Fluoreszenz

Fluoreszenz ist eine Lumineszenz, die meist als optisches Phänomen in kalten Körpern auftritt, wobei die molekulare Absorption eines Photons einer bestimmten Wellenlänge die Emission eines anderen Photons mit einer längeren Wellenlänge auslöst. Die fluoreszierende Substanz wird als Fluorophor bezeichnet. Die Energiedifferenz zwischen den absorbierten und den emittierten Photonen wird in Form von Molekülschwingungen oder Wärme abgegeben. Normalerweise liegt das absorbierte Photon im ultravioletten Bereich und das emittierte Licht im sichtbaren Bereich, aber das hängt vom verwendeten Fluorophor und anderen Faktoren ab.

Fluoreszenz ist nach dem Mineral Fluorit benannt, das aus Kalziumfluorid besteht und dieses Phänomen häufig zeigt. Eine Vielzahl anderer Mineralien und organischer Stoffe fluoreszieren ebenfalls und werden für verschiedene Anwendungen genutzt. So dient die Fluoreszenz beispielsweise der Beleuchtung und Markierung von Molekülen in der analytischen Chemie und Biochemie. Fluorophore werden zur Markierung von Zellen, Antikörpern und anderen biologischen Strukturen sowie zur Bestimmung ihrer Struktur und Wirkungsweise verwendet.

Beispiele für fluoreszierende Materialien

Edelsteine, Mineralien, Fasern und viele andere Materialien, die in der Forensik oder im Zusammenhang mit verschiedenen Sammlerstücken anzutreffen sind, können eine ausgeprägte Fluoreszenz aufweisen oder unter kurzwelligem Ultraviolett, langwelligem Ultraviolett oder Röntgenstrahlen unterschiedlich fluoreszieren.

Viele Arten von Calcit und Bernstein fluoreszieren unter kurzwelligem UV. Rubine, Smaragde und der Hope-Diamant zeigen unter kurzwelligem UV-Licht eine rote Fluoreszenz; Diamanten leuchten auch unter Röntgenstrahlung.

Rohöl (Erdöl) fluoresziert in einer Reihe von Farben, von stumpfem Braun für schwere Öle und Teere bis hin zu leuchtendem Gelb und bläulichem Weiß für sehr leichte Öle und Kondensate. Dieses Phänomen wird bei Ölexplorationsbohrungen genutzt, um sehr kleine Ölmengen in Bohrklein und Kernproben zu identifizieren.

Organische Flüssigkeiten wie Gemische von Anthracen in Benzol oder Toluol oder Stilben in denselben Lösungsmitteln fluoreszieren bei ultravioletter oder Gammastrahlenbestrahlung. Die Abklingzeiten dieser Fluoreszenz liegen in der Größenordnung von Nanosekunden, da die Dauer des Lichts von der Lebensdauer der angeregten Zustände des fluoreszierenden Materials, in diesem Fall Anthracen oder Stilben, abhängt.

Anwendungen

Es gibt viele natürliche und synthetische Verbindungen, die Fluoreszenz aufweisen, und sie haben eine Reihe von Anwendungen. Einige Tiefseetiere, wie der Grünaugenfisch, nutzen die Fluoreszenz.

Beleuchtung

Die gewöhnliche Leuchtstoffröhre beruht auf Fluoreszenz. In der Glasröhre befinden sich ein Teilvakuum und eine kleine Menge Quecksilber. Eine elektrische Entladung in der Röhre bringt die Quecksilberatome dazu, Licht auszustrahlen. Das ausgestrahlte Licht liegt im ultravioletten (UV) Bereich, ist unsichtbar und für die meisten lebenden Organismen schädlich. Die Röhre ist mit einer Beschichtung aus einem fluoreszierenden Material, dem so genannten Leuchtstoff, ausgekleidet, der das ultraviolette Licht absorbiert und sichtbares Licht wieder abgibt. Leuchtstoffröhren sind im Vergleich zu Glühlampen sehr energieeffizient, aber die erzeugten Spektren können dazu führen, dass bestimmte Farben unnatürlich erscheinen.

Mitte der 1990er Jahre kamen weiße Leuchtdioden (LEDs) auf den Markt, die nach einem ähnlichen Verfahren funktionieren. In der Regel erzeugt der lichtemittierende Halbleiter Licht im blauen Teil des Spektrums, das auf eine auf dem Chip aufgebrachte Phosphorverbindung trifft; der Phosphor fluoresziert vom grünen bis zum roten Teil des Spektrums. Die Kombination des blauen Lichts, das den Leuchtstoff durchdringt, und des vom Leuchtstoff emittierten Lichts erzeugt eine Nettoemission von weißem Licht.

Die moderne Quecksilberdampf-Straßenlaterne soll sich aus der Leuchtstofflampe entwickelt haben.

Glühstifte oxidieren Phenyloxalatester, um Licht zu erzeugen.

Kompakte Leuchtstofflampen (CFL) entsprechen den typischen Leuchtstofflampen mit Vorteilen. Sie haben ein eigenes Vorschaltgerät und können Glühlampen in den meisten Anwendungen ersetzen. Sie erzeugen ein Viertel der Wärme pro Lumen wie Glühlampen und halten etwa fünfmal so lange. Diese Glühbirnen enthalten Quecksilber und müssen sorgfältig behandelt und entsorgt werden.

Analytische Chemie

Fluoreszenz in verschiedenen Wellenlängen kann mit einem Array-Detektor nachgewiesen werden, um Verbindungen aus dem HPLC-Fluss zu erkennen. Auch Dünnschichtchromatographie-Platten (TLC) können sichtbar gemacht werden, wenn die Verbindungen oder ein Färbereagenz fluoreszierend sind.

Fingerabdrücke können mit fluoreszierenden Verbindungen wie Ninhydrin sichtbar gemacht werden.

Biochemie und Medizin

Biologische Moleküle können durch eine einfache chemische Reaktion mit einer fluoreszierenden chemischen Gruppe (Fluorophor) markiert werden, und die Fluoreszenz der Markierung ermöglicht einen empfindlichen und quantitativen Nachweis des Moleküls. Beispiele hierfür sind:

• Die Fluoreszenzmikroskopie von Geweben, Zellen oder subzellulären Strukturen wird durch Markierung eines Antikörpers mit einem Fluorophor erreicht, so dass der Antikörper sein Zielantigen in der Probe finden kann. Die Markierung mehrerer Antikörper mit unterschiedlichen Fluorophoren ermöglicht die Visualisierung mehrerer Ziele in einem einzigen Bild.
• Automatisierte Sequenzierung von DNA durch die Kettenterminierungsmethode; jede der vier verschiedenen kettenabschließenden Basen hat ihre eigene spezifische Fluoreszenzmarkierung. Wenn die markierten DNA-Moleküle getrennt werden, wird die fluoreszierende Markierung durch eine UV-Quelle angeregt, und die Identität der Base, die das Molekül abschließt, wird durch die Wellenlänge des emittierten Lichts identifiziert.
• DNA-Nachweis: Die Verbindung Ethidiumbromid hat, wenn sie ihre Konformation in Lösung frei ändern kann, eine sehr geringe Fluoreszenz. Die Fluoreszenz von Ethidiumbromid wird stark verstärkt, wenn es an die DNA bindet, so dass diese Verbindung sehr nützlich ist, um die Lage von DNA-Fragmenten in der Agarosegel-Elektrophorese sichtbar zu machen. Ethidiumbromid kann giftig sein; eine sicherere Alternative ist der Farbstoff SYBR Green.
• Das DNA-Mikroarray
• Immunologie: Ein Antikörper ist mit einer fluoreszierenden chemischen Gruppe versehen, und die Stellen (z. B. auf einer mikroskopischen Probe), an die der Antikörper gebunden hat, können anhand der Fluoreszenz gesehen und sogar quantifiziert werden.
• FACS (fluoreszenzaktivierte Zellsortierung)
• Fluoreszenz wurde zur Untersuchung der Struktur und Konformationen von DNA und Proteinen mit Techniken wie dem Fluoreszenzresonanzenergietransfer verwendet, der Abstände auf Angström-Ebene misst. Dies ist besonders wichtig bei Komplexen aus mehreren Biomolekülen.
• Aequorin, das von der Qualle Aequorea victoria stammt, erzeugt in Gegenwart von Ca2+-Ionen (durch eine chemische Reaktion) ein blaues Glühen. Es wurde verwendet, um den Kalziumfluss in Zellen in Echtzeit darzustellen. Der Erfolg mit Aequorin spornte zu weiteren Untersuchungen von A. victoria an und führte zur Entdeckung des grün fluoreszierenden Proteins (GFP), das zu einem äußerst wichtigen Forschungsinstrument geworden ist. GFP und verwandte Proteine werden als Indikatoren für eine Vielzahl biologischer Vorgänge verwendet, z. B. für die subzelluläre Lokalisierung. Das Ausmaß der Genexpression wird manchmal gemessen, indem ein Gen für die GFP-Produktion mit einem anderen Gen verknüpft wird.

Auch viele biologische Moleküle haben eine intrinsische Fluoreszenz, die manchmal ohne die Notwendigkeit einer chemischen Markierung verwendet werden kann. Manchmal ändert sich diese intrinsische Fluoreszenz, wenn sich das Molekül in einer bestimmten Umgebung befindet, so dass die Verteilung oder Bindung des Moleküls gemessen werden kann. Bilirubin zum Beispiel ist stark fluoreszierend, wenn es an eine bestimmte Stelle auf Serumalbumin gebunden ist. Zinkprotoporphyrin, das in sich entwickelnden roten Blutkörperchen anstelle von Hämoglobin gebildet wird, wenn kein Eisen verfügbar ist oder Blei vorhanden ist, hat eine helle Fluoreszenz und kann zur Erkennung dieser Probleme verwendet werden.

Seit 2006 wächst die Zahl der Fluoreszenzanwendungen in der biomedizinischen Biologie und verwandten Wissenschaften. Die Analysemethoden in diesen Bereichen nehmen ebenfalls zu, wenn auch mit einer zunehmend unglücklichen Nomenklatur in Form von Akronymen wie: FLIM, FLI, FLIP, CALI, FLIE, FRET, FRAP, FCS, PFRAP, smFRET, FIONA, FRIPS, SHREK, SHRIMP, TIRF. Die meisten dieser Techniken basieren auf Fluoreszenzmikroskopen. Diese Mikroskope verwenden Lichtquellen mit hoher Intensität, in der Regel Quecksilber- oder Xenonlampen, LEDs oder Laser, um die Fluoreszenz in den zu beobachtenden Proben anzuregen. Optische Filter trennen dann das Anregungslicht von der emittierten Fluoreszenz, die mit dem Auge, einer (CCD-)Kamera oder anderen Lichtdetektoren (Photomultiplier-Röhren, Spektrographen usw.) erfasst werden kann. Es wird viel geforscht, um die Fähigkeiten solcher Mikroskope, die verwendeten Fluoreszenzsonden und die Anwendungen, für die sie eingesetzt werden, zu verbessern. Besonders erwähnenswert sind die konfokalen Mikroskope, die mit Hilfe einer Lochblende optische Schnitte durchführen und so eine quantitative 3D-Ansicht der Probe ermöglichen.

Sicherheit

Fluoreszenzlampen erzeugen weit weniger Abwärme als Glüh- und Halogenlampen. Halogenlampen sind in eine Vielzahl von Bränden verwickelt, und auch Glühlampen bergen aufgrund der Abwärme ein höheres Brandrisiko als Leuchtstofflampen. Lampen können versehentlich oder manchmal auch durch Ereignisse wie Erdbeben umstürzen. Die Verwendung von Leuchtstoffröhren kann daher ein Mittel sein, um versehentliche Brände zu verhindern. Allerdings können Leuchtstoffröhren Quecksilber enthalten, und der Bruch einer solchen Lampe könnte zu einem kostspieligen Quecksilberaustritt führen.

Theoretische Überlegungen

Photochemie

Fluoreszenz tritt auf, wenn ein Molekül oder ein Quantenpunkt nach einer elektronischen Anregung in seinen Grundzustand zurückkehrt.

Anregung: S 0 + h ν → S 1 {\displaystyle S_{0}+h\nu \zu S_{1}}

Fluoreszenz (Emission): S 1 → S 0 + h ν {\displaystyle S_{1}\zu S_{0}+h\nu } , wobei h ν {\displaystyle h\nu } ein allgemeiner Begriff für die Photonenenergie ist, wobei: h = Plancksches Wirkungsquantum und ν {\displaystyle \nu } = Frequenz des Lichts. (Die spezifischen Frequenzen von anregendem und emittiertem Licht hängen vom jeweiligen System ab.)

Der Zustand S0 wird als Grundzustand des Fluorophors (fluoreszierendes Molekül) bezeichnet und S1 ist sein erster (elektronisch) angeregter Zustand.

Ein Molekül in seinem angeregten Zustand, S1, kann sich auf verschiedenen konkurrierenden Wegen entspannen. Es kann eine „nicht-strahlende Relaxation“ durchlaufen, bei der die Anregungsenergie als Wärme (Schwingungen) an das Lösungsmittel abgegeben wird. Angeregte organische Moleküle können auch durch Umwandlung in einen Triplett-Zustand relaxieren, der anschließend durch Phosphoreszenz oder durch einen sekundären nicht-strahlenden Relaxationsschritt relaxieren kann.

Die Relaxation eines S1-Zustands kann auch durch Wechselwirkung mit einem zweiten Molekül durch Fluoreszenzlöschung erfolgen. Molekularer Sauerstoff (O2) ist aufgrund seines ungewöhnlichen Triplett-Grundzustands ein äußerst effizienter Fluoreszenzlöscher.

Moleküle, die durch Lichtabsorption oder durch einen anderen Prozess (z. B. als Produkt einer Reaktion) angeregt werden, können Energie auf ein zweites „sensibilisiertes“ Molekül übertragen, das in seinen angeregten Zustand überführt wird und dann fluoreszieren kann. Dieses Verfahren wird in Leuchtstäben verwendet.

Fluoreszenzquantenausbeute

Die Fluoreszenzquantenausbeute gibt die Effizienz des Fluoreszenzprozesses an. Sie ist definiert als das Verhältnis der Anzahl der emittierten Photonen zur Anzahl der absorbierten Photonen.

Φ = # p h o t o n s e m i t t e d # p h o t o n s a b s o r b e d {\displaystyle \Phi ={\frac {\rm {\#\ Photonen\ emittiert}}{\rm {\#\ Photonen\ absorbiert}}}}

Die maximale Fluoreszenz-Quantenausbeute beträgt 1,0 (100 Prozent); jedes absorbierte Photon führt zur Emission eines Photons. Verbindungen mit einer Quantenausbeute von 0,10 gelten noch als recht fluoreszierend. Eine andere Möglichkeit, die Quantenausbeute der Fluoreszenz zu definieren, ist die Zerfallsrate des angeregten Zustands:

k f ∑ i k i {\displaystyle {\frac {{k}_{f}}{\sum _{i}{k}_{i}}}}

wobei k f {\displaystyle {k}_{f}} die Rate der spontanen Emission von Strahlung ist und

∑ i k i {\displaystyle \sum _{i}{k}_{i}}

ist die Summe aller Zerfallsraten angeregter Zustände. Andere Raten des Zerfalls angeregter Zustände werden durch andere Mechanismen als die Photonenemission verursacht und werden daher oft als „nicht-radiative Raten“ bezeichnet, die Folgendes umfassen können: dynamische Kollisionslöschung, Dipol-Dipol-Wechselwirkung im Nahfeld (oder Resonanzenergietransfer), interne Umwandlung und Kreuzung zwischen Systemen. Ändert sich also die Rate eines der Wege, so wirkt sich dies sowohl auf die Lebensdauer des angeregten Zustands als auch auf die Fluoreszenzquantenausbeute aus.

Die Fluoreszenzquantenausbeute wird durch Vergleich mit einem Standard mit bekannter Quantologie gemessen; das Chininsalz, Chininsulfat, in einer Schwefelsäurelösung ist ein üblicher Fluoreszenzstandard.

Fluoreszenzlebensdauer

Die Fluoreszenzlebensdauer bezieht sich auf die durchschnittliche Zeit, die das Molekül in seinem angeregten Zustand verbleibt, bevor es ein Photon aussendet. Die Fluoreszenz folgt in der Regel einer Kinetik erster Ordnung:

= 0 e – Γ t , {\displaystyle \left=\left_{0}e^{-\Gamma t},}

wobei {\displaystyle \left} die Konzentration der Moleküle im angeregten Zustand zum Zeitpunkt t {\displaystyle t} , 0 {\displaystyle \left_{0}} ist die Anfangskonzentration und Γ {\displaystyle \Gamma } ist die Abklingrate oder der Kehrwert der Fluoreszenzlebensdauer. Dies ist ein Fall von exponentiellem Zerfall. Verschiedene strahlende und nichtstrahlende Prozesse können den ausgeschiedenen Zustand entvölkern. In diesem Fall ist die Gesamtzerfallsrate die Summe über alle Raten:

Γ t o t = Γ r a d + Γ n r a d {\displaystyle \Gamma _{tot}=\Gamma _{rad}+\Gamma _{nrad}}

wobei Γ t o t {\displaystyle \Gamma _{tot}} die Gesamtzerfallsrate ist, Γ r a d {\displaystyle \Gamma _{rad}} die Strahlungszerfallsrate und Γ n r a d {\displaystyle \Gamma _{nrad}} die nicht-strahlende Zerfallsrate. Es ist vergleichbar mit einer chemischen Reaktion erster Ordnung, bei der die Ratenkonstante erster Ordnung die Summe aller Raten ist (ein paralleles kinetisches Modell). Wenn die Rate der spontanen Emission oder eine der anderen Raten schnell ist, ist die Lebensdauer kurz. Bei häufig verwendeten fluoreszierenden Verbindungen liegen die typischen Abklingzeiten des angeregten Zustands für fluoreszierende Verbindungen, die Photonen mit Energien vom UV-Bereich bis zum nahen Infrarot emittieren, im Bereich von 0,5 bis 20 Nanosekunden. Die Fluoreszenzlebensdauer ist ein wichtiger Parameter für praktische Anwendungen der Fluoreszenz wie den Fluoreszenzresonanzenergietransfer.

Regeln

Es gibt mehrere Regeln, die sich mit der Fluoreszenz befassen. Die Kasha-Vavilov-Regel besagt, dass die Quantenausbeute der Lumineszenz unabhängig von der Wellenlänge der anregenden Strahlung ist.

Diese Regel ist nicht immer gültig und wird bei vielen einfachen Molekülen stark verletzt. Eine etwas zuverlässigere Aussage, wenn auch immer noch mit Ausnahmen, ist, dass das Fluoreszenzspektrum eine sehr geringe Abhängigkeit von der Wellenlänge der anregenden Strahlung zeigt.

Siehe auch

• Fluorescein
• Fluoreszenzlampe
• Licht
• Phosphoreszenz
• Röntgenstrahlung

• Lakowicz, Joseph R. 2006. Principles of Fluorescence Spectroscopy, 3. Aufl., New York: Springer. ISBN 978-0387312781
• Turro, Nicholas J. 1991. Modern Molecular Photochemistry. Mill Valley, CA: University Science Books. ISBN 0935702717
• Valeur, Bernard. 2002. Molecular Fluorescence: Principles and Applications. Weinheim: Wiley-VCH. ISBN 352729919X

Alle Links abgerufen am 14. April 2017.

• Fluorophores.org Die Datenbank der Fluoreszenzfarbstoffe
• Fluoreszenz auf Scienceworld
• Basic Concepts in Fluorescence