Klinische Phase-1-Studie mit Trametes versicolor bei Frauen mit Brustkrebs

Abstract

Einführung. Oral verabreichte Zubereitungen aus dem Pilz Trametes versicolor (Tv) sollen die Immunantwort bei Frauen mit Brustkrebs nach einer Standard-Chemotherapie und Strahlentherapie verbessern. Methoden. In einer Phase-I-Studie mit zwei Zentren wurde die maximal verträgliche Dosis eines Tv-Präparats ermittelt, wenn es 6 Wochen lang täglich in geteilten Dosen eingenommen wurde, nachdem die Strahlentherapie kürzlich abgeschlossen worden war. Es wurden elf Teilnehmerinnen rekrutiert, und neun Frauen schlossen die Studie ab. Jede Kohorte bestand aus drei Teilnehmerinnen, die eine von drei Tv-Dosen (3, 6 oder 9 Gramm) erhielten. Die Immundaten wurden vor und nach der Bestrahlung, zu 3 Zeitpunkten während der Behandlung und nach einer 3-wöchigen Auszeit erhoben. Ergebnisse. Es wurden neun unerwünschte Ereignisse gemeldet (7 leichte, 1 mittelschweres und 1 schweres), was darauf schließen lässt, dass Tv gut vertragen wurde. Die immunologischen Ergebnisse deuteten auf Tendenzen hin: (1) erhöhte Lymphozytenzahlen bei 6 und 9 Gramm/Tag; (2) erhöhte funktionelle Aktivität der natürlichen Killerzellen bei 6 Gramm/Tag; (3) dosisabhängiger Anstieg der CD8+ T-Zellen und CD19+ B-Zellen, jedoch nicht der CD4+ T-Zellen oder CD16+56+ NK-Zellen. Schlussfolgerung. Diese Ergebnisse zeigen, dass ein Tv-Präparat in einer Dosierung von bis zu 9 g/Tag bei Frauen mit Brustkrebs in der postprimären Behandlungsphase sicher und verträglich ist. Dieses Tv-Präparat kann den Immunstatus bei immungeschwächten Brustkrebspatientinnen nach einer primären onkologischen Standardbehandlung verbessern.

1. Einleitung

Trametes versicolor (Tv), auch bekannt als Coriolus versicolor und gemeinhin als Truthahnschwanz bezeichnet, ist eine Pilzart, aus der Zubereitungen hergestellt werden, die seit langem in der traditionellen asiatischen Medizin verwendet werden. Zwei Proteoglykanfraktionen, Polysaccharid-K (PSK) und Polysaccharid-Peptid (PSP), sind ähnliche Heißwasserextrakte aus Tv, die Berichten zufolge krebshemmend wirken. In Japan wird PSK Krebspatienten routinemäßig verschrieben, sowohl während als auch nach der Strahlen- und Chemotherapie. Auch viele naturheilkundliche Ärzte (ND) und integrative Onkologen (MD) in den USA verschreiben Brustkrebspatientinnen üblicherweise ganzes, gefriergetrocknetes Tv. Man geht davon aus, dass die immunologische Aktivität des Tv der Hauptmechanismus ist, der für seine Antitumorwirkung und seine Auswirkungen auf die Überlebensraten verantwortlich ist. Der Wirkmechanismus von Trametes versicolor beinhaltet die Verstärkung sowohl der angeborenen als auch der adaptiven Immunantwort, zumindest teilweise über die Aktivität des Toll-like-2-Rezeptor-Agonisten. Präklinische Tierstudien und vorläufige klinische Daten stützen die Hypothese, dass Tv-Derivate bei der Behandlung sowohl von Östrogenrezeptor-negativen als auch von Östrogenrezeptor-positiven Krebsarten vorteilhaft sein können, indem sie die immunologischen depressiven Wirkungen der Behandlung abschwächen und das krankheitsfreie Überleben durch Verbesserung der immunologischen Überwachung und Überwindung der Tumorantigen-Toleranz verbessern.

Das Verständnis dafür, wie immunologische Faktoren durch Behandlungen bei Brustkrebs beeinflusst werden, deutet auf vielversprechende Bereiche hin, auf die man sich bei der Entwicklung von Zusatztherapien zur Stärkung der Antitumor-Immunantwort konzentrieren sollte. Jüngste Daten zeigen, dass bestimmte Klassen von Chemotherapeutika ein immunogenes Absterben von Tumorzellen verursachen, was zu einer Verbesserung der Antigen-Kreuzpräsentation und einer Stimulierung der Antitumor-Immunantwort führt. Es gibt Hinweise darauf, dass NK-Zellen eine wichtige Rolle bei der Prävention sowohl von Brustkrebs im Frühstadium als auch von metastasierendem Brustkrebs spielen. Bei einigen Brustkrebspatientinnen wurde ein Mangel an NK-Zellaktivität gegen K562-Zielzellen festgestellt. Aktuelle Daten deuten darauf hin, dass Brustkrebspatientinnen, die eine Operation, Chemo- und Strahlentherapie hinter sich haben, ein immunologisches Defizit aufweisen. Andersen et al. haben berichtet, dass das Stressniveau bei Brustkrebspatientinnen signifikant eine geringere NK-Zell-Lyse sowie eine verminderte proliferative Reaktion auf periphere Blutlymphozyten vorhersagt. Unsere frühere Beobachtungsstudie bestätigte, dass Lymphopenie und niedrige NK-Zellaktivität während der gesamten 6 Wochen nach Abschluss der Strahlentherapie vorhanden waren.

Um den potenziellen Nutzen von Trametes versicolor bei Frauen mit Brustkrebs besser zu verstehen, war eine Dosis-Eskalationsstudie zur Bewertung der Sicherheit und Verträglichkeit erforderlich. Zu diesem Zweck führte ein multidisziplinäres Team der Universität von Minnesota und der Bastyr University eine Phase-1-Dosis-Eskalationsstudie durch, um die Sicherheit und die maximal verträgliche Dosis von Tv bei Frauen mit diagnostiziertem Brustkrebs zu bestimmen, die sich einer Standardbehandlung für Brustkrebs unterzogen und bereit waren, nach der Strahlentherapie an einer neunwöchigen Studie teilzunehmen.

2. Methoden

2.1. Dosis-Eskalation der Studie

Es wurde ein Standard-Phase-1-Design mit 3 Probanden pro Dosisstufe verwendet, bis die MTD (maximal verträgliche Dosis) erreicht ist. Das Dosis-Eskalationsschema für jede Kohorte von Tv war 3 gm (die am häufigsten verwendete Dosis); 6 gm; 9 gm; 12 gm; 18 gm; 24 gm. Für diese Studie wurde nur die 9-Gramm-Kohorte rekrutiert (𝑁=9).

2.2. Studienteilnehmerinnen

Frauen im Alter zwischen 21 und 75 Jahren, bei denen Brustkrebs im Stadium I, II oder III diagnostiziert wurde und die sich einer Operation und Chemotherapie unterzogen hatten und bereit waren, mit einer Strahlentherapie zu beginnen, wurden nach schriftlicher Einwilligung in die Studie aufgenommen. Zur Teilnahmeberechtigung gehörte auch die Bereitschaft, während der gesamten Studie eine konsequente Diät zu halten und während der Strahlentherapie und bis zum Abschluss der Studie auf Pilze und andere pflanzliche Produkte mit bekannter immunmodulierender Wirkung zu verzichten. Vor der Teilnahme an der Studie mussten die hämatologischen, renalen und hepatischen Grundfunktionen innerhalb normaler Grenzen liegen. Die Studie wurde am Krebszentrum der University of Minnesota in Minneapolis, Minnesota, und an der Bastyr University in Ken more, Washington, durchgeführt. Die Studie wurde von den IRB-Ausschüssen der University of Minnesota und der Bastyr University genehmigt. Zwischen Januar 2008 und Juni 2010 erfüllten elf Frauen mit Brustkrebs im Stadium I-III die engen Kriterien für diese Studie, stimmten der Teilnahme zu und wurden nacheinander in die niedrigste Dosierungskohorte aufgenommen. Jeweils drei Teilnehmerinnen aus den Kohorten 3 gm, 6 gm und 9 gm schlossen die Studie ab. Zwei der Teilnehmerinnen schieden nach dem zweiten Besuch aus der Studie aus, weil sie Schwierigkeiten hatten, in die Klinik zu kommen. Die neun Frauen, die die Studie abschlossen, waren zwischen 38 und 68 Jahre alt, sechs ER-negativ und drei ER-positiv, drei im Stadium I, zwei im Stadium II und vier im Stadium III des Brustkrebses. Eine der Frauen, die die Studie abschlossen, unterzog sich vor der Bestrahlung keiner Chemotherapie, und dem IRB wurde ein Verstoß gegen das Zulassungsprotokoll gemeldet.

2.3. Ergebnismessungen

Das primäre Ziel der Studie war es, die Sicherheit und Verträglichkeit von Trametes versicolor bei Frauen mit Brustkrebs in der postradiotherapeutischen Situation zu bewerten. Die neun Teilnehmerinnen der Dosis-Eskalationsstudie wurden auf unerwünschte Ereignisse (AEs) überwacht, wobei sowohl klinische als auch Labormethoden und Kriterien der dosislimitierenden Toxizität (DLT) zum Einsatz kamen, die als jede behandlungsbedingte Toxizität des Grades 2 oder höher definiert sind, die anhand der Common Terminology Criteria for Adverse Events V 3.0 (CTCAE) des NCI bewertet wurde. Die Frauen wurden wöchentlich auf unerwünschte Ereignisse während der Verabreichung des Präparats untersucht, entweder bei ihrem Klinikbesuch oder durch telefonisches Screening zwischen den Besuchen. Das sekundäre Ziel bestand darin, vorläufige Daten zu sammeln, die die Ausgangssituation vor und nach der Bestrahlungstherapie sowie immunologische Messwerte während und nach der Behandlung verglichen, darunter das komplette Blutbild mit Differentialblutbild, die Aktivität der natürlichen Killerzellen (NK), der T-Regulatorzellen-Assay, der T/B/NK-Zell-Subset-Assay, der Phagozytose-Index und die Zytokinwerte. Die statistische Analyse, einschließlich t-Tests für unabhängige Stichproben und einseitiger ANOVAs mit türkischem Post-hoc-Mehrfachvergleich, wurde mit GraphPad Prism, Version 5.04 (GraphPad Software, Inc., La Jolla, CA) durchgeführt. Um die Aussagekraft und den Stichprobenumfang zu erhöhen, wurden die Daten einer Beobachtungsstudie (𝑁=14), die von unseren Zentren seit 2006 durchgeführt wurde, mit der aktuellen Dosis-Eskalationsstudie (𝑁=9) kombiniert. Die Zulassungskriterien waren für beide Studien identisch (𝑁=23).

2.4. Pilzarzneimittel

Trametes versicolor gefriergetrocknetes Myzelpulver wurde von Paul Stamets (Fungi Perfecti, Inc., Olympia, WA) bezogen und von Beehive Botanicals (Hayward, WI) verkapselt. Jede Kapsel enthielt 500 mg des Produkts. Die FDA IND-Zulassung (# 75.405) wurde 2007 erteilt.

2.5. Immunkrämpfe

2.5.1. Vollständiges Blutbild mit Differenzialdiagnose

Die klinischen Labortests (CBC, Chemie, Serum-Schwangerschaftstests und Urinanalyse) wurden für die Teilnehmer, die am Standort der Bastyr University rekrutiert wurden, am Department of Laboratory Medicine der University of Washington und für die Teilnehmer, die am Standort der University of Minnesota rekrutiert wurden, am University of Minnesota Fairview Diagnostic Laboratory durchgeführt.

2.5.2. Funktionelle Aktivität der natürlichen Killerzellen

Der gemessene Immunzell-Teilsatz umfasste die NK-Zellaktivität, den T-Regulatorzellen-Assay, den T/B/NK-Zell-Teilsatz-Assay, den Phagozytenindex und die Zytokinwerte. Die immunologischen Tests wurden im Labor der Bastyr University für die an beiden Standorten rekrutierten Probanden durchgeführt. Das am General Clinical Research Center (GCRC) der University of Minnesota entnommene Blut wurde über Nacht zur Bastyr University transportiert. Die Qualität des von der University of Minnesota nach Bastyr transportierten Blutes wurde anhand der folgenden Kriterien bewertet. Bei Proben, die beim Eintreffen im Bastyr-Labor älter als 48 Stunden waren, wurden die Lymphozyten isoliert und die Lebensfähigkeit der Zellen durch Trypanblau-Färbung bestimmt. Wenn die Lebensfähigkeit über 80 % lag, wurde der Test durchgeführt. Bei einer Lebensfähigkeit von weniger als 80 % wurden die Proben verworfen. Mononukleäre Zellen des peripheren Blutes (PBMCs) wurden mittels Ficoll-Hypaque-Gradient (Dichte = 1,070 g/mL) isoliert, zweimal in PBS gewaschen und in RPMI 1640, 10 % FBS mit 2 mM L-Gln und Penicillin-Streptomycin (1000 U/mL; 1 mg/mL) gehalten. Die NK-Zellaktivität dieser PBMC-Proben, gemessen an der Fähigkeit, K562-Tumor-Targetzellen abzutöten, wurde in dreifacher Ausführung im Verhältnis von Effektor zu Target (E : T) von 50 : 1, 25 : 1 und 12,5 : 1 nach veröffentlichten Methoden bestimmt. Die Zielzellen wurden mit 3,3′-Dioctadecyloxacarbocyaninperchlorat (DiOC18) markiert und vier Stunden lang mit PBMC-Effektorzellen ko-kultiviert. Zur Bestimmung des spontanen Absterbens von Zielzellen wurde eine Kontrollprobe mit ausschließlich K562-Zellen einbezogen. Nach der Inkubation wurde Propidiumjodid zugegeben, um abgestorbene Zellen nachzuweisen. Der Prozentsatz der abgetöteten Zielzellen wurde durch Subtraktion des Prozentsatzes der spontanen Lysen vom Prozentsatz der spezifischen Lyse (PSL) des jeweiligen E : T-Verhältnis. Zur Darstellung der standardisierten NK-Zellaktivität wurden die lytischen Einheiten mit einem zuvor veröffentlichten und validierten Softwareprogramm unter Verwendung der folgenden Parameter berechnet: Target pro Vertiefung = 10.000; LU pro Zelle = 107; Kurvenmaximum = 48; Prozent Lysen = 20 . LU20-Werte, definiert als das E : T-Verhältnis, bei dem 20 % der Zielzellen absterben, wurden aus Dosis-Wirkungs-Kurven von PSL gegenüber dem log E : T-Verhältnis für jede untersuchte Blutprobe extrapoliert.

2.5.3. Immunphänotypisierung von PBMC-Subtypen

PBMC-Suspensionen (5×105 Zellen) wurden in drei Röhrchen gegeben, in PBS gewaschen, geschleudert, der Überstand abgetrennt und die Zellpellets in 100 μl PBS resuspendiert. PBMCs in Röhrchen 1 wurden mit CD3-PC5, CD4-PE und CD8-FITC gefärbt; Röhrchen 2: CD3-PC5, CD16-FITC und CD56-PE; Röhrchen 3: CD14-PC5. Die Röhrchen wurden kurz geschüttelt, abgedeckt und 15 Minuten lang auf Eis inkubiert. Danach wurden die Zellen zweimal in kaltem PBS gewaschen, auf 0,5 ml in PBS resuspendiert und der prozentuale Anteil der PBMC-Untergruppen durch eine durchflusszytometrische Analyse mit einem Beckman Coulter FC500 und CXP-Software bestimmt.

2.6. Klinisches Studienprotokoll

Die Studiendauer betrug neun Wochen und begann nach Abschluss der Strahlentherapie. Sie umfasste eine sechswöchige Produktanwendung, gefolgt von einer dreiwöchigen „Wash-out“-Phase ohne Produktanwendung (Abbildung 1). Die Patienten wurden nach Abschluss der Chemotherapie und vor Beginn der Strahlentherapie untersucht und als für die Studie geeignet eingestuft. Für die Studie waren sechs Besuche in den klinischen Forschungszentren erforderlich. Der erste Studientermin fand vor Beginn der Strahlentherapie statt, bei dem die Ausgangswerte ermittelt wurden. Innerhalb der ersten Woche nach Abschluss der Bestrahlung hatten die Teilnehmer ihren zweiten Besuch, bei dem die Laborwerte ermittelt wurden und die neunwöchige Studie begann. Die Teilnehmer erhielten sechs Wochen lang das Tv-Produkt und kehrten im Abstand von zwei Wochen zum dritten, vierten und fünften Besuch ins Forschungszentrum zurück, um Laborwerte zu erheben und die Verträglichkeit des Produkts sowie unerwünschte Ereignisse zu beurteilen. Der letzte (sechste) Besuch fand nach neun Wochen statt, nachdem das Produkt drei Wochen lang nicht eingenommen worden war, und diente der abschließenden Laborentnahme und der Bewertung etwaiger anhaltender unerwünschter Ereignisse.

Das Dosis-Eskalationsprotokoll umfasste Kohorten von mindestens drei Teilnehmern, die täglich sechs Wochen lang Tv in geteilten Dosen oral einnahmen. Die erste Kohorte nahm 3 Gramm/Tag in zwei geteilten Dosen ein; die zweite Kohorte nahm 6 Gramm/Tag in zwei geteilten Dosen ein; die dritte Kohorte nahm 9 Gramm/Tag in drei geteilten Dosen ein. Drei Gramm pro Tag ist die in der naturheilkundlichen Praxis am häufigsten verwendete Dosis, und in Japan werden sogar 9 Gramm verwendet. Ziel der Studie war es, die maximal verträgliche Dosis (MTD) zu ermitteln, die Sicherheit und Verträglichkeit gewährleistet (Tabelle 1).

3. Ergebnisse

3.1. Unerwünschte Ereignisse

Die Ergebnisse dieser Dosis-Eskalationsstudie zeigten, dass bis zu 9 Gramm/Tag des Tv-Präparats bei Frauen mit Brustkrebs über sechs Wochen in der Nachbestrahlungsbehandlung gut vertragen wurden. Es traten neun unerwünschte Ereignisse auf: sieben leichte, ein mittelschweres und nur ein unerwünschtes Ereignis des Grades 3, bei dem es sich um eine Angstattacke bei einer Teilnehmerin handelte, die wahrscheinlich nicht auf die Studienmedikation zurückzuführen war (Tabelle 2). Zu den weiteren gemeldeten leichten unerwünschten Ereignissen gehörten vorübergehendes Sodbrennen, Herzklopfen, Verstopfung, Brustschmerzen, Fieber, Strahlendermatitis und Erkältungs-/Grippesymptome. Alle drei Dosen wurden gut vertragen, und die Teilnehmer hatten keine Schwierigkeiten, dreimal täglich bis zu 9 Kapseln zu schlucken. Bemerkenswert ist, dass weder Übelkeit noch Magen-Darm-Beschwerden gemeldet wurden, zwei Nebenwirkungen, die in früheren klinischen Studien mit anderen Tv-Extrakten berichtet wurden.

3.2. Immunreaktion

Das Kompartiment der roten Blutkörperchen wurde sowohl durch die Strahlentherapie (RT) als auch durch die Verabreichung von Tv nicht beeinträchtigt. Die absolute Anzahl der roten Blutkörperchen, das Hämoglobin und der Hämatokrit waren bei der ersten Visite, d.h. am Tag vor Beginn der RT, normal und blieben während der gesamten Studie innerhalb der normalen Grenzen. Die absoluten Werte der weißen Blutkörperchen und der neutrophilen Granulozyten lagen bei allen Frauen sowohl vor und nach der RT als auch in den Wochen nach der RT, während sie Tv einnahmen, im Allgemeinen im Normbereich (Daten nicht gezeigt). Die absoluten Lymphozytenzahlen zeigten jedoch ein anderes Muster als die anderen CBC-Untergruppen. Da die Zulassungskriterien in den von unseren Zentren seit 2006 durchgeführten Studien identisch waren, haben wir zur Erhöhung der Aussagekraft die Daten unserer Beobachtungsstudie (𝑁=14), die gezeigt hat, dass die RT bei Frauen mit Brustkrebs im Stadium I-III zu Immundefekten führt, mit unserer aktuellen Dosis-Eskalationsstudie (𝑁=9) kombiniert. Bei der kombinierten Anzahl von 23 Frauen in beiden Studien mit Brustkrebs im Stadium I-III nach Brustoperation und Chemotherapie, die anschließend eine Strahlentherapie erhielten, lagen die Lymphozyten vor der RT im normalen Bereich, fielen aber nach der RT auf abnorm niedrige Werte ab. Die mittlere Lymphozytenzahl aller 23 Probandinnen lag vor der RT bei 1,027±0,298 und sank nach der RT um 20 % auf 0,681±0,254, ein Unterschied, der statistisch signifikant war. In der Dosis-Eskalationsstudie führten die beiden höheren oralen Dosen (6 und 9 g) von Tv zu einer früheren Erholung der Lymphozytenzahlen (Abbildung 2). Die Zahl der Lymphozyten erholte sich in der Beobachtungsgruppe allmählich, aber die mittleren Lymphozytenzahlen blieben 6 Wochen nach der RT unter denen der 6- und 9-Gramm-Tv-Kohorten. Aufgrund der geringen Anzahl für jede Dosis-Kohorte (𝑁=3) wurde eine statistische Signifikanz nur zwischen der Beobachtungsgruppe und der 9-g-Gruppe zum Zeitpunkt 2 Wochen nach der Strahlentherapie festgestellt. Die Strahlentherapie führte bei Frauen mit Brustkrebs im Stadium I-III, die eine Operation und Chemotherapie hinter sich haben, zu einer statistisch signifikanten Verringerung der absoluten Zahl der Lymphozyten (siehe Abbildung 2).

Die funktionelle Aktivität der natürlichen Killerzellen war bei allen 23 Frauen mit Brustkrebs von vor bei allen 23 Brustkrebspatientinnen, die die ersten beiden Besuche entweder in der Beobachtungsstudie (𝑁=14) oder in der Dosissteigerungsstudie (𝑁=9) absolvierten. Abbildung 3 zeigt, dass die mittlere NK-Zellaktivität vor der RT 19,941±18,959 betrug und nach der RT auf 9,872±13,454 abnahm (𝑁=23). Dieser Rückgang war statistisch signifikant (𝑡(44)=2,077, 𝑃=0,043). Ein Trend zu erhöhter NK-Zellaktivität wurde in der Kohorte mit 6 g Tv-Dosis beobachtet.