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Der jüngste Leitartikel von Dayan und Wraith in dieser Zeitschrift hat die Herausforderungen für die Entwicklung neuer Immuntherapien nach der katastrophalen Studie mit TGN1412 hervorgehoben. In diesem Überblick werden einige der Erkenntnisse aus vielen klinischen Studien mit Anti-D vorgestellt, die für die translationale Immunologie von Bedeutung sein könnten.

Die Verhinderung des Hydrops fetalis oder der hämolytischen Rhesuskrankheit des Fötus und des Neugeborenen (HDFN) durch prophylaktisches Anti-D ist die erfolgreichste klinische Anwendung der Antikörper-vermittelten Immunsuppression. HDFN tritt auf, wenn eine D-negative Frau nach einer fetomaternalen Blutung (FMH) gegen fetale D-positive rote Blutkörperchen immunisiert wird; das gebildete IgG-Anti-D wird über die Plazenta übertragen und führt zur Zerstörung der fetalen roten Blutkörperchen durch Milzmakrophagen. In den 1940er Jahren, als die Ursache dieser Krankheit zum ersten Mal erkannt wurde, wurden 1 % der Babys mit HDFN geboren und 40 % von ihnen starben. Anti-D ist der am häufigsten vorkommende Antikörper. Das RhD-Polypeptid auf den Erythrozyten ist das immunogenste der Blutgruppenantigene, da es in den Zellen von D-Negativen, denen das RHD-Gen fehlt, nicht vorhanden ist.

HDFN ist heute selten, zum Teil aufgrund einer verbesserten fötalen und neonatalen Versorgung, aber vor allem wegen der Vorbeugung der primären Immunisierung von empfänglichen D-Negativen durch prophylaktisches IgG-Anti-D. Nach erfolgreichen klinischen Versuchen im Vereinigten Königreich und in den USA wird seit 1968 10 % aller Frauen postnatal Anti-D verabreicht, was zu einem Rückgang der Krankheit um etwa 95 % führte. Heute sind weniger als 30 perinatale Todesfälle pro Jahr auf die HDFN zurückzuführen. Im Jahr 2002 empfahl das National Institute of Health and Clinical Excellence (NICE), allen D-negativen Frauen zusätzlich zur postnatalen Prophylaxe eine routinemäßige vorgeburtliche Anti-D-Prophylaxe zu verabreichen, um die Immunisierungsrate weiter zu senken. Intravenöses (IV) Anti-D wird jetzt auch therapeutisch eingesetzt, um einige D-positive Patienten mit immunthrombozytopenischer Purpura (ITP) zu behandeln. Daher steigt die Nachfrage nach Anti-D.

Anti-D-Immunglobulin wird aus gepooltem hyperimmunen Humanplasma hergestellt. Seit vielen Jahren haben Fragen der virologischen Sicherheit und in jüngster Zeit die Variante der Creutzfeld-Jakob-Krankheit (vCJD) die Suche nach alternativen Versorgungsmöglichkeiten gefördert. Im Vereinigten Königreich wird das Plasma für die Fraktionierung jetzt von nordamerikanischen Spendern bezogen, da Bedenken bestehen, dass britische Spender latente Träger der vCJD sein könnten. Mit dem Ziel, die aus menschlichem Plasma hergestellten polyklonalen Anti-D-Antikörper durch biotechnologische Versionen für diagnostische und klinische Zwecke zu ersetzen, wurden Hunderte von monoklonalen (mAb) oder rekombinanten (rAb) Anti-D-Antikörpern hergestellt. Sie sind alle von menschlichen Immunglobulingenen oder B-Zellen abgeleitet, da Mäuse das RhD-Antigen nicht erkennen. Es wurden verschiedene Expressionssysteme verwendet, darunter menschliche B-Zelllinien, Ovarialzellen des chinesischen Hamsters (CHO), Maus-Human-Heterohybridome und Rattenmyelome.

Obwohl der genaue Mechanismus der Unterdrückung der D-Immunisierung durch die Verabreichung von passivem IgG-Anti-D noch geklärt werden muss, ist bekannt, dass D-positive Erythrozyten von Makrophagen über Interaktionen mit dem IgG-Fc-Rezeptor (FcγR) rasch in die Milz gespült und nicht immunogen gemacht werden. Um sicherzustellen, dass eine prophylaktische Anti-D-Immunisierung gegen eine große FMH wirksam ist, werden die Frauen 2-3 Tage später getestet, um zu prüfen, ob die fetalen Zellen aus dem Kreislauf entfernt wurden. Ansonsten haben allogene Erythrozyten eine lange Überlebensdauer nach FMH oder Transfusion. Alloimmunreaktionen entwickeln sich nur langsam, typischerweise 5-15 Wochen für Anti-D . Dies ist wahrscheinlich auf das Fehlen von Gefahrensignalen (von Fremdmolekülen) zurückzuführen, so dass die Erythrozyten vom Immunsystem nicht erkannt werden, bis sie altern, was dann ihre Phagozytose über Phosphatidylserinrezeptoren stimuliert. Ohne RhD-Prophylaxe werden etwa 17 % der D-negativen Frauen nach der Schwangerschaft mit einem D-positiven Fötus immunisiert. Diese Inzidenz ist geringer als bei absichtlich immunisierten Normalpersonen (bis zu ca. 85 % reagieren), da bei den meisten Frauen die FMH-Mengen zu gering sind, um die Erythrozyten immunogen zu machen. Schwangere Frauen können robuste Alloimmunreaktionen zeigen, während sie ihren halb-allogenen Fötus tolerieren.

In den letzten 20 Jahren wurden 19 Anti-D-mAbs und rAbs in 15 Erststudien am Menschen getestet. Diese wurden kürzlich überprüft und sind hier zusammengefasst. Es traten keine schwerwiegenden unerwünschten Wirkungen auf. Die biologischen In-vitro-Tests der FcγR-vermittelten Phagozytose und Hämolyse mit menschlichen Effektorzellen sind gut etabliert und wurden für das Screening verwendet. In den klinischen Studien wurde die Fähigkeit der Antikörper bewertet, kleine Mengen (weniger als 1 %) D-positiver Erythrozyten aus dem Blutkreislauf zu entfernen, und in einigen Studien wurde auch die Fähigkeit des Anti-D bestimmt, eine D-Immunisierung zu verhindern. Viele der mAbs und rAbs wurden direkt mit polyklonalem Anti-D verglichen.

Eine große Heterogenität in der Wirksamkeit der Antikörper wurde beobachtet (Tabelle 1). Zwei von humanen B-Lymphoblastoid-Zelllinien abgeleitete mAbs, BRAD-3 und BRAD-5, vermittelten eine rasche Erythrozyten-Clearance und verhinderten eine D-Immunisierung fast ebenso wirksam wie polyklonales Anti-D, obwohl eine drei- bis vierfach höhere Dosis verwendet wurde. Die Plasmahalbwertszeiten von BRAD-3 und BRAD-5 waren normal, aber die Bioverfügbarkeit war halb so hoch wie die von polyklonalem Anti-D. Wenn diese Antikörper als rAbs in CHO-Zellen exprimiert wurden, war die Clearance von autologen D-positiven Erythrozyten langsamer als bei den ursprünglichen mAbs. Eine große Studie mit einem anderen aus CHO-Zellen gewonnenen Anti-D-rAb, MonoRho, ergab enttäuschende Ergebnisse: Die Erythrozyten-Clearance war extrem variabel, in der Regel sehr langsam und ohne Korrelation zur Anti-D-Dosis. Die sehr geringe Bioverfügbarkeit von MonoRho könnte dies teilweise erklären. Die Probanden produzierten jedoch kein Anti-D, obwohl sie keine Challenge-Injektionen mit D-positiven Erythrozyten erhielten, um ihren D-Immunisierungsstatus zu bestimmen. MAbs, die von Maus-Myelom-Zelllinien (als Maus-Human-Heterohybridome) produziert wurden, zeigten ebenfalls eine große Variabilität in der Erythrozyten-Clearance, aber überraschenderweise wurde mehr als die Hälfte der Empfänger schnell D-immunisiert, doppelt so viele wie bei Erythrozyten allein. Diese Anti-D-Antikörper hatten also eine unterstützende Wirkung, indem sie die Immunantwort auf D-positive Erythrozyten verstärkten, anstatt sie wie beabsichtigt zu verhindern. Spätere Studien mit Anti-D-rAbs, die von Rattenmyelomzellen produziert wurden, zeigten, dass sie eine extrem schnelle Beseitigung autologer Erythrozyten förderten, schneller als polyklonales Anti-D . Der Effekt einer Änderung der Zelllinie, die FOG-1 exprimiert, von der Maus zur Ratte war auffallend und veränderte die Clearance von sehr langsam und unvollständig zu sehr schnell. In der letztgenannten Studie war dies mit einer Hämolyse, einer gewissen Ausscheidung in die Leber und fiebrigen Reaktionen verbunden. Diese Reaktionen treten nach einer Prophylaxe mit polyklonalem Anti-D nicht auf. Unerwarteterweise vermittelten Mutanten von FOG-1 rAb, denen es in vitro an FcγR-Wechselwirkungen fehlte, ebenfalls eine schnelle Erythrozyten-Clearance, obwohl ein normales Überleben erwartet worden war. Diese IgG-Anti-Ds müssen an andere Rezeptoren als IgG FcγR gebunden haben.

Viele der Anti-D-mAbs und rAbs verhielten sich nicht wie polyklonales Anti-D. Keines war ganz so wirksam, und einige aus Nagerzelllinien führten sogar zu unerwünschten Immunreaktionen. Die In-vivo-Reaktionen wurden hauptsächlich durch die Art der Zelllinie bestimmt, die die Antikörper produziert, und nicht durch die Proteinsequenzen. Die Ursache für diese unerwarteten und möglicherweise schädlichen Reaktionen könnte darin liegen, dass die aus tierischen Zellen hergestellten IgG-Anti-D mit Komponenten des angeborenen Immunsystems interagierten. Die wahrscheinlichste Erklärung ist die unterschiedliche Zusammensetzung der Oligosaccharide.

Die Art der Glykosylierung von IgG hängt von der Zelle ab, in der es produziert wird, und ist artspezifisch. Strukturen wie N-Glykolyl-Neuraminsäure und Oligosaccharide mit hohem Mannosegehalt auf IgG von Nagetieren können von angeborenen Mustererkennungsrezeptoren (PRRs) des Immunsystems als fremd erkannt werden, was zu entzündungsfördernden Reaktionen führt. Zu den PRRs gehören zelluläre Asialoglykoprotein- und Mannoserezeptoren. Nach der Bindung von Anti-D auf D-positiven Erythrozyten könnten sie Antikörperreaktionen gegen das D-Antigen stimuliert haben. Im Plasma kann das Mannan-bindende Lektin eine Komplement-vermittelte Hämolyse auslösen, wenn es an die Mannosereste von Anti-D auf einer Erythrozyte gebunden ist. Endogene IgG-Antikörper, die Galactose-α1,3-Galactose auf Mäuse-IgG erkennen, könnten Anti-D binden, das dieses Oligosaccharid exprimiert. Kürzlich haben endogene IgE-Antigalaktose-α1,3-Galaktose-Antikörper bei einigen Patienten, die Cetuximab (ein Krebsimmuntherapeutikum) erhielten, das in SP2/0-Mausmyelomzellen produziert wurde, Überempfindlichkeitsreaktionen ausgelöst. Das Fehlen von Sialinsäure bei vielen Anti-D-MAbs und rAbs würde dazu führen, dass das IgG bei der Bindung von FcγR pro-inflammatorisch wirkt.

Polyklonales Anti-D kann in verschiedenen klinischen Situationen entweder nützlich oder tödlich sein. Die Dosis der Zielerythrozyten ist ein wichtiger Faktor. Die Beseitigung kleiner Mengen von Erythrozyten, wie bei FMH, ist ein „stiller“, nicht entzündlicher, nicht hämolytischer Prozess. Wenn jedoch eine D-positive Person hohe Dosen von Anti-D erhält, wie z. B. bei einem Fötus mit hämolytischer RhD-Erkrankung oder, selten, bei ITP-Patienten, die mit IV-Anti-D behandelt werden, kann es zu einer schweren Hämolyse kommen. In diesen gelegentlich tödlichen Fällen sind die zusätzlichen Symptome in der Regel Hydrops (Ödem) bei HDFN und akute Hämoglobinämie, Hämoglobinurie und disseminierte intravasale Gerinnung bei ITP-Patienten. Die meisten Fälle von akuter Hämolyse wurden eher als Folge einer robusten extravaskulären (durch Makrophagen vermittelten) Hämolyse denn als Folge einer intravaskulären Hämolyse betrachtet. Auch ohne solche schwerwiegenden unerwünschten Ereignisse kommt es bei ITP-Patienten nicht selten zu Fieber und Schüttelfrost nach der Infusion von intravenösem Anti-D, was auf Entzündungsreaktionen hinweist. Würden ITP-Patienten mit entzündungsfördernden Anti-D-mAbs oder rAbs anstelle des derzeitigen polyklonalen Anti-D behandelt, könnte dies zu einer komplexen Reihe unbeabsichtigter und potenziell gefährlicher Reaktionen führen.

Im Anschluss an die TGN1412-Phase-1-Studie können einige Aspekte der klinischen Versuche mit Anti-D für die künftige Entwicklung und Regulierung von First-in-Man-Studien anderer Immuntherapeutika hilfreich sein, insbesondere solcher, die auf Zellen im Blut abzielen (Tabelle 2). Die Wahl der Anfangsdosis ist besonders wichtig. Bei allen Arbeiten am Menschen wurden niedrige Dosen von Erythrozyten und Anti-D verwendet. In einigen Studien, z. B. für BRAD-3 , wurden autologe Erythrozyten (0-5 ml) ex vivo mit Anti-D beschichtet, dann gewaschen und injiziert, wodurch die Antikörperdosis minimiert und die Möglichkeit unerwünschter Wirkungen verringert wurde. Die Ausscheidung solch kleiner Mengen roter Zellen konnte genau verfolgt werden, wenn sie isotopisch markiert waren. Als sich dieser Antikörper als sicher und wirksam erwies, wurden Anti-D und Erythrozyten getrennt injiziert, um die klinische Situation besser zu simulieren. Hinweise auf Entzündungsreaktionen bei niedrigen Dosen von Anti-D und Erythrozyten sollten bei Scale-up-Studien Vorsicht walten lassen.

Zusammenfassend lässt sich feststellen, Die umfangreichen Daten aus Humanstudien zu Anti-D-MAbs und rAbs deuten darauf hin, dass ihre Glykosylierung einen starken Einfluss auf die Modulation ihrer In-vivo-Aktivitäten gehabt haben könnte. Einige rAbs erhöhten die Inzidenz der D-Immunisierung eher als dass sie sie verringerten, eines verursachte schädliche hämolytische Reaktionen und eines hatte eine extrem niedrige Bioverfügbarkeit. Diese Wirkungen waren bei den durchgeführten In-vitro-Studien nicht vorhergesagt worden. In Zukunft sollte bei der Entwicklung rekombinanter Glykoproteine für die Humantherapie die Möglichkeit in Betracht gezogen werden, dass Wechselwirkungen zwischen nicht-menschlichen Oligosacchariden und anderen Zellen oder Molekülen als dem vorgesehenen Liganden auftreten können.