DNA-Synthese aus Diphosphat-Substraten durch DNA-Polymerasen

Ergebnisse und Diskussion

Zunächst testeten wir die DNA-Polymerasen Taq (aus Thermus aquaticus), High-Fidelity Vent (exo-, aus Thermococcus litoralis), Pfu (exo+, aus Pyrococcus furiosus), Deep Vent (exo+, aus Pyrococcus sp. GB-D) und Q5 (exo+) DNA-Polymerasen in herkömmlichen Polymerase-Kettenreaktionen (PCR) mit einem Desoxyribonukleosidmonophosphat (dGMP), dNDPs und dNTPs als Substrate (Abb. 1 A und B). Die Substitution eines der dNTPs durch dNDPs unterstützte die robuste DNA-Synthese, und weitere Experimente mit zwei, drei oder allen vier dNDPs anstelle von dNTPs unterstützten die PCR. Um sicherzustellen, dass die Produkte nicht von verunreinigten dNTPs stammten und dass die Reaktionen nicht durch Stabilisatoren in kommerziellen Puffern oder Enzymvorräten verstärkt wurden, testeten wir die DNA-Synthese aus gereinigten dNDPs mit selbst hergestellten Puffern und Enzymen. Wir haben auch bakterielle replikative Enzyme einbezogen, wie die bakteriellen replikativen DNA-Polymerasen aus dem thermophilen Bacillus stearothermophilus (Bst) und dem mesophilen Bacillus subtilis (Bsu, großes Fragment). Diese sowie archaeische Polymerasen aus Thermococcus kodakensis (KOD), Thermococcus sp. 9°N (9°N) und Thermococcus gorganarius (Tgo) zeigten robuste Primerverlängerungen unter Verwendung von nur 100 µM gereinigter dNDPs bei 60 °C (außer Bsu, das in allen Fällen bei 37 °C getestet wurde) (Abb. 1C). Die Primer-Verlängerungsreaktionen waren für alle diese Enzyme effizient, insbesondere für Deep Vent, KOD und 9°N. Vor dem Einbau von dA und dC in das naszierende Oligonukleotid wurde eine Pause beobachtet (Abb. 1 C und D), was darauf hindeutet, dass die KMs für dADP und dCDP hoch genug sind, um die Primerverlängerung bei einer Substratkonzentration von 100 µM zu verlangsamen.

Um einen mechanistischen Einblick in die Reaktion zu erhalten, untersuchten wir zunächst ihre Effizienz unter Verwendung des Taq-Enzyms. Die Variation der Verlängerungstemperatur von 50 °C auf 72 °C führte zu keinem erkennbaren Unterschied in der Menge des Volllängenprodukts. Um die kinetischen Analysen zu vereinfachen, wurden alle PCR-Reaktionen mit einem zweistufigen Temperaturzyklusprotokoll durchgeführt, bei dem der Primer im ersten Schritt bei 72 °C annealed und verlängert wurde und der Duplex im zweiten Schritt bei 95 °C geschmolzen wurde (Abb. S1A). Um die Raten der dNDP-Verwertung mit denen der kanonischen dNTPs zu vergleichen, wurde die Verlängerungszeit von 15 bis 120 s variiert. Bei einer Verlängerungszeit von 15 s produzierte die dNTP-Reaktion etwa das Vierfache des Produkts im Vergleich zu der 2-minütigen Verlängerungsreaktion, die die dNDPs enthielt (Abb. S1B). Diese Daten deuten darauf hin, dass die Einbaurate der Diphosphate langsamer ist als die der traditionellen Triphosphate, was angesichts der niedrigeren Grundzustandsenergie der dNDPs zu erwarten wäre. Als Nächstes stellten wir die Frage, ob ein einzelnes oder alle vier dNDPs für die langsamere Einbaurate verantwortlich sind. Für eine genaue Messung der Produktbildung wurde die quantitative PCR (qPCR) eingesetzt. Jedes Diphosphat wurde unabhängig voneinander untersucht, indem es mit 0,2 mM der anderen drei dNTPs kombiniert wurde, um eine lange DNA-Vorlage zu amplifizieren. Diese Reaktionen wurden auf eine Kontrollreaktion normiert, die 0,2 mM aller vier dNTPs enthielt (Abb. S1C). Ein Wert von 1 bedeutet, dass ein Diphosphat ebenso effizient eingebaut wird wie sein Triphosphat-Analogon. Diese Ergebnisse deuten darauf hin, dass dADP am wenigsten effizient eingebaut wird (1 mM dADP ergab ∼60 % von 0,2 mM dATP), gefolgt von Desoxythymidindiphosphat (dTDP) und Desoxycytidindiphosphat (dCDP). Andererseits ist nur eine zweifache Erhöhung der dGDP-Konzentration erforderlich, um die gleiche PCR-Effizienz wie bei der dGTP-Kontrollreaktion zu erreichen.

Um die DNA-Polymerisation direkt zu analysieren, führten wir eine Primer-Verlängerungsreaktion mit einem 32P-markierten Primer und einer langen (706 nt) Vorlage durch. Die Diphosphatkonzentration wurde von 0,1 bis 1,0 mM variiert und mit 0,2 mM der anderen drei dNTPs kombiniert, ähnlich wie bei den oben beschriebenen qPCR-Reaktionen. Wie erwartet, verringerte sich mit zunehmender dADP-Konzentration die Zeit, die erforderlich war, um ein Produkt in voller Länge zu erzeugen (Abb. 1E). Pausen entlang der Länge der Template-DNA wurden nur im Falle von dADP beobachtet, was darauf hindeutet, dass die Polymerase während des Einbaus von dADP-Substraten zum Stillstand kommt (Abb. 1E). Andererseits deutet das Fehlen von Pausen in der dTDP-Reaktion darauf hin, dass dTDP effizienter genutzt wird als dADP (Abb. S2A), wie auch die qPCR-Analyse nahelegt (Abb. S1A). Die Analyse der Produktbildung ergab, dass die zum Erreichen der halbmaximalen Rate erforderliche dADP-Konzentration ∼420 µM beträgt (Abb. S2B), was mehr als eine Größenordnung über den zuvor gemessenen KM für dNTPs (16 und 24 µM) liegt (5, 6). In der Nähe der Sättigungskonzentration von dADP wird die DNA in voller Länge in etwa 30 s synthetisiert, und angesichts der Tatsache, dass die 706-nt-Sequenz 182 Adenosine enthält, beträgt die durchschnittliche Geschwindigkeit der Nutzung von dADP mindestens ∼6 s-1. Dies ist etwa eine Größenordnung langsamer als die durchschnittliche Verwertungsgeschwindigkeit von dNTPs durch die Taq-Polymerase (kcat = 47 s-1) und liegt innerhalb des 1,5-fachen der kcat von Pfu (7).

Um die Kinetik der DNA-Synthese an langen Vorlagen aus dNDPs und dNTPs weiter zu vergleichen, verwendeten wir eine einzelsträngige DNA (ssDNA) M13mp18-Plasmidvorlage von 7.249 nt (8). Die Polymerasen Bsu (bei 37 °C), Bst und Taq (bei 60 °C) zeigten eine robuste DNA-Synthese aus dNDPs (Abb. S2C). Wir haben die Geschwindigkeit der DNA-Synthese anhand der Fluoreszenz des SYTO9-Interkalators gemessen, die von einem Echtzeit-Thermocycler bei unterschiedlichen dNDP- und dNTP-Konzentrationen beobachtet wurde (Abb. S2D) (9). Eine Darstellung dieser Raten in Abhängigkeit von der Nukleotidkonzentration ergab einen scheinbaren KM von ∼0,4 mM für dNDPs und eine maximale Syntheserate, die für dNDPs etwa 17-mal niedriger ist als für dNTPs (Abb. S2E). Diese Ergebnisse zeigen im direkten Vergleich unter identischen Bedingungen, dass die DNA-Syntheserate von dNDPs etwas mehr als eine Größenordnung niedriger ist als die von dNTPs und dass Vmax/KM daher für dNDPs etwa 400-mal niedriger ist als für dNTPs.

Eine Polymerisationsreaktion mit kanonischen Triphosphatsubstraten erhöht die Länge des naszierenden DNA-Strangs um ein Nukleotid und setzt ein PPi frei (3). Bei der umgekehrten Reaktion, der Pyrophosphorolyse, wird der Primer um ein Nukleotid verkürzt und ein dNTP freigesetzt. Wenn dNDPs als Substrate verwendet werden, setzen die Polymerasen Phosphate frei, und die Rückreaktion ist die Phosphorolyse der DNA (Abb. 2A). Um zu bestätigen, dass die Polymerasen dNDPs direkt verwenden und nicht eine bisher unbekannte enzymatische Aktivität (oder eine kopurifizierte Nukleotiddiphosphatkinase) nutzen, die zwei dNDPs in ein dNTP und ein dNMP umwandelt, verwendeten wir gereinigte dNDPs und analysierten die Produkte einer Primer-Verlängerungsreaktion. Wir haben die Produktion von Phosphat mit einem Fluoreszenzsensor gemessen, der vom bakteriellen phosphatbindenden Protein abgeleitet ist und eine hohe Spezifität für Phosphat aufweist (10). Wir stellten fest, dass in Gegenwart von gereinigten dNDPs und Taq-DNA-Polymerase Phosphat gebildet wird (Abb. 2B), in Experimenten ohne Polymerase jedoch nicht. In Kontrollexperimenten mit dNTPs wurde eine Phosphatproduktion beobachtet, die jedoch langsamer und unabhängig vom Enzym verlief, was darauf schließen lässt, dass das nachgewiesene Phosphat aus dem Abbau von dNTP zu dNDP und Phosphat resultiert und nicht mit der DNA-Synthese zusammenhängt. Diese Ergebnisse bestätigten, dass Taq direkt dNDPs als Substrate verwendet und Phosphat als Nebenprodukt der DNA-Synthese freisetzt. Als wir die Menge an Phosphat maßen, die bei Primerverlängerungen an der oben beschriebenen 7.249-nt-M13-sDNA produziert wurde, stellten wir fest, dass ∼1-11 µM Phosphat unter Verwendung einer 1,6-nM-Vorlage über der Hintergrundphosphatproduktion aus dem dNDP-Abbau produziert wurde (Abb. S3A). Diese Phosphatkonzentration entspricht ∼2-6.000 Molekülen pro DNA oder etwa 0,1-0,9 der mit dNDPs kopierten Vorlage. Die große Spanne ergibt sich aus einem relativ großen Phosphat-Hintergrund im Ausgangsmaterial und der Hintergrundreaktion, die vom Signal in der Primer-Extensionsreaktion abgezogen wird.

Um zu überprüfen, dass die Reaktionen keine dNTPs aus dNDPs produzieren, haben wir die Taq-Polymerase mit 250 µM dCDP und dTDP inkubiert und die Reaktionen durch Ionenaustauschchromatographie aufgelöst (Abb. S3B). Diese Analyse ergab keine neuen molekularen Spezies, die mono- oder triphosphorylierten Nukleotiden in der enzymhaltigen Reaktion entsprechen, verglichen mit der enzymfreien Reaktion, was auf eine fehlende Phosphoryltransferase-Aktivität in der Enzympräparation hinweist und die direkte Nutzung von dNDPs in der DNA-Synthese weiter unterstützt.

Wie oben beschrieben, setzen Reaktionen mit dNDP-Substraten ein anorganisches Phosphat (Pi) frei, und die Rückreaktion ist somit die Phosphorolyse von DNA (Abb. 2A). Um die Effizienz dieser Rückreaktion zu testen, untersuchten wir die Phosphorolyse eines 5′-32P-markierten Primers, der an einen Templatstrang gebunden war, indem wir ihn mit dem Enzym und 10 mM Pi inkubierten. Abb. 2C zeigt die Entfernung des terminalen 3′-Nukleotids vom Primerstrang durch die Taq-DNA-Polymerase in Gegenwart von Pi und PPi, was zeigt, dass die Taq-DNA-Polymerase die Rückreaktion der DNA-Polymerisation sowohl von dNTPs als auch von dNDPs durchführen kann. Die Analyse der thermophilen Bst-, Deep Vent-, KOD- (Abb. S4A), 9°N-, Tgo- und der mesophilen Bsu-Polymerasen zeigte ebenfalls eine Phosphorolyse der DNA (Abb. S4B), wenn auch in geringerem Maße. Eine Kontrollreaktion mit dem Klenow-Fragment der DNA-Polymerase I von Escherichia coli, die keine dNDPs als Substrate akzeptiert, wurde ebenfalls untersucht (Abb. S4C) und zeigte, dass die Anwesenheit von PPi, nicht aber von Pi, zu einer Verkürzung des Primers führt.

Um die Rückreaktion weiter zu analysieren, stellten wir dsDNA her, die intern mit 32P-Phosphat markiert war, indem wir eine Primerverlängerungsreaktion mit α-32P-dATP durchführten, gefolgt von einer PAGE-Reinigung. Wir analysierten die Produkte der Umkehrreaktion mittels Anionenaustausch-TLC (Polyethylenimin). Wie erwartet, führte die Inkubation der intern markierten DNA mit Taq-Polymerase und Pyrophosphat zu Produkten, die mit dATP zusammenkamen. Reaktionen in Gegenwart von Phosphat erzeugten schneller migrierende Spezies, die dADP entsprechen, und Reaktionen ohne Phosphat oder Pyrophosphat erzeugten keine migrierenden Spezies, was darauf hindeutet, dass die DNA in Gegenwart von Taq-Polymerase allein intakt blieb (Abb. 2D) und bestätigt, dass die umgekehrte Reaktion eine Phosphorolyse der DNA ist.

Schließlich ergab die Analyse der substratabhängigen Kinetik der Umkehrreaktion einen KM von ∼10 ± 5 mM (n = 9) bzw. 57 ± 5 µM (n = 5) für Phosphat und Pyrophosphat, obwohl die geringe Löslichkeit von Magnesiumphosphat oberhalb von 10 mM genaue Messungen unmöglich machte (Abb. 2E). Kristallstrukturen von DNA-Polymerasen mit Pyrophosphat oder Phosphonoameisensäure in den aktiven Zentren zeigen eine coulombische Wechselwirkung mit dem Protein (11⇓-13). Das 200-fache Verhältnis zwischen den KMs der beiden Substrate entspricht ∼15 kJ/mol (3,6 kcal/mol) bei 72 °C, eine Bindungsenergie, die in etwa einer ionischen Wechselwirkung zwischen dem zusätzlichen Phosphat und einem kompensierenden Kation auf dem Protein entspricht und ein Modell unterstützt, in dem das Phosphat/Pyrophosphat hauptsächlich durch eine Ladungswechselwirkung erkannt wird. Die Schätzungen der maximalen Raten der Umkehrreaktion folgten einem ähnlichen Trend: Unter diesen Bedingungen betrug Vmax 0,0010 ± 0,0005 s-1 bzw. 0,205 ± 0,005 s-1 für Phosphat und Pyrophosphat, was wiederum ein etwa 200-faches Verhältnis zwischen den beiden Aktivitäten erkennen lässt. Insgesamt ist die Phosphatreaktion unterhalb sättigender Konzentrationen der beiden Substrate etwa 4 × 104 mal weniger effizient, was darauf hindeutet, dass die Phosphorolyse der DNA keine signifikante Bedrohung für die Stabilität des Genoms darstellt.

Um weitere Einblicke in die DNA-Synthese aus den energiearmen Substraten (dNDPs und Pi) zu gewinnen, haben wir die Aktivierungsenergien mithilfe der Arrhenius-Analyse der Vorwärts- und Rückwärtsreaktionen gemessen. Da Einzelmolekülmessungen der Konformationsänderungen, die mit der Erkennung und dem Einbau der richtigen dNTPs verbunden sind, eine schnellere Proteinbewegung als die beobachtete Reaktionskinetik ergaben (14), ist der geschwindigkeitsbegrenzende Schritt der Vorwärtsreaktion in der Taq-Polymerase wahrscheinlich mit dem chemischen Schritt oder einer präkatalytischen Umstrukturierung der aktiven Seite verbunden, die von der Wechselwirkung mit den Substratphosphaten abhängt. Wir haben beobachtet, dass die Vmax sowohl der Vorwärts- als auch der Rückwärtsreaktion für dNDP und Phosphat niedriger ist als für dNTP und Pyrophosphat, was darauf hindeutet, dass der geschwindigkeitslimitierende Schritt empfindlich auf den Phosphorylierungszustand der Substrate reagiert. Allerdings können sowohl die präkatalytische Umlagerung (z. B. die Ausrichtung der Reste der aktiven Seite und die Bindung eines katalytischen Mg2+-Ions) als auch der chemische Schritt durch die Substratphosphorylierung beeinflusst werden; daher können beide Schritte in Gegenwart von dNDPs geschwindigkeitsbegrenzend sein, vorausgesetzt, dass sie keinen neuen langsamen Konformationsschritt in den Mechanismus einführen. In Pol β wurden für diese beiden Schritte bereits ähnliche Geschwindigkeitskonstanten vorgeschlagen (15), und die berechneten Aktivierungsenergien für die Vorwärts- und Rückwärtsreaktionen unter Verwendung der hochenergetischen Substrate (dNTPs und Pyrophosphat) unterscheiden sich um nur 15 kJ/mol (4). Im Falle der thermophilen Enzyme Taq und Klentaq1 variiert die Aktivierungsenergie der Vorwärtsreaktion stark und liegt zwischen 90 und 125 kJ/mol, abhängig von den experimentellen Bedingungen und wahrscheinlich der Identität der reagierenden Nukleotide (8, 16), während die Aktivierungsenergie der Pyrophosphorolyse unseres Wissens nach nicht experimentell bestimmt wurde.

Wir analysierten die Einbauraten von 50 µM dCDP, dADP und dTDP, die während der Primer-Extensionsreaktion auf dA, dC bzw. dA gestapelt wurden. Die Arrhenius-Analyse zeigte eine lineare Abhängigkeit von ln(kobs) von 1/T für Experimente unter 60 °C und ergab Aktivierungsenergien von 85 ± 14, 108 ± 11 und 112 ± 15 kJ/mol für die drei Nukleotide (Abb. 3 A und B; n = 6 für jedes Nukleotid). Die Arrhenius-Analyse der umgekehrten Reaktion mit 0,4 mM Phosphat, bei der ein Molekül dADP entsteht, ergab eine hohe Aktivierungsenergie von 138 ± 10 kJ/mol (n = 5), die mit der beobachteten langsamen Geschwindigkeit der DNA-Phosphorolyse durch Taq (Abb. 3 A und B) übereinstimmt und einen deutlichen Anstieg gegenüber der berechneten Aktivierungsenergie der Pyrophosphorolyse (92 kJ/mol in Pol β) darstellt (4). Die Aktivierungsenergie der Vorwärts- und Rückwärtsreaktion für dADP unterscheidet sich also um ∼30 kJ/mol, was eine starke Tendenz zur DNA-Synthese bedeutet. Dieser Vorteil für die Vorwärtsreaktion führt zu einer geringeren Anforderung an die Sequestrierung des Phosphatprodukts durch einen nachgeschalteten Stoffwechselweg, im Gegensatz zur dNTP-basierten DNA-Synthese und Pyrophosphat-Hydrolyse durch anorganische Pyrophosphatasen. Wenn die präkatalytischen Konformationsänderungen in der Taq-Polymerase durch die niederenergetischen Substrate nicht beeinträchtigt werden und der chemische Schritt ratenlimitierend ist, könnte die Verwendung von dNDPs und Phosphaten neue experimentelle Erkenntnisse über die enzymatische Katalyse der DNA-Synthese liefern.

Unsere Studie zeigt, dass Taq und mehrere andere Enzyme der A- und B-Familie von DNA-Polymerasen, einschließlich replikativer Enzyme thermophiler und mesophiler Bakterien, die kanonischen Triphosphat-Substrate durch Diphosphat-Analoga ersetzen können. Erste Hinweise auf die Entbehrlichkeit des γ-Phosphats im Nukleotidsubstrat ergaben sich aus Untersuchungen der reversen Transkriptase von HIV-1 und der DNA-Polymerase gp43 des Bakteriophagen RB69. HIV-1-RT-Varianten, die die elektrostatische Wechselwirkung zwischen dem γ-Phosphat des ankommenden dNTP und der Polymerase aufheben, führten zur Beibehaltung der Aktivität, wenn auch mit einer viel langsameren Rate (17⇓-19), und die Bakteriophagen-RB69-DNA-Polymerase gp43 zeigte eine ähnliche Aktivität (20). Beide viralen Enzyme akzeptieren dNDPs als Substrate, aber mit KM (oder KD), die 500 und 17 mal höher sind, und mit Geschwindigkeitskonstanten, die 100 und 400 mal niedriger sind als für dNTPs durch die HIV-1 RT und RB69 gp43 (20, 21). Unsere Studie zeigt, dass zelluläre Replikationspolymerasen diese Aktivität besitzen, beschreibt die Substrataffinitäten und Aktivierungsenergien sowohl für Vorwärts- als auch für Rückwärtsreaktionen und impliziert, dass die DNA-Synthese aus dNDPs einigermaßen effizient ist, insbesondere für die thermostabilen Enzyme.

Unsere Ergebnisse legen nahe, dass die DNA-Replikation mit dNDPs als Substraten durchgeführt werden kann. In thermophilen Organismen reagiert die Genomreplikation möglicherweise weniger empfindlich auf die Energieladung der Zelle als in mesophilen Organismen, da thermostabile Polymerasen sowohl diphosphorylierte als auch triphosphorylierte Substrate akzeptieren können. Die DNA-Replikation wird somit weniger durch das intrazelluläre ATP/ADP-Verhältnis beeinträchtigt, und die relativ hohe Effizienz, mit der DNA bei erhöhten Temperaturen synthetisiert wird, lässt vermuten, dass Thermophile in der Lage sein könnten, auf triphosphorylierte Substrate vollständig zu verzichten. Außerdem deuten paläobiologische Beweise darauf hin, dass der letzte gemeinsame Vorfahre unserer Biosphäre ein Thermophiler war (22⇓-24), und unsere Studie deutet darauf hin, dass die disphosphorylierten Substrate für die Genomreplikation früher Organismen ausgereicht haben könnten, so dass der Stoffwechsel der energiereichen triphosphorylierten Stoffwechselzwischenprodukte nicht mehr erforderlich war. In diesem Fall könnten die Diphosphate als Zwischenprodukte in der Evolution der energiereichen Metaboliten betrachtet werden und die Vorläuferbausteine der frühen Genome wie Ribonukleotide oder einfachere Nukleinsäuren enthalten.

Die DNA-Polymerase spielt in zahlreichen Biotechnologien eine wichtige Rolle. Die Verwendung von Diphosphat-Substraten, über die hier berichtet wird, hat das Potenzial, die Einbindung teurer Analoga, wie isotopisch markierte oder chemisch modifizierte Nukleotide, praktisch zu machen, wodurch die Notwendigkeit anspruchsvoller Triphosphat-Synthesen entfällt. Diese Eigenschaft der DNA-Polymerasen könnte auch eine Methode zum Nachweis von Nukleotiden bieten, die bei der DNA-Sequenzierung mit hohem Durchsatz verwendet werden. Zwei gängige Methoden weisen die mit der Primerverlängerung verbundene PPi-Abgangsgruppe nach, entweder durch einen sekundären Chemilumineszenztest oder durch Überwachung einer Änderung des lokalen pH-Werts (25, 26). Die Verwendung eines dNDP-Substrats liefert Pi und bietet damit eine zusätzliche Möglichkeit, zwischen eingebauten Nukleotiden zu unterscheiden. Dieses erweiterte Verständnis der Fähigkeiten der DNA-Polymerase legt auch nahe, dass die Untersuchung anderer Triphosphat-abhängiger Enzyme die Toleranz gegenüber energieärmeren, leichter zugänglichen Diphosphat-Substraten als evolutionäre Zwischenprodukte aufzeigen könnte.