Fluorescencia

La fluorescencia es una luminiscencia que se da sobre todo como fenómeno óptico en los cuerpos fríos, en el que la absorción molecular de un fotón a una determinada longitud de onda desencadena la emisión de otro fotón con una longitud de onda mayor. La sustancia que emite fluorescencia se denomina fluoróforo. La diferencia de energía entre los fotones absorbidos y los emitidos termina en forma de vibraciones moleculares o calor. Por lo general, el fotón absorbido está en el rango ultravioleta y la luz emitida está en el rango visible, pero esto depende del fluoróforo utilizado y de otros factores.

La fluorescencia recibe su nombre del mineral fluorita, compuesto por fluoruro de calcio, que a menudo presenta este fenómeno. Hay otros minerales y materiales orgánicos que también presentan fluorescencia y que se utilizan para diversas aplicaciones. Por ejemplo, la fluorescencia es útil para iluminar y marcar moléculas en química analítica y bioquímica. Los fluoróforos se han utilizado para etiquetar células, anticuerpos y otras estructuras biológicas, y para determinar sus estructuras y modos de acción.

Ejemplos de materiales fluorescentes

Las piedras preciosas, los minerales, las fibras y muchos otros materiales que se encuentran en el ámbito forense o con relación a diversos objetos de colección pueden tener una fluorescencia distintiva o pueden presentar una fluorescencia diferente bajo el ultravioleta de onda corta, el ultravioleta de onda larga o los rayos X.

Muchos tipos de calcita y ámbar presentan fluorescencia bajo el ultravioleta de onda corta. Los rubíes, las esmeraldas y el diamante Hope presentan fluorescencia roja bajo la luz ultravioleta de onda corta; los diamantes también emiten luz bajo la radiación de rayos X.

El crudo (petróleo) presenta fluorescencia en una gama de colores, desde el marrón apagado de los aceites pesados y los alquitranes hasta el blanco amarillento y azulado brillante de los aceites muy ligeros y los condensados. Este fenómeno se utiliza en las perforaciones de exploración petrolífera para identificar cantidades muy pequeñas de petróleo en los recortes de perforación y en las muestras de núcleos.

Los líquidos orgánicos, como las mezclas de antraceno en benceno o tolueno, o el estilbeno en los mismos disolventes, presentan fluorescencia con la irradiación ultravioleta o de rayos gamma. Los tiempos de decaimiento de esta fluorescencia son del orden de los nanosegundos, ya que la duración de la luz depende del tiempo de vida de los estados excitados del material fluorescente, en este caso el antraceno o el estilbeno.

Aplicaciones

Hay muchos compuestos naturales y sintéticos que presentan fluorescencia, y tienen diversas aplicaciones. Algunos animales de las profundidades marinas, como el Ojo Gris, utilizan la fluorescencia.

Iluminación

El tubo fluorescente común se basa en la fluorescencia. Dentro del tubo de vidrio hay un vacío parcial y una pequeña cantidad de mercurio. Una descarga eléctrica en el tubo hace que los átomos de mercurio emitan luz. La luz emitida se encuentra en el rango ultravioleta (UV), es invisible y es perjudicial para la mayoría de los organismos vivos. El tubo está recubierto de un material fluorescente, llamado fósforo, que absorbe el ultravioleta y vuelve a emitir luz visible. La iluminación fluorescente es muy eficiente desde el punto de vista energético en comparación con la tecnología incandescente, pero los espectros producidos pueden hacer que ciertos colores parezcan poco naturales.

A mediados de la década de 1990, aparecieron los diodos emisores de luz blanca (LED), que funcionan mediante un proceso similar. Normalmente, el semiconductor emisor de luz produce luz en la parte azul del espectro, que incide en un compuesto de fósforo depositado en el chip; el fósforo emite fluorescencia de la parte verde a la roja del espectro. La combinación de la luz azul que atraviesa el fósforo y la luz emitida por el fósforo produce una emisión neta de luz blanca.

Se dice que la moderna farola de vapor de mercurio ha evolucionado a partir de la lámpara fluorescente.

Las varillas luminosas oxidan el éster de oxalato de fenilo para producir luz.

La iluminación fluorescente compacta (CFL) es igual que cualquier lámpara fluorescente típica con ventajas. Es autobalastrada y se utiliza para sustituir a las incandescentes en la mayoría de las aplicaciones. Producen una cuarta parte del calor por lumen que las bombillas incandescentes y duran unas cinco veces más. Estas bombillas contienen mercurio y deben manipularse y desecharse con cuidado.

Química analítica

La fluorescencia en varias longitudes de onda puede detectarse mediante un detector de matriz, para detectar compuestos del flujo de HPLC. Además, las placas de cromatografía en capa fina (TLC) pueden visualizarse si los compuestos o un reactivo colorante son fluorescentes.

Las huellas dactilares pueden visualizarse con compuestos fluorescentes como la ninhidrina.

Bioquímica y medicina

Las moléculas biológicas pueden marcarse con un grupo químico fluorescente (fluoróforo) mediante una simple reacción química, y la fluorescencia de la etiqueta permite la detección sensible y cuantitativa de la molécula. Algunos ejemplos son:

• La microscopía de fluorescencia de tejidos, células o estructuras subcelulares se realiza marcando un anticuerpo con un fluoróforo y permitiendo que el anticuerpo encuentre su antígeno objetivo dentro de la muestra. El etiquetado de múltiples anticuerpos con diferentes fluoróforos permite la visualización de múltiples objetivos dentro de una sola imagen.
• Secuenciación automatizada de ADN por el método de terminación de cadena; cada una de las cuatro bases diferentes de terminación de cadena tiene su propia etiqueta fluorescente específica. A medida que las moléculas de ADN etiquetadas se separan, la etiqueta fluorescente es excitada por una fuente UV, y la identidad de la base que termina la molécula se identifica por la longitud de onda de la luz emitida.
• Detección del ADN: el compuesto bromuro de etidio, cuando es libre de cambiar su conformación en solución, tiene muy poca fluorescencia. La fluorescencia del bromuro de etidio aumenta mucho cuando se une al ADN, por lo que este compuesto es muy útil para visualizar la localización de fragmentos de ADN en la electroforesis en gel de agarosa. El bromuro de etidio puede ser tóxico; una alternativa más segura es el colorante SYBR Green.
• El microarray de ADN
• Inmunología: Un anticuerpo tiene un grupo químico fluorescente unido, y los sitios (por ejemplo, en una muestra microscópica) donde el anticuerpo se ha unido pueden verse, e incluso cuantificarse, por la fluorescencia.
• FACS (clasificación celular activada por fluorescencia)
• La fluorescencia se ha utilizado para estudiar la estructura y las conformaciones del ADN y las proteínas con técnicas como la transferencia de energía por resonancia de fluorescencia, que mide la distancia a nivel de angstrom. Esto es especialmente importante en los complejos de múltiples biomoléculas.
• La equorina, procedente de la medusa Aequorea victoria, produce un brillo azul en presencia de iones Ca2+ (mediante una reacción química). Se ha utilizado para obtener imágenes del flujo de calcio en las células en tiempo real. El éxito de la aequorina impulsó nuevas investigaciones sobre A. victoria y condujo al descubrimiento de la proteína verde fluorescente (GFP), que se ha convertido en una herramienta de investigación muy importante. La GFP y las proteínas afines se utilizan como indicadores de un gran número de acontecimientos biológicos, como la localización subcelular. Los niveles de expresión génica se miden a veces vinculando un gen para la producción de GFP a otro gen.

Además, muchas moléculas biológicas tienen una fluorescencia intrínseca que a veces puede utilizarse sin necesidad de adjuntar una etiqueta química. A veces esta fluorescencia intrínseca cambia cuando la molécula se encuentra en un entorno específico, por lo que se puede medir la distribución o la unión de la molécula. La bilirrubina, por ejemplo, es altamente fluorescente cuando se une a un sitio específico de la albúmina sérica. La protoporfirina de zinc, que se forma en los glóbulos rojos en desarrollo en lugar de la hemoglobina cuando no se dispone de hierro o hay plomo, tiene una fluorescencia brillante y puede utilizarse para detectar estos problemas.

A partir de 2006, el número de aplicaciones de la fluorescencia está creciendo en las ciencias biomédicas biológicas y afines. Los métodos de análisis en estos campos también están creciendo, aunque con una nomenclatura cada vez más desafortunada en forma de acrónimos como: FLIM, FLI, FLIP, CALI, FLIE, FRET, FRAP, FCS, PFRAP, smFRET, FIONA, FRIPS, SHREK, SHRIMP, TIRF. La mayoría de estas técnicas se basan en microscopios de fluorescencia. Estos microscopios utilizan fuentes de luz de alta intensidad, normalmente lámparas de mercurio o xenón, LEDs o láseres, para excitar la fluorescencia en las muestras bajo observación. A continuación, los filtros ópticos separan la luz de excitación de la fluorescencia emitida, para ser detectada a ojo, o con una cámara (CCD) u otros detectores de luz (tubos fotomultiplicadores, espectrógrafos, etc.). Se está investigando mucho para mejorar las capacidades de estos microscopios, las sondas fluorescentes utilizadas y las aplicaciones a las que se aplican. Cabe destacar los microscopios confocales, que utilizan un agujero de alfiler para lograr la sección óptica, lo que permite una visión cuantitativa en 3D de la muestra.

Seguridad

Las bombillas fluorescentes generan mucho menos calor residual que las bombillas incandescentes y halógenas. Las bombillas halógenas están implicadas en un gran número de incendios, y las bombillas incandescentes también conllevan un mayor riesgo de incendio que las fluorescentes, debido al calor residual. Las lámparas pueden caerse accidentalmente, o a veces por sucesos como los terremotos. Por lo tanto, el uso de bombillas fluorescentes puede ser un medio para evitar incendios accidentales. Sin embargo, las bombillas fluorescentes pueden contener mercurio, y la rotura de una bombilla de este tipo podría resultar en un costoso derrame de mercurio.

Consideraciones teóricas

Fotoquímica

La fluorescencia se produce cuando una molécula o punto cuántico se relaja a su estado básico después de haber sido excitado electrónicamente.

Excitación: S 0 + h ν → S 1 {\displaystyle S_{0}+h\nu \a S_{1}}

Fluorescencia (emisión): S 1 → S 0 + h ν {\displaystyle S_{1}a S_{0}+h\nu } , aquí h ν {\displaystyle h\nu } es un término genérico para la energía del fotón donde: h = la constante de Planck y ν {\displaystyle \nu } = frecuencia de la luz. (Las frecuencias específicas de la luz excitada y emitida dependen del sistema concreto.)

El estado S0 se denomina estado básico del fluoróforo (molécula fluorescente) y S1 es su primer estado excitado (electrónicamente).

Una molécula en su estado excitado, S1, puede relajarse por varias vías competitivas. Puede sufrir una «relajación no radiativa» en la que la energía de excitación se disipa en forma de calor (vibraciones) hacia el disolvente. Las moléculas orgánicas excitadas también pueden relajarse a través de la conversión a un estado triplete, que posteriormente puede relajarse a través de la fosforescencia o mediante un paso secundario de relajación no radiativa.

La relajación de un estado S1 también puede producirse a través de la interacción con una segunda molécula mediante el apagado de la fluorescencia. El oxígeno molecular (O2) es un apagador extremadamente eficiente de la fluorescencia debido a su inusual estado básico triplete.

Las moléculas que se excitan a través de la absorción de la luz o mediante un proceso diferente (por ejemplo, como producto de una reacción) pueden transferir energía a una segunda molécula «sensibilizada», que se convierte en su estado excitado y puede entonces emitir fluorescencia. Este proceso se utiliza en las barras de luz.

Rendimiento cuántico de fluorescencia

El rendimiento cuántico de fluorescencia da la eficiencia del proceso de fluorescencia. Se define como el cociente entre el número de fotones emitidos y el número de fotones absorbidos.

Φ = # p h o t o n s e m i t a d o # p h o t o n s a b s o r b e d {\displaystyle \Phi ={frac {\rm {#\ fotones emitidos}{rm {#\ fotones absorbidos}}}}

El máximo rendimiento cuántico de fluorescencia es 1,0 (100 por ciento); cada fotón absorbido resulta en un fotón emitido. Los compuestos con rendimientos cuánticos de 0,10 todavía se consideran bastante fluorescentes. Otra forma de definir el rendimiento cuántico de la fluorescencia, es por las tasas de decaimiento del estado excitado:

k f ∑ i k i {\displaystyle {\frac {{k}_{f}}{suma _{i}{k}_{i}}}}

donde k f {\displaystyle {k}_{f}} es la tasa de emisión espontánea de radiación y

∑ i k i {\displaystyle \sum _{i}{k}_{i}}

es la suma de todas las tasas de desintegración del estado excitado. Otras tasas de decaimiento del estado excitado son causadas por mecanismos distintos a la emisión de fotones y, por lo tanto, se denominan a menudo «tasas no radiativas», que pueden incluir: el apagado dinámico por colisión, la interacción dipolo-dipolo de campo cercano (o transferencia de energía por resonancia), la conversión interna y el cruce entre sistemas. Por lo tanto, si la tasa de cualquier vía cambia, esto afectará tanto al tiempo de vida del estado excitado como al rendimiento cuántico de fluorescencia.

El rendimiento cuántico de fluorescencia se mide por comparación con un estándar con cuantología conocida; la sal de quinina, el sulfato de quinina, en una solución de ácido sulfúrico es un estándar de fluorescencia común.

Vida de fluorescencia

La vida de fluorescencia se refiere al tiempo medio que la molécula permanece en su estado excitado antes de emitir un fotón. La fluorescencia suele seguir una cinética de primer orden:

= 0 e – Γ t , {\displaystyle \left=\left_{0}e^{-\Gamma t},}

donde {\displaystyle \left} es la concentración de moléculas en estado excitado en el momento t {\displaystyle t} , 0 {displaystyle \left_{0}} es la concentración inicial y Γ {\displaystyle \Gamma } es la tasa de decaimiento o la inversa del tiempo de vida de la fluorescencia. Este es un caso de decaimiento exponencial. Varios procesos radiativos y no radiativos pueden despoblar el estado exacto. En tal caso la tasa de decaimiento total es la suma de todas las tasas:

Γ t o t = Γ r a d + Γ n r a d {\displaystyle \Gamma _{tot}=\Gamma _{rad}+\Gamma _{rad}}

donde Γ t o t {\displaystyle \Gamma _{tot}} es la tasa de desintegración total, Γ r a d {\displaystyle \Gamma _{rad}} la tasa de desintegración radiativa y Γ n r a d {\displaystyle \Gamma _{rad}} la tasa de desintegración no radiativa. Es similar a una reacción química de primer orden en la que la constante de velocidad de primer orden es la suma de todas las tasas (un modelo cinético paralelo). Si la tasa de emisión espontánea, o cualquiera de las otras tasas son rápidas, el tiempo de vida es corto. Para los compuestos fluorescentes comúnmente utilizados, los tiempos típicos de decaimiento del estado excitado para los compuestos fluorescentes que emiten fotones con energías desde el UV hasta el infrarrojo cercano están dentro del rango de 0,5 a 20 nanosegundos. El tiempo de vida de la fluorescencia es un parámetro importante para las aplicaciones prácticas de la fluorescencia, como la transferencia de energía por resonancia de fluorescencia.

Reglas

Hay varias reglas que tratan de la fluorescencia. La regla de Kasha-Vavilov dicta que el rendimiento cuántico de la luminiscencia es independiente de la longitud de onda de la radiación excitante.

Esta regla no siempre es válida y se viola gravemente en muchas moléculas simples. Una afirmación algo más fiable, aunque todavía con excepciones, es que el espectro de fluorescencia muestra muy poca dependencia de la longitud de onda de la radiación excitante.

Ver también

• Fluoresceína
• Lámpara fluorescente
• Luz
• Fosforescencia
• Rayos X

• Lakowicz, Joseph R. 2006. Principles of Fluorescence Spectroscopy, 3rd ed. New York: Springer. ISBN 978-0387312781
• Turro, Nicholas J. 1991. Modern Molecular Photochemistry. Mill Valley, CA: University Science Books. ISBN 0935702717
• Valeur, Bernard. 2002. Molecular Fluorescence: Principles and Applications. Weinheim: Wiley-VCH. ISBN 352729919X

Todos los enlaces recuperados el 14 de abril de 2017.

• Fluoróforos.org La base de datos de colorantes fluorescentes
• Fluorescencia en Scienceworld
• Conceptos básicos de fluorescencia