développées se concentrent sur la mesure des composés métaboliques sécrétés par les embryons en développement. Ces études utilisent principalement les outils de l’analytique moderne et de la protéomique. Certaines études suggèrent que le profilage métabolique des milieux de culture des embryons à l’aide de spectroscopies optiques et non optiques pourrait constituer un complément utile aux stratégies actuelles d’évaluation des embryons et donner un aperçu du phénotype des embryons dont le potentiel reproductif augmente .
Dans le sixième chapitre, les auteurs décrivent leur nouvelle découverte, la chaîne alpha-1 de la molécule d’haptoglobine humaine comme biomarqueur quantitatif de la viabilité des embryons. Dans une série d’expériences rétrospectives et en aveugle, ils ont obtenu un taux de réussite de plus de 50 %. Ce chapitre résume les approches métaboliques et protéomiques actuellement disponibles pour l’évaluation moléculaire non invasive de la viabilité embryonnaire. Des études récentes ont montré que l’évaluation des composants moléculaires des milieux nutritifs est un domaine prometteur dans la recherche des marqueurs d’une implantation réussie de l’embryon, avec le développement ultérieur d’une grossesse clinique et la naissance d’un bébé en bonne santé, afin d’améliorer l’efficacité du traitement par les techniques de procréation assistée. Si la composition moléculaire des milieux de culture peut être utilisée comme une procédure supplémentaire non invasive pour choisir un embryon pour le transfert sélectif, elle sera très utile pour améliorer les résultats de la grossesse par FIV humaine.