PMC

Den nylige leder af Dayan og Wraith i dette tidsskrift fremhævede udfordringerne for udvikling af nye immunterapier efter det katastrofale forsøg med TGN1412. Denne oversigt præsenterer noget af den viden, der er opnået fra mange kliniske forsøg med anti-D, som kan være relevant for translationel immunologi.

Forebyggelse af hydrops fetalis eller Rhesus hæmolytisk sygdom hos fostre og nyfødte (HDFN) ved profylaktisk anti-D er den mest vellykkede kliniske anvendelse af antistofmedieret immunosuppression. HDFN opstår, efter at en D-negativ kvinde er blevet immuniseret mod føtale D-positive røde blodlegemer efter en fostermaternal blødning (FMH); det producerede IgG anti-D overføres over placenta og forårsager ødelæggelse af føtale røde blodlegemer af miltære makrofager. I 1940’erne, da årsagen til denne sygdom først blev anerkendt, blev 1 % af babyer født med HDFN, og 40 % af dem døde. Anti-D er det mest almindelige antistof, der er involveret. RhD-polypeptidet på de røde blodlegemer er det mest immunogene af blodgruppeantigenerne, da det ikke findes i cellerne hos D-negative personer, som mangler RHD-genet .

HDFN er nu sjældent, delvis på grund af forbedret foster- og neonatalpleje, men hovedsagelig på grund af forebyggelse af primær immunisering af modtagelige D-negative kvinder med profylaktisk IgG anti-D . Siden 1968 er der efter vellykkede kliniske forsøg i Det Forenede Kongerige og USA blevet givet anti-D til 10 % af alle kvinder postnatalt, hvilket har medført en reduktion af sygdomsforekomsten på ca. 95 %. Der er nu færre end 30 perinatale dødsfald om året, der skyldes HDFN. I 2002 anbefalede National Institute of Health and Clinical Excellence (NICE), at der rutinemæssigt gives anti-D-profylakse før fødslen til alle D-negative kvinder, ud over postnatal profylakse, for at reducere immuniseringsraten yderligere. Intravenøs (IV) anti-D anvendes nu også terapeutisk til behandling af nogle D-positive patienter med immuntrombocytopenisk purpura (ITP) . Efterspørgslen efter anti-D er således stigende.

Anti-D-immunoglobulin fremstilles af puljet hyperimmun plasma fra mennesker. I mange år har spørgsmål om virologisk sikkerhed og for nylig om variant Creutzfeldt-Jakobs sygdom (vCJD) stimuleret søgningen efter alternative leverancer. I Det Forenede Kongerige kommer plasma til fraktionering nu fra nordamerikanske donorer, fordi man er bekymret for, at britiske donorer er latente bærere af vCJD. Med det formål at erstatte polyklonalt anti-D fremstillet af humant plasma med bioteknologiske versioner til både diagnostisk og klinisk brug er der blevet fremstillet hundredvis af monoklonale (mAb) eller rekombinante (rAb) anti-D-antistoffer. De er alle afledt af humane immunglobulingener eller B-celler, fordi mus ikke genkender RhD-antigenet. Der er blevet anvendt forskellige ekspressionssystemer, herunder humane B-cellelinjer, kinesiske hamster-ovarieceller (CHO-celler), heterohybridomer fra mus og mennesker og myelomer fra rotter.

Og selv om den nøjagtige mekanisme til undertrykkelse af D-immunisering ved indgivelse af passiv IgG anti-D endnu ikke er klarlagt , er det kendt, at D-positive røde blodlegemer hurtigt fjernes til milten af makrofager via IgG Fc-receptor (FcγR)-interaktioner og gøres ikke-immunogene. For at sikre, at profylaktisk anti-D sandsynligvis vil være effektivt til at forhindre D-immunisering til en stor FMH, testes kvinderne 2-3 dage senere for at kontrollere, at fostercellerne er clearet fra cirkulationen . Ellers har allogene røde blodlegemer en lang overlevelsestid efter FMH eller transfusion. Alloimmune reaktioner er langsomme at udvikle, typisk 5-15 uger for anti-D . Dette skyldes sandsynligvis, at de mangler faresignaler (fra fremmede molekyler), således at de ikke genkendes af immunsystemet, før de bliver senescente, hvilket så stimulerer deres fagocytose via phosphatidylserinreceptorer . Uden RhD-profylakse bliver ca. 17 % af D-negative kvinder immuniseret efter graviditet med et D-positivt foster . Denne incidens er lavere end for bevidst immuniserede normale personer (op til ca. 85 % reagerer ), fordi for de fleste kvinder er mængderne af FMH for små til, at de røde blodlegemer kan være immunogene . Gravide kvinder kan give robuste alloimmunresponser og samtidig tolerere deres semi-allogene foster.

I løbet af de sidste 20 år er 19 anti-D mAbs og rAbs blevet afprøvet i 15 first-in-man-undersøgelser. Disse blev for nylig gennemgået og er sammenfattet her. Der opstod ingen alvorlige bivirkninger. Biologiske in vitro-analyser af FcγR-medieret fagocytose og hæmolyse ved hjælp af humane effektorceller er veletablerede og blev anvendt til screening. I de kliniske forsøg blev antistoffernes evne til at fjerne små mængder (mindre end 1 %) af D-positive røde blodlegemer fra cirkulationen vurderet, og i nogle undersøgelser blev anti-D’s evne til at forhindre D-immunisering derefter også bestemt. Mange af mAbs og rAbs blev direkte sammenlignet med polyklonalt anti-D.

Der blev observeret stor heterogenitet i antistoffernes effektivitet (tabel 1). To mAbs afledt af humane B-lymphoblastoide cellelinjer, BRAD-3 og BRAD-5, formidlede hurtig rødcelleclearing og forhindrede D-immunisering næsten lige så effektivt som polyklonal anti-D, selv om der blev anvendt en tre- til firedobbelt så høj dosis . Plasmahalveringstiden for BRAD-3 og BRAD-5 var normal, men biotilgængeligheden var halvt så stor som for polyklonal anti-D . Da disse antistoffer blev udtrykt som rAbs i CHO-celler, var clearance af autologe D-positive røde blodlegemer langsommere end de oprindelige mAbs . En stor undersøgelse med et andet CHO-afledt anti-D rAb, MonoRho, gav skuffende resultater, idet clearance af røde blodlegemer var ekstremt varierende, normalt meget langsom og uden korrelation til anti-D-dosis . Den meget lave biotilgængelighed af MonoRho kan delvis forklare dette. Forsøgspersonerne producerede imidlertid ikke anti-D, selv om de ikke fik udfordringsinjektioner med D-positive røde blodlegemer for at bestemme deres D-immuniseringsstatus . MAbs produceret af murine myelomcellelinjer (som mus-human heterohybridomer) viste også stor variabilitet i rødcelleclearance, men uventet blev over halvdelen af modtagerne hurtigt D-immuniseret , dobbelt så mange som ville forekomme med røde blodlegemer alene . Disse anti-D’er havde således en adjuverende virkning, idet de forstærkede immunresponset på D-positive røde blodlegemer i stedet for at forhindre det som tilsigtet. Senere undersøgelser med anti-D rAbs produceret af myelomceller fra rotter viste, at de fremmer en ekstremt hurtig clearance af autologe røde blodlegemer, hurtigere end polyklonale anti-D . Effekten af at ændre den cellelinje, der udtrykker FOG-1, fra mus til rotte var slående, idet clearingen ændrede sig fra meget langsom og ufuldstændig til meget hurtig. I sidstnævnte undersøgelse var dette forbundet med hæmolyse, en vis clearance til leveren og febrile reaktioner . Disse reaktioner forekommer ikke efter profylakse med polyklonalt anti-D. Uventetvis formidlede mutanter af FOG-1 rAb, som manglede FcγR-interaktioner in vitro, også hurtig clearance af røde blodlegemer, selv om man havde forventet normal overlevelse . Disse IgG anti-D må have bundet sig til andre receptorer end IgG FcγR.

Mange af anti-D mAbs og rAbs opførte sig ikke som polyklonalt anti-D. Ingen var helt så effektive, og nogle fra gnavercellelinjer resulterede endda i uønskede immunresponser. In vivo-responserne var hovedsagelig bestemt af den art af cellelinje, der producerede antistofferne, og ikke af proteinsekvenserne. Årsagen til disse uventede og muligvis skadelige reaktioner kan være, at IgG anti-D produceret fra dyreceller interagerede med komponenter af det medfødte immunsystem. Den mest sandsynlige forklaring er variation i deres oligosaccharidsammensætning.

Glykosyleringstypen af IgG afhænger af den celle, hvori den er produceret, og er artsspecifik. Strukturer som N-glycolyl neuraminsyre og oligosakkarider med højt mannoseindhold på IgG fra gnavere kan blive genkendt som fremmedlegemer af medfødte immune mønstergenkendelsesreceptorer (PRRs) med efterfølgende proinflammatoriske reaktioner til følge. PRR’erne omfatter cellulære asialoglycoprotein- og mannosereceptorer. Efter at have bundet anti-D på D-positive røde blodlegemer kan de have stimuleret antistofresponser mod D-antigenet. I plasma kan mannanbindende lektin forårsage komplementmedieret hæmolyse, når det er bundet til mannoseresterne i anti-D på en rødcelle. Endogene IgG-antistoffer, der genkender galactose-α1,3-galactose på murin IgG, kan binde anti-D, der udtrykker dette oligosaccharid. For nylig har endogene IgE-anti-galactose-α1,3-galactose forårsaget overfølsomhedsreaktioner hos nogle patienter, der har fået cetuximab (et immunoterapeutisk kræftmiddel) produceret i musemyelom SP2/0-celler . Manglende sialinsyre på mange anti-D mAbs og rAbs ville gøre IgG’en proinflammatorisk ved binding af FcγR .

Polyklonalt anti-D kan være enten gavnligt eller dødeligt i forskellige kliniske situationer. Dosis af mål-erytrocytter er en vigtig faktor. Clearance af små mængder af røde blodlegemer, som i FMH, er en “stille”, ikke-inflammatorisk, ikke-hæmolytisk proces. Hvis en D-positiv person imidlertid får store doser anti-D, som f.eks. hos et foster med RhD-hæmolytisk sygdom eller, sjældent, hos ITP-patienter, der behandles med IV anti-D, kan der opstå alvorlig hæmolyse. I disse lejlighedsvis dødelige tilfælde er de yderligere symptomer normalt hydrops (ødem) hos HDFN og akut hæmoglobinæmi, hæmoglobinuri og dissemineret intravaskulær koagulation hos ITP-patienter . De fleste tilfælde af akut hæmolyse blev anset for at skyldes en kraftig ekstravaskulær hæmolyse (makrofagmedieret) snarere end intravaskulær hæmolyse . Selv i fravær af sådanne alvorlige bivirkninger oplever ITP-patienter ikke sjældent feber og kulderystelser efter infusion af IV anti-D , som er tegn på inflammatoriske reaktioner. Hvis ITP-patienter således blev behandlet med proinflammatoriske anti-D mAbs eller rAbs i stedet for det nuværende polyklonale anti-D, kunne der opstå en kompleks række utilsigtede og potentielt farlige reaktioner.

I kølvandet på TGN1412 fase 1-undersøgelsen kan nogle aspekter af de kliniske forsøg med anti-D være nyttige for den fremtidige udvikling og regulering af first-in-man-undersøgelser af andre immunoterapeutika , især dem, der er rettet mod celler i blodet (tabel 2). Valg af startdosis er særlig vigtigt. Der blev anvendt lave doser af røde blodlegemer og anti-D i alle forsøg på mennesker . I nogle undersøgelser, f.eks. for BRAD-3 , blev autologe røde blodlegemer (0-5 ml) belagt med anti-D ex vivo og derefter vasket og injiceret, hvorved antistofdosis blev minimeret og muligheden for bivirkninger mindsket. Clearance af sådanne små mængder af røde blodlegemer kunne følges nøjagtigt, når de var isotopmærket. Da dette antistof viste sig at være sikkert og effektivt, blev anti-D og røde blodlegemer injiceret separat for bedre at kunne simulere den kliniske situation. Bevis for inflammatoriske reaktioner med lave doser af anti-D og røde blodlegemer bør sikre forsigtighed i opskaleringsundersøgelser.

I konklusion, de omfattende data fra humanstudier af anti-D mAbs og rAbs tyder på, at deres glykosylering kan have haft en kraftig effekt ved at modulere deres in vivo aktiviteter. Nogle rAbs øgede snarere end mindskede forekomsten af D-immunisering, en forårsagede skadelige hæmolytiske reaktioner, og en havde en ekstremt lav biotilgængelighed. Disse virkninger var ikke forudset ud fra de gennemførte in vitro-undersøgelser. I fremtiden bør man ved udvikling af rekombinante glykoproteiner til human terapi tage hensyn til muligheden for, at der kan opstå interaktioner mellem ikke-humane oligosakkarider og andre celler eller molekyler end den tilsigtede ligand.